PLoS ONE identifikavimas Serumas mikro RNR kaip nauji neinvazinis biologinių žymenų ankstyvam Skrandžio Cancer

Anotacija

Fonas

ištirti serumo miRNAs potencialą kaip biologinių žymenų, ankstyvas skrandžio vėžys (GC) populiacijos pagrindu tyrimas buvo atliktas Linqu, didelės rizikos zonoje GC Kinijoje.

Metodologija /Pagrindinės išvados

Visi tiriamieji buvo atrinkti iš dviejų didelių kohortinių tyrimų , Diferencialinės miRNAs buvo nustatyti serumo klanus GC ir valdymas naudojant TaqMan mažo tankio matrica, ir patvirtintas individualus iš 82 porų GC ir kontrolės, ir 46 porų displazija ir kontrolės realaus laiko kiekybine atvirkštinės transkripcijos-polimerazės grandinine reakcija. Tempo tendencijos nustatyti serumo Mirna išraiška buvo toliau nagrinėjamas retrospektyvinio tyrimo apie 58 GC pacientų, kuriems buvo bent vieną iš anksto GC diagnozė serumo mėginys, remiantis ilgalaikio tolesnio gyventojų. Į Mirna profiliavimo rezultatai parodė, kad 16 miRNAs buvo ženkliai aktyvinama GC pacientų, palyginti su kontroline grupe. Tolesnė validacija nustatė tris serumo miRNAs (MIR-221, MIR-744, ir Pasaulis-376c), kaip potencialių biologinių žymenų GC aptikimo ir imtuvo skydelyje veikia charakteristika (ROC) kreivė pagrindu rizikos vertinimo analizė parodė, kad ši komisija galėtų atskirti GCS nuo kontrolės su 82,4% jautrumu ir 58,8% specifiškumu. MIR-221 ir Pasaulis-376c parodė žymiai teigiamą koreliaciją su prasta diferenciacijos GC, o Pasaulis-221 rodoma aukštesnį lygį displazija nei kontrolės. Be to, atgaline data Tyrimas atskleidė didėjo šių trijų Mirna lygio per GC plėtros ( P
už tendencija < 0,05), o šios komisijos gali klasifikuoti surinktus iki 5 metų į priekį klinikinės GC diagnozę su 79,3 serumo mėginius, % bendra tikslumas.

Išvados /Reikšmė

Šie duomenys rodo, kad serumo MIR-221, PPN-376c ir Pasaulis-744 turi didelį potencialą kaip nauji neinvazinių biologinių žymenų, ankstyvas GC.

nurodomoji dalis: Daina Mano, visos Kf, S H j Zhang L Ma Jl Li Jy, et al., (2012) identifikavimas Serumas mikro RNR, kaip naujus neinvazinis biologinių žymenų ankstyvam skrandžio vėžio. PLoS vieną iš 7 (3): e33608. Doi: 10,1371 /journal.pone.0033608

redaktorius: Juozapas Califano John Hopkins medicinos mokykloje, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Lapkričio 15, 2011 m Priėmė: Vasario 13, 2012 m Paskelbta kovo 14 2012

Visos teisės saugomos: © 2012 Lyrinės et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė dotacijas iš Nacionalinės pagrindinių mokslinių tyrimų programą Kinijos (973 programa: 2010CB529303), A3 prognozavimo programą iš natūralių mokslo fondo Kinijos (30921140311) ir Nacionalinės Gamtos mokslo fondo Kinijos (81.041.012 ir 81.171.989). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra antra pagrindinė priežastis, dėl vėžio mirties pasaulyje, beveik pusė vyksta Kinijoje [1], [2]. GC prognozė kinta nepaprastai iki vėžio stadijos su 5 metų santykinio išgyvenamumas siekė 90% I etapas, bet mažiau kaip 5% [3] IV etapas. Taigi, anksti aptikti GC yra pagrindinė priemonė, siekiant sumažinti mirtingumą ir pagerinti GC prognozę.

Nors gastroscopic atrankos GC yra labai patikima, tai yra invazinės ir brangus, ypač besivystančiose šalyse. Todėl daug pastangų buvo padaryta kurti pigesnius išankstinius atrankos bandymai, lengvai prieinamose egzempliorių. Tačiau, daug anksčiau ištirti analitės, pavyzdžiui, pepsinogen (PG) I /II santykis, karcinoembrioninio antigeno (CEA) ir angliavandenių antigeno 19-9 (CA 19-9), nebuvo jautrus ir pakankamai konkreti, GC, tikrinimą [3], [ ,,,0],4]. Taigi, skubiai reikia naujų neinvazinių biologinių žymenų pagerinti ankstyvas GC.

mikro RNR (miRNAs) yra gausu klasė mažų ne kodavimo RNR, kad neigiamai reguliuoti genų ekspresiją bazinės Kergimas su 3'-netransliuojamoji regionas tikslinių mRNAs, pasekmės gali buti iRNR skilimo arba pritaikymo represijos [5], [6]. Daugėja įrodymų, parodė, kad miRNAs dalyvauja įvairių biologinių procesų, įskaitant plėtrą, ląstelių diferenciacijos, platinimo ir apoptozės [7], ir dalyvauti žmogaus kancerogenezėje kaip onkogenų ar naviko slopintuvai [8]. Tyrimai parodė, kad Mirna išraiška aprašymą svyruoja tarp naviko tipų ir gali atskirti vėžiu ir sveikų audinių [9], [10]. Neseniai cirkuliuojančių miRNAs buvo siūloma daug galimybių, kaip biologinių žymenų daugelį vėžio, įskaitant GC [11] - [16]. Tačiau cirkuliuojančių miRNAs anksti aptikti GC vertė nebuvo pranešta dar.

Nuo 1989 mes atlikome daug tyrimų seriją Linqu apskritis, didelės rizikos zonoje GC, Shandong Province, China , įskaitant gyventojų pagrindu kohortos tyrimo ikivėžinius skrandžio pažeidimų [17], [18], ir atsitiktinių imčių tyrimas slopina skrandžio pažeidimų [19] progresavimą. Tai kohortos leidžia mums tirti į dinamiškus pokyčius cirkuliuojančių Mirna lygį per GC plėtrą, ir suteikia mums unikalią galimybę tyrinėti cirkuliuojančių miRNAs anksti aptikti GC potencialą.

Šioje dalyje mes pranešime Diferencialinė rezultatus miRNAs į GC ir displazija (DYS), ir retrospektyvine tyrimo, skirto įvertinti dinaminius pokyčius per GC plėtros serume.

medžiagos ir metodai

tyrimo dizainas ir gyventojų

detalės studijų gyventojų procedūrų endoskopinio tyrimo, kriterijus skrandžio histopatalogiją ir tolesnių buvo aprašyti kitur [17] - [19]. Trumpai tariant, endoskopinis atrankos tyrimas buvo pradėtas 1989 m tarp 3399 metų 35-64 metų Linqu apskritis, didelės rizikos zonoje GC gyventojams, ir dalykai be GC diagnozę vėliau buvo stebimi su pasikartojančiu endoskopinio tyrimo, atlikto 1994 metais [17 ], [18]. 1995 metais, atsitiktinių imčių, placebu kontroliuojamas intervencija tyrimas buvo pradėtas šių gyventojų iki 2003 m, kai kartojamas endoskopinis tyrimas buvo atliktas [19]. Visi dalykai atlikta kraujo lygiosiomis tiek pradinių ir galutinių taškų tyrimų kiekvieno tyrimo, o kai sergantys išplitusiu skrandžio pažeidimų, pavyzdžiui, žarnyno metaplazijos (MP) arba dys, taip pat jeigu kraują ir gavo endoskopinės egzaminą
1992 ir 1999

dabartinės studijų, multi-pakopų, įdėtos atvejo ir kontrolės tyrimas iš dviejų didelių kohortos buvo sukurta siekiant identifikuoti ir patvirtinti skirtumas serume miRNAs GC ir DYS ir retrospektyvus tyrimas buvo atliktas siekiant ištirti kandidatės serume potencialo miRNAs į ankstyvam GC (1 pav.)

Šis tyrimas buvo padalintas į keturias pamažu etapais. Pirmojoje stadijoje, serumo baseinai iš 14 GC pacientų ir 14 pagal amžiaus grupes ir lytį atitiko kontrolės su paviršiniu gastritu (SG) arba lengvos lėtinio atrofinį gastritas (PVG) diagnozė buvo naudojamas generuoti Mirna profilių masyvo analizę. buvo identifikuoti Diferencialinės miRNAs, ir labai aktyvinama miRNAs arba vidutiniškai aktyvinama miRNAs turintys funkcinių ar žymenų, susijusių su ataskaitų atrinko tolesnei analizei. II etape nustatyti miRNAs buvo patvirtintas naudojant kiekybinį atvirkštinės transkripcijos-polimerazės grandininę reakciją (KRL-PGR) ant atskirų serumo mėginių 14 GCS ir kontrolės, kurie buvo naudojami masyvo bandymo fazėje I III etapas, gerokai pasikeitęs miRNAs vėliau buvo patvirtintas 68 GC ir 46 DYS pacientams, taip pat jų pagal amžiaus grupes ir lytį atitiko kontrolės. tada ROC kreivė (ROC) kreivė pagrindu rizikos vertinimo analizė buvo atlikta tarp 68 GC kontrolės porų įvertinti diskriminacinę poveikį serumo miRNAs apie GC. Kiekviena tema buvo paskirtas į vieną aukštos arba žemos rizikos grupių lyginant raiškos lygius Mirna biologinių žymenų į atitinkamas ribines vertes, gautų iš ROC kreive. IV etapas, retrospektyvus tyrimas buvo atliktas 58 GC pacientų, kurie pateikė bent vieną tinkamą anksto diagnostikos serumo mėginys ilgalaikio tolesnio tyrimo, kaip aprašyta pirmiau, tyrinėti laiko tendenciją potencialių Mirna biologinių žymenų ir nustatyti jų vertė ankstyvą GC aptikti. Visa tyrimas buvo patvirtintas Institucijų peržiūros valdybos Pekino universiteto onkologijos ligoninės & Institutas, ir visi dalykai davė parašyta informuoti sutikimą.

Imties apdorojimas ir RNR gavybos

Iki 5 ml pilno kraujo iš kiekvienos nevalgius dalyvio buvo surinkta atvejais ir kontrolės daroma tais pačiais metais. Kraujo mėginiai buvo leidžiama nusistovėti 30-40 min ir serumo atskyrimo buvo atliekamas nuo 965 g centrifuguojant 15 min. Supernatantas serumo buvo aptikta ir saugomi -80 ° C temperatūroje, kol analizės. RNR buvo išskirta iš 100 iL serume naudojant miRNeasy Mini rinkinį (QIAGEN, Vokietija) pagal gamintojo protokolą su nedidelėmis pataisomis [20]. Dėl Mirna profiliavimo, du baseinai buvo sukurtas sujungus Aukštutinės vandeninės fazės mišiniai po fazių atskyrimo ir etanoliu 14 GC pacientų (12 vyrų, 2 moterų; amžiaus, 62 (SN 6,4) metus) ir 14 lytinius ir atitinkamo amžiaus kontrolės (amžius, 61 (SN 5,9) metus), atitinkamai. Po to, kai prisijungęs prie šio RNeasy Mini centrifugavimo kolonėlę ir tolesnį plovimą, membranos, RNR eliuojamas 40 pL RNazės-laisvojo vandens. Visiems KRL-PGR eksperimentų, išskirta RNR iš 100 mikrol, serumo eliuojamas 100 pL RNazės-laisvojo vandens. Normalizuoti pavyzdys-į-imties variacijos RNR išskyrimo žingsnio, sintetiniai ATH-Pasaulis-159a buvo įtraukta į kiekvieno pavyzdžio Mirna profiliavimo serume, o asmenų, Pasaulis-39 buvo pridėta KRL-PGR analizei, kaip aprašyta Mitchell ET Al
[11].

Mirna profiliavimo

Mirna profiliavimas buvo atliekama naudojant TaqMan mažo tankio matrica A (v2.0) pagal gamintojo rekomenduojamą protokolą (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Tai KRL-PGR profiliavimo platforma sudaro vienas 384 šulinėlių microfluidic kortelę, kurioje 377 miRNAs gali būti analizuojama kartu su trimis vidiniais kontrolę (U6, RNU44 ir RNU48) ir vienos neigiamos kontrolės nesusiję su žmogaus (ATH-miR-159a). Trumpai tariant, RNR sudarytas atskirai nuo 14 GC pacientų ir kontrolinės, kaip aprašyta pirmiau buvo atvirkštinis aranžuotus naudojant TaqMan Mirna atvirkštinės transkripcijos rinkinys ir TaqMan Mirna daugkartinis RT tyrimai (žmogaus baseinas, Taikomoji BIOSYSTEMS). Kiekvienam RNR baseinas, 3 mikrol, kurių bendra RNR buvo pridedama prie kiekvieno multipleksuojančio atvirkštinės transkripcijos reakcijos.

Siekiant padidinti cDNR turima už analizės sumą, sodrinimo tikslinių genų buvo atliekamas su PIRMASIS stiprinimas žingsnio. 25-mikrol Reakcijos mišinys sudarė 2,5 įxL neskiesto kDNR kartu su 12,5 įxL TaqMan STIPRINTUVAS Master Mix (2 ×), 2.5 įxL Megaplex STIPRINTUVAS Gruntai (10 ×) ir 7,5 įxL nukleaziniu be vandens. PIRMASIS stiprinimas žingsnis buvo atliktas GeneAmp PGR sistema 9700 (Applied Biosystems) pagal gamintojo protokolą.

realaus laiko PGR analizės produktas buvo praskiestas, pridedant 75 įxL nukleaziniu be vandens, ir 9 iL praskiesto mišinio vėliau buvo derinamas su 450 įxL TaqMan 2 × Universalus PGR pagrindinį mišinį be uracilo-N-glikozilazės ir 441 įxL nukleaziniu be vandens. Įdėję 100 iL kiekvieno Multiplex baseinas mišinio, masyvas buvo centrifuguojamas ir užsandarinti. Amplifikacija buvo atlikta ant Applied Biosystems 7900 HT termocikleriu (Applied Biosystems), naudojant gamintojo rekomenduojamą dviračių sąlygas. Duomenys buvo analizuojami naudojant RQ Manager "programinė įranga 1,2 versija ir DataAssist ™ programinės įrangos versija 2.0 (Applied BIOSYSTEMS). Po normalizavimo naudojant spiked-in ATH-miR-159A, The kartus iš miRNAs lygių GC, palyginti su kontrolės pasikeitimas buvo apskaičiuojamas metodo.

Mirna kiekybinis realaus laiko KRL-PGR

atvirkštinės transkripcijos atlikta naudojant TaqMan Mirna atvirkštinės transkripcijos rinkinys ir Mirna konkrečius kamieninių kilpa pradmenis (taikomoji BIOSYSTEMS). 7,5-mikrol Reakcijos mišinys sudarė 0,75 įxL 10 × atvirkštinio transkripcijos buferis, 0.095 įxL RNaze inhibitorių (20 vnt /pl), 0.075 įxL 100 mm dNTP su dTTF 0,5 įxL MultiScribe atvirkštinio transkriptazės (50 vnt /pl) 1,5 įxL gruntas, 2.5 mikrol RNR ir 2,08 mikrol RNazės be vandens. Atvirkštinės transkripcijos buvo atliktas T profesinės PGR sistemos (Biometra, Vokietija) pagal gamintojo protokolą.

Realaus laiko PGR buvo atliekama dviem egzemplioriais ir PAKUOTĖJE NE-template neigiamos kontrolės. Dėl 20-iL reakcijos, kDNR (3 pl) buvo derinamas su 10 įxL TaqMan 2 × Universalus PGR pagrindinį mišinį be uracilo-N-glikozilazės 1 įxL į TaqMan Mirna bandymo mišinį, o 6 įxL vandeniu. Amplifikacija buvo atliktas

• PLoS ONE: Pieno fermentuotas Propionibacterium freudenreichii sukelia apoptozę HGT-1 Žmonių Skrandžio vėžio ląsteles
• PLoS ONE: genetinis polinkis į CagA-sistema sąveiką molekulių ir genų-aplinkos Sąveika su fitoestrogenų: dėl tariamų rizikos veiksnys skrandžio vėžio