PLoS ONE: β, β-Dimethylacrylshikonin Skatina Mitochondrijos Priklausoma Apoptozę per ERK eigos Žmogaus skrandžio vėžio SGC-7901 Cells

Anotacija

β, β-Dimethylacrylshikonin, vienas iš aktyvių komponentų šaknų ekstraktų Lithospermum erythrorhizon, posses priešnavikinis aktyvumas. Šiame tyrime, aptarėme molekulinius mechanizmus beta, beta-dimethylacrylshikonin į SGC-7901 ląstelių apoptozę. β, β-Dimethylacrylshikonin sumažino ląstelių gyvybingumą SGC-7901 ląstelių nuo dozės ir laiko priklausomu būdu ir sukeliama ląstelių apoptozę. β, β-Dimethylacrylshikonin gydymas SGC-7901 ląstelių žemyn sureguliavo XIAP, CIAP-2, ir BCL-2 ir up-sureguliavo Bak ir Bax išraiškos išraišką ir sukelia mitochondrijų membranos potencialo ir išleidimo citochromo c nuostolių , Be to, β, β-dimethylacrylshikonin gydymas buvo aktyvavimo kaspazių-9, 8 ir 3, ir atskėlimo, poli (ADP-ribozė) polimerazę (PARP), kuris buvo panaikinta apdirbant su visos kaspazė inhibitoriaus Z-VAD-fmk , β, β-Dimethylacrylshikonin sukeltas fosforilinimo tarpląstelinio signalo reguliuojamas kinazės (ERK) į SGC-7901 ląstelių. U0126, specifinis MEK inhibitorius, blokavo ERK aktyvinimas beta, beta-dimethylacrylshikonin ir panaikinta beta, beta-dimethylacrylshikonin indukuotų apoptozės. Mūsų rezultatai parodė, kad β, β-dimethylacrylshikonin slopinamas augimas skrandžio vėžio SGC-7901 ląstelių skatinančius ERK signalinio kelio ir jei clue už Ikiklinikinių ir klinikinių vertinimo beta, β-dimethylacrylshikonin skrandžio vėžio gydymo.

citavimo: Shen XJ Wang HB Ma XQ Chen JH (2012) β, β-Dimethylacrylshikonin skatina Mitochondrijos Priklausoma Apoptozę per ERK eigos žmogaus skrandžio vėžys SGC-7901 ląstelių. PLoS vieną iš 7 (7): e41773. Doi: 10,1371 /journal.pone.0041773

redaktorius Salvatore V. Pizzo, Duke universiteto medicinos centras, Jungtinės Amerikos Valstijos

Gauta kovo 1, 2012 m Priėmė: Gegužės 25, 2012 m Paskelbta: Lie 27, 2012

Visos teisės saugomos: © Shen et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė dotacijas iš Zhejiang provincijos gamtos mokslo fondo Kinijos X-QM (LY12H28005) ir mokslo fondo Zhejiang Kinijos medicinos universiteto H-BW (2011ZY05). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra viena iš agresyvių piktybiniais navikais, nors su radioterapija, chemoterapija ir bioterapii plėtros sunkus šalutinis poveikis yra neišvengiama [1], todėl efektyvesnių priešvėžiniai vaistai su mažiau šalutinių poveikių, skirtų gydymui skrandžio vėžys yra reikalinga.

Lithospermum erythrorhizon yra svarbi Kinijos žolė. Ji turi tam tikrų aktyvių komponentų: Deoxyshikonin, Isobutyrylshikonin, Acetylshikonin, Isovalerylshikonin, β, β-Dimethylaerylshikonin (pav. 1a) ir shikonin [2]. Tradicinėje kinų medicinoje, juose daug biologinių funkcijų, įskaitant antimikrobinės, priešuždegiminis, priešnavikinis, imuninės reguliavimo ir kovos su ŽIV savybių [3] - [6]. Priešnavikinis poveikis shikonin ir jo dariniai, buvo pirmą kartą įrodė savo veiklą nuo naviko augimą pelių sarkoma-180 [7]. Shikonin eksponatų poveikis ne tik tiesiogiai nužudyti vėžinių ląstelių, bet taip pat slopina naviko angiogenezę [8]. Tyrimai parodė, kad shikonin sukeltas apoptozę žmogaus piktybinės melanomos, šlapimo pūslės vėžio, gimdos kaklelio vėžio, plaučių vėžio ir kepenų vėžio, ir taip toliau [9] - [13]. Tačiau ji turi mažiau šalutinių poveikių ir daugiau apsauginį poveikį žmogaus normalios ląstelės [14], [15]. Hsu kompiuterio ir kt parodė, kad shikonin atvedė į mobiliuosius apoptozę per up-reguliavimo p27, p53, Bax ir žemyn reguliavimo BCL-2 ir BCL-XL žmogaus storosios žarnos karcinoma COLO 205 ląstelių [16]. Navikas invazija slopinamas shikonin kai vėžinių ląstelių gali per apačią reguliavimo NF-κB sąlygojamą MMP-9 raiškos [17]. Shikonin taip pat indukuoja apoptozę per ROS gamybos kepenų ląstelių karcinoma [12]. Singhas F ir kt taip pat nustatė, kad Shikonin sumažėjo fosforilintus lygius EGFR, ERK ir baltymų tirozinkinazių ir padidėjo ląstelėje lygius apoptozės susijusių baltymų, kuris sukėlė plokščialąstelinis vėžys ląstelės atlikti apoptozę [18].

Naujausiais duomenimis parodė, kad β, β-dimethylacrylshikonin turėjo reikšmingą Priešnavikinio poveikį kepenų ląstelių karcinoma aktyvuojant kaspaze 3 [19]. Tačiau toks poveikis beta, beta dimethylacrylshikonin žmogaus skrandžio vėžio ląstelių nebuvo pranešta ir molekuliniai mechanizmai dar nėra gerai suprantama. Taigi, šiame tyrime, aptarsime poveikį beta, beta-dimethylacrylshikonin dėl žmogaus skrandžio vėžio ląstelių SGC-7901 ir su juo susijusio signalizacijos geriau suprasti beta, β-dimethylacrylshikonin skrandžio vėžio mechanizmą.

medžiagos ir metodai

medžiagos ir reagentai

SGC-7901 ląstelės buvo įsigytos iš Kinijos mokslų akademijos Mobilusis bankas tipas kultūros kolekcija (Šanchajus, Kinija). β, β-Dimethylacrylshikonin buvo įsigytas iš Tokijo Chemijos pramonė (Tokijas, Japonija). MTT ir DAPI buvo įsigytas iš CalBiochem (San Diegas, CA, JAV). U0126 pirktas iš ląstelių signalizacijos (Bostonas, MA, JAV). Visos kaspazės inhibitorius (Z VAD-FMK) buvo įsigytas iš Beyotime Biotechnologijos institutas (Šanchajus, Kinija). Antikūnų citochromo c pirkta iš Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, JAV). Antikūnai prieš ERK, fosfo-ERK, BCL-2, BCL-XL, XIAP, CIAP-2, survivn, Bax, Bak, suskaldyti kaspazės-9, suskaldyti kaspazės-3, suskaldyti PARP ir beta-aktino buvo įsigytas iš ląstelių signalizacijos ( Bostonas, MA, JAV). FITC aneksinu Apoptozę nustatymo rinkinys buvo įsigytas iš Becton Dickinson (San Diegas, CA, JAV).

Mobilusis kultūra ir ląstelių proliferacija tyrimas

SGC-7901 ląstelės buvo auginamos RPMI 1640 terpė su 10% vaisiaus jaučio serumo (Hyclone, UT), ir palaikoma 37 ° C temperatūroje drėgnoje atmosferoje 5% CO _{2. Tada ląstelės buvo pasėjamos į 96 šulinėlių indą, kad galutinė koncentracija 5 × 10 ^{3 ląstelių /gerai ir inkubuojamos RPMI 1640 terpėje, turinčioje 10% FCS 24 h, po to, ląstelės buvo gydomi nurodytą koncentracijos β, β-dimethylacrylshikonin 24 h ir 48 h. Vidutinės buvo pašalintas ir švieži vidutinės buvo įtraukta į kiekvieną šulinėlį kartu su 20 pL MTT tirpalą (5 mg /ml). Po to, kai 4 h inkubacijos, 150 pL DMSO buvo įtraukta į kiekvieną šulinėlį. Lėkštelės buvo skaityti bangos 570 nm, naudojant Varioskan Flash daugiamodės Reader (Thermo Scientific, JAV). Keturi Reduplicēt šuliniai buvo naudojami kiekvienoje gydymo ir eksperimentai buvo kartojamas tris kartus.}}

morfologiniai pokyčiai

SGC-7901 ląstelės buvo dedamas į šešių pat plokštelės duobutę. Po 24 h ląstelių kultūros, jie buvo gydomi beta, beta dimethylacrylshikonin už nurodytiems laikotarpiams. Korinis morfologija buvo stebimas naudojant apversto mikroskopu. (Modelis IX70; Olympus, Tokijas, Japonija)

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo) dažymo

SGC-7901 ląsteles buvo dedamas į šešių šulinėlių plokštelės šulinėlį. Po to, kai 24 h ląstelių kultūroje, jie buvo gydomi atomo, pažymėto beta-dimethylacrylshikonin pagal juose nurodytą laikotarpius, tada ląstelės buvo nustatyti šaltame acetono 30 min, ir inkubuojami su DAPI (1 mg /ml) 30 min. Apoptozės branduoliai apibūdinamas kaip intensyviai tamsintas buvo aptikta naudojant fluorescencinės mikroskopijos. (Modelis IX71; Olympus, Tokijas, Japonija)

aneksinu /PI tyrimų dėl apoptozė

aneksinu /PI bandymo rezultatais, ląstelės buvo tamsintas su AnnexinV-FITC ir PI, ir vertinti apoptozės tėkmės citometrijos atsižvelgiant į mannufacturer protokole (BD Pharmingen, San Diego, CA, JAV). Trumpai, 1 × 10 ^{5 ląstelės buvo plaunama du kartus PBS, ir nudažomi su 5 pL AnnexinV-FITC ir 5 pL PI 500 pL rišikliais buferio 15 min kambario temperatūroje, tamsoje. Apoptozės ląstelės buvo nustatoma naudojant BD FACS Diva programinę įrangą ( "BD biomokslų Franklin ežerų NJ). Aneksinu dažymo tarnauja kaip fosfatidilserinas išorės ir ląstelių priemonei, kuri yra aneksinu + /PI -. Atstovauti anksti apoptozinių ląsteles}

Matavimas mitochondrijų membranos potencialų

Ląstelės ( 5 × 10 ^{5 ląstelių /ml) buvo gydyti arba be beta, β-dimethylacrylshikonin (10 mkmol /l) 24 h ir tamsintas su JC-1 (BD MitoScreen JC-1 Kit "Becton Dickinson, JAV) 15 min, esant 37 ° C temperatūroje. Mitochondrijų membrana potencialas buvo aptiktas tėkmės citometrijos (FACSCanto II "Becton Dickinson, JAV).}

Vakarų Bloting analizė

Ląstelės buvo gydomi nurodytą koncentraciją beta, beta-dimethylacrylshikonin už nustatytu laiku į RPMI 1640 terpė su 10% FCS. Ląstelės buvo renkami ledinio PBS ir ląstelių ekstraktai buvo parengtos Ripa buferis su proteinazės inhibitorius kokteilis iš CalBiochem (San Diego, CA). Sudėtyje esantis baltymų koncentracijos ląstelių lizato buvo nustatomas ir virti su gelio-pakrovimo buferyje 10 min, esant 100 ° C temperatūroje. Mėginiai, kurių sudėtyje yra 30 mikrogramų nuo bendros baltymų buvo atliekama elektroforezė dėl 10% SDS-poliakrilamido gelyje ir perkelti į PVDF membrana (Millipore ", Temecula, CA). Taip yra perduodamos, jų membrana buvo užblokuotas TBST (TBS, kurių sudėtyje yra 0,1% Tween 20), kuriame yra 5% nugriebto pieno 2 h, o po to inkubacijos per naktį 4 ° C su atitinkamais pirminių antikūnų. Po plovimo tris kartus TBST, membranos buvo inkubuojami 2 h, esant 37 ° C su 1:5000 krienų peroksidazės-konjuguoto atitinkamų antrinių antikūnų. Galiausiai, membranos buvo ryškinamos naudojant sustiprintas chemiluminescencja aptikimo sistemą (Immun-Star WesternC KIT, Bio-Rad, JAV).

imunofluorescenciniam

Immunofluorescene dažymo buvo naudojamas analizuoti pavienių ląstelių tyri- mas pasiskirstymą citochromo c SGC-7901 ląstelių, kurias sukelia beta, beta dimethylacrylshikonin. Ląstelės auginamos ant sterilių stiklo coverlips buvo nustatyti šaltame acetono 10 min. Po to, kai laidžiomis su 0,3% Triton X-100, 20 min kambario temperatūroje, ląstelės buvo užblokuotas 3% jaučio serumo albuminas, 30 min serumo ir inkubuojami per naktį 4 ° C su anti-citochromo c antikūno (1:30). Triskart nuplovus PBS, SGC-7901 ląstelės buvo paženklinti Alexa Fluor 488 konjuguoto antrinio antikūno. DAPI vėliau buvo įtraukta branduolinės dažymo. Mikroskopinis tyrimas buvo atliktas naudojant fluorescencinės mikroskopijos (modelis IX71; Olympus, Tokijas, Japonija).

Statistinė analizė

pranešami duomenys yra vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD) trijų nepriklausomų eksperimentų. Jie vertino vieną pusę dispersinė analizė (ANOVA). buvo įkurta reikšmingi skirtumai p. < 0,05

Rezultatai

β, β-Dimethylacrylshikonin slopina gyvybingumą SGC-7901 ląstelių

Siekiant nustatyti citotoksinis poveikis beta, β-dimethylacrylshikonin skrandžio vėžio ląsteles. SGC-7901 ląstelės buvo gydomi 2,5, 5, 7,5, 10 mikromoliai /l beta, beta-dimethylacrylshikonin 24 h ir 48 h, sumažinto pajėgumo ląstelių gydomiems beta, beta-dimethylacrylshikonin atitinkamai buvo 92,41 ± 6,06%, 76,49 ± 3.18%, 67.19 ± 1.82%, ir 61.76 ± 0,18% atitinkamai po 24 h, palyginti su transporto priemonės-paveiktų ląstelių (1b pav.). Už 48 h, ląstelių populiacijos gyvybingumą turėjo 52.03 ± 9.45%, 38.99 ± 1.43%, 30.70 ± 1.58%, ir 27,4 ± 0,31% (1B pav.). Pusė maksimalus slopinanti koncentracija (SSD _{50) beta, β-dimethylacrylshikonin už SGC-7901 ląstelių buvo 11.04 m ir po 24 h 2,89 m ir 48 val atitinkamai.}

β, β-Dimethylacrylshikonin skatina SGC -7901 ląstelių apoptozė

SGC-7901 ląstelės pirmiausia buvo gydomi beta, beta-dimethylacrylshikonin, rezultatai parodė, ląstelės išgyveno pažymėti morfologinių pokyčių gydant su 10 mikromoliai /L beta, beta-dimethylacrylshikonin palyginti su negydyta valdymo 24 val. Jei beta akivaizdoje, β-dimethylacrylshikonin, SGC-7901 ląstelių skaičius sumažėjo ir ląstelės tapo suapvalinti ir mažos formos, ir atjungiamas nuo plokštės, palyginti su neigiamu kontroliniu grupės (pav. 2A). β, β-dimethylacrylshikonin taip pat sukeltą branduolinę kondensacijos su intensyvaus DAPI dažymo, palyginti su kontrolės SGC-7901 ląstelių branduolinių 24 h (pav. 2b).

Norėdami nustatyti, ar cytotoxity beta, β-dimethylacrylshikonin dalyvauja apoptozės mes įvertino apoptozės poveikį beta, beta dimethylacrylshikonin į SGC-7901 ląstelių tėkmės citometrijos už aneksinu ir propidiumo jodido (PI) dėmių. Iš ankstyvųjų apoptozinių ląstelių (aneksinu ^{+ /PI -) procentas buvo 1,6%, 7,2%, 18,1%, 24,3%, o 24,4% reaguojant į transporto priemonės, 2,5, 5, 7,5 ir 10 mkmol /L β, β-dimethylacrylshikonin atitinkamai 24 h (pav. 2C). Įdomu tai, kad vėlai Apoptozinės ląstelių (aneksinu + /PI +), buvo gerokai padidėjo SGC-7901 ląstelių (29,7% 7,5 mkmol /l ir 33,6% su 10 mikromoliai /L beta, β-dimethylacrylshikonin gydymo ) (2C pav.).}

β, β-dimethylacrylshikonin skatina mitochondrinio įvykius, susijusius su apoptozės į SGC-7901 ląstelių

BCL-2 šeimos baltymai yra proapoptotinį baltymų (BAX, Baku ir Perka) ir anti-Apoptozinės baltymai (BCL-2, BCL-XL, CIAP-2, XIAP ir survivin). Jie gali aktyvuoti arba slopinti tolesnių veiksnių spaudai, kuris veda į kaspazės-3 ir PARP aktyvacijos apoptozės [20] vykdymo. Siekiant nustatyti apoptozę susijusių baltymų, proapoptotinių baltymai (BAX, Baku) ir anti-apoptozinių baltymus (XIAP, CIAP-2, BCL-2, BCL-XL, survivin) buvo aptikta imunoblotingo po SGC-7901 ląstelės buvo gydomi skirtingų koncentracijos atomo, pažymėto beta-dimethylacrylshikonin (0, 2,5, 5, 7,5, ir 10 mikromoliai /L) 24 h. Rezultatai parodė, kad β, β-dimethylacrylshikonin sumažinti XIAP išraiška, CIAP-2, Bcl-2 (3A pav.). Tačiau žemyn reguliavimas XIAP ir BCL-2 buvo silpnesni, o žemyn reguliavimas CIAP-2 buvo gana dramatiškas ir priklauso nuo dozės. Nebuvo BCL-XL jokių reikšmingų pokyčių ir survivn į SGC-7901 ląstelių. Taip pat buvo tiriama, ar beta, β-dimethylacrylshikonin gali moduliuoti proapoptozinis baltymų (BAX, Bak) išraiška. Mes nustatėme, kad β, β-dimethylacrylshikonin padidino Bak išraišką nuo dozės priklausomu būdu, bet turėjo mažai įtakos Bax (3b pav.).

kaspazės šeimos baltymai yra svarbiausi fermentai vykdyti apoptozę. Tarp kaspazės šeimos nariams, kaspazės-3 yra pagrindinis budelis už apoptozės žinduolių ląstelėse [21]. Tai gali būti aktyvuota per mirties receptorių tarpininkaujant išorinei kaspazės-8 kelio ir mitochondrijas priklauso-kaspazės-9 vidinis kelias [22], [23]. Tam, kad toliau suprasti molekulinę mechanizmas apoptozės, SGC-7901 ląstelės buvo gydomi atomo, pažymėto beta-dimethylacrylshikonin ir nustatoma Western blotingo analizės kaspazės-3 ekspresijos kaitos, kaspazės-8 ir kaspazės-9, rezultatai parodė didelį priklauso nuo dozės iškilimas suskaldyti kaspazės-3, suskaldyti kaspazės-8 ir suskaldyti kaspazė-9 atomo, pažymėto β-dimethylacrylshikonin paveiktų ląstelių. PARP skaldymas, dar vienas gerai žinomas charakteristika apoptozės, taip pat buvo nustatyta atomo, pažymėto β-dimethylacrylshikonin paveiktų ląstelių (pav. 3C). Mitochondrijų funkcijos sutrikimas sukeltas apoptozę, kuris yra dažnai iš mitochondrijų membranos potencialo sumažėjimo pasekmė. Tai buvo įrodyta, kad būti pagrindinis apoptozės keliu. Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelės buvo gydomi arba be beta, β-dimethylacrylshikonin (10 mkmol /l) 24 h, rezultatai parodė, mitochondrijas membrana potencialas sumažėjo nuo 98,6% iki 56,9% po β, β-dimethylacrylshikonin buvo elgiamasi su SGC- 7901 ląstelės (3D pav.). Mes šalia išnagrinėjo paskirstymą ir pavienių ląstelių tyri- mas lokalizacijos citochromo c rasti ar mitochondrijos kelias dalyvauja beta, β-dimethylacrylshikonin sukeltos apoptozės. Po SGC-7901 ląstelės buvo gydomi beta, β-dimethylacrylshikonin (10 mkmol /L) 24 h, citochromo c pasiskirstymas buvo ryškinamos su confocal lazerio mikroskopu, kad β, β-dimethylacrylshikonin paveiktų ląstelių parodė neryškų morfologiją (pav. 3E), priešingai nei akivaizdžiai aiškus pasirodymas kontrolinėse duobutėse, nurodant citochromo c perkėlimas iš mitochondrijų į citoplazmą beta, β-dimethylacrylshikonin elgiamasi ląsteles.

Jei toliau nustatyti kaspazės aktyvavimo vaidmenį β, β-dimethylacrylshikonin- sukeltos apoptozės, mes traktuojami SGC-7901 ląsteles visos kaspazės inhibitorių Z-VAD-FMK (10 mkmol /L) prieš beta, beta-dimethylacrylshikonin gydymą. Visos kaspazės inhibitorius Z VAD-FMK išankstinis apdorojimas sumažino suskaldyti kaspazė-3, suskaldyti PARP ir sumažinti beta, β-dimethylacrylshikonin sukeltos apoptozė (pav 3F &. "; G) išraiška. Šie duomenys rodo, kad mitochondrijų tarpininkaujant kaspazės kaskados kelias vaidina labai svarbų vaidmenį beta, β-dimethylacrylshikonin sukeltos apoptozės.

β, β-Dimethylacrylshikonin sukelia ilgalaikis ERK aktyvinimas SGC-7901 ląstelių

buvo parodyta, kad MAPK signalizacijos dalyvavo keliuose renginiuose korinio įtempių ir dirgiklių sukeltas ląstelių apoptozę [24], [25]. Todėl išnagrinėjo ERK, JNK aktyvinimas ir p38 po beta, beta-dimethylacrylshikonin gydymą. Kaip parodyta Fig. 4A & B, fosforilinimo lygiai ERK ir JNK buvo, matyt, didėja kaip atsakas į atomo, pažymėto beta-dimethylacrylshikonin gydymui 2 h, ir fosforilinimo lygiai eksponuojama nuo dozės priklausomu būdu. Be to, fosforilinimo lygis ERK pastaruosius dvidešimt keturias valandas. Tačiau jokių reikšmingų pokyčių fosforilinimo lygio p38 buvo pastebėtas po beta, β-dimethylacrylshikonin gydymo (. 4C pav). Šie rezultatai rodo, kad ilgalaikis aktyvavimo ERK dalyvauja beta, β-dimethylacrylshikonin sukeltos apoptozės į SGC-7901 ląstelių.

Apie ERK signalinio kelio dalyvauja beta, β-dimethylacrylshikonin sukeltos apoptozės į SGC-7901 ląstelės

tada patikrino, ar β, β-dimethylacrylshikonin sukeltas ilgalaikis aktyvavimo ERK signalinio kelio vaidina svarbų vaidmenį apoptozės. Kaip parodyta Fig. 5A & B Vakarų dėmė tyrimas atskleidė, kad U0126 (konkretus MEK inhibitorius) slopina ilgalaikį ERK aktyvinimą ir skilimo kaspazės-3, PARP į beta, beta-dimethylacrylshikonin gydymą, o visos kaspazės inhibitorius Z VAD-FMK neturėjo poveikio beta, β-dimethylacrylshikonin sukeltos aktyvavimo ERK (pav. 5d). Be to, U0126 sumažintas ß, β-dimethylacrylshikonin sukeltas apoptozę SGC-7901 ląstelių (pav. 5c). Šie rezultatai parodė, kad β, β-dimethylacrylshikonin sukeltos apoptozės į SGC-7901 ląstelių tarpininkaujant tvaraus aktyvavimo ERK signalinio kelio.

Diskusijos

Shikonin dariniai yra aktyvūs komponentai izoliuotas nuo Kinijos vaistažolių Lithospermum erythrorhizon [5]. Šie junginiai yra perspektyvus narkotikų kandidatus, nes jie buvo pranešta turėti keletą priešvėžinių poveikį in vivo ir in vitro [5], [26]. Tarp Lithospermum erythrorhizon komponentų, β, β-Dimethylaerylshikonin turi svarbių antinavikinį poveikį, lyginant su kitų veikliųjų komponentų [27]. Dėl anti vėžio veiklos shikonin-lydyti ląstelių apoptozė per aktyvavimo kaspaze priklauso keliu buvo rasta daug piktybinių navikų. Šiame tyrime mes tyrė beta, beta dimethylacrylshikonin poveikį žmogaus skrandžio vėžio SGC-7901 ląstelių. Mūsų rezultatai parodė, kad gydymas SGC-7901 ląstelių su beta, β-dimethylacrylshikonin parodė reikšmingą citotoksinis efektas prieš SGC-7901 ląstelių dozės ir laiko priklausomu būdu, ir beta, β-dimethylacrylshikonin sukeltos apoptozės į SGC-7901 ląstelių buvo įrodytas padidėjęs anksti Apoptozinės ląstelių (aneksinu ^{+ /PI -). ir vėlai Apoptozinės ląstelių (aneksinu + /PI +)}

anti- santykis ir proapoptozinis baltymų išraiška, pavyzdžiui, BCL-2 /Bax, yra labai svarbus apoptozės indukcija, ir jis nusprendžia ląstelių jautrumą atlikti apoptozę [28]. Mitochondrijos vaidina svarbų vaidmenį signalo perdavime apoptozės [29]. Iš apoptozinių baltymų translocalization iš citozolyje į mitochondrijas veda prie citochromo c ir antrą mitochondrijų kilmės aktyvatorius kaspazių išleidimo pagal mitochondrijų membranos potencialo sumažėjimą [30], [31]. Shikonin buvo pranešta sukelti apoptozę per mitochondrijų keliu HepG2 ląstelėse [32]. Šiame tyrime mes parodėme, kad β, β-dimethylacrylshikonin žemyn sureguliavo XIAP išraišką, CIAP-2 ir BCL-2 ir up-sureguliavo Bak ir Bax išraiška, ir sukėlė mitochondrijų membranos potencialo ir išleidimo nuostolių citochromo c SGC-7901 ląstelių, suderinamas su mitochondrijų priklausomą apoptozę. Daugelio beta stebėjimas, β-dimethylacrylshikonin sužadinti kaspazės-9, kaspazės-3, ir po to skilimu PARP, taip pat rezultatą, kad visos kaspazė inhibitorius Z-VAD-FMK sumažintas β, β-dimethylacrylshikonin sukeltos apoptozės į SGC-7901 ląstelių, o tai rodo, kad mitochondrijų tarpininkaujant kaspazės kaskados kelią vaidina svarbų vaidmenį beta, β-dimethylacrylshikonin sukeltos apoptozės. Kartu paėmus, mūsų rezultatai rodo, kad β, β-dimethylacrylshikonin reguliuoja raiškos lygį apoptozės susijusių baltymų, sukelia citochromo c atleidimo ir trigs kaspaze priklauso ląstelių Apoptozė mirtį.

mitogenu aktyvinto proteino kinazės (MAPK) reguliuoja įvairūs mobilieji programas, įskaitant embriogenezę, platinimo, diferenciacijos ir apoptozės [33]. Kad MAPK šeimos baltymai yra sudarytas iš trijų proteinkinazių: ERK1 /2 (ekstraląstelinės dalies signalo reguliuojama kinazės 1 ir 2), JNK (c-birželis N-terminalas kinazės) ir p38 [34], [35]. Apskritai, praeinantis ERK aktyvinimas sukelia ląstelių proliferaciją, tačiau ilgalaikis aktyvavimo ERK yra assoctiated su diferenciacijos [36]. Atsiranda įrodymų rodo, kad ERK aktyvinimas prisideda prie apoptozės. Jeong ir kt. parodė, kad kaempferol sukelia vėžio ląstelių atlikti apoptozę per ERK priklauso nuo kelio [21], [37], [38]. Neseniai buvo pranešta, kad icaritin skatina augimo slopinimą ir apoptozę žmogaus PSMCs per ERK signalinio kelio [39]. Li ir kt. parodė, kad RAF /MEK /ERK signalinio kelio aktyvacijos vaidina lemiamą vaidmenį kalcio sukeltos apoptozės objektyvo epitelio ląstelių [40]. Čia mes taip pat nustatė, kad ilgalaikis aktyvavimo ERK dalyvauja beta, β-dimethylacrylshikonin sukeltos augimo slopinimo ir apoptozės SGC-7901 ląstelių. U0126, specifinis inhibitorius MEK (toliau MAPK /ERK kinazės), efektyviai blokuoja β, β-dimethylacrylshikonin sukeltos ERK aktyvinimas ir silpnos β, β-dimethylacrylshikonin sukeltos apoptozės, tai rodo, kad proapoptotinį beta, beta-dimethylacrylshikonin į SGC-7901 ląstelės tarpininkaujant tvaraus aktyvavimo ERK1 /2 signalizacijos keliu.

Taigi, mes nustatėme, kad β, β-dimethylacrylshikonin slopino ląstelių augimą ir sukeliama apoptozę SGC-7901 ląstelių. Mes taip pat studijavo pagrindinius mechanizmus dalyvauja beta, β-dimethylacrylshikonin sukeltos apoptozės. Mūsų rezultatai parodė, kad β, β-dimethylacrylshikonin sukeltos apoptozės apima į XIAP, CIAP-2, ir BCL-2 baltymų ekspresijos ir indukcijos Bak ir Bax baltymų raiškos mažinimo ir sukėlė mitochondrijų membranos potencialo ir išleidimo citochromo nuostolių c SGC-7901 ląstelių. Mūsų rezultatai taip pat parodė, kad β, β-dimethylacrylshikonin sukeltas apoptozę apima kaspazės-3, kaspazės-8 ir kaspazės-9 ir PARP skilimo aktyvacijos. Be to, ERK signalinio kelio taip pat dalyvavo beta, β-dimethylacrylshikonin sukeltos apoptozės. Mūsų rezultatai parodė, kad β, β-dimethylacrylshikonin gali būti sukurta kaip potencialus vaistas nuo vėžio prieš žmogaus skrandžio vėžio.

Padėka

Mes norėtume padėkoti H-BW jų techninę pagalbą ir mes taip pat padėkoti X -QM ir J-HC už naudingų pastabų dėl šio straipsnio.

• PLoS ONE: Plazminis mikro RNR, PPN-223, PPN-21 ir Pasaulis-218, kaip nauji potencialių biologinių žymenų skrandžio vėžio nustatymo
• PLoS ONE: Asociacija tarp atskirų VNP-ai ar haplotipų adatinių metaloproteinazės 1 ir skrandžio vėžio jautrumą, raidą ir Prognosis