PLoS ONE: Identificatie van Serum MicroRNA als nieuwe niet-invasieve biomarkers voor de vroege detectie van Gastric Cancer

De abstracte

Achtergrond

Om het potentieel van serum miRNAs als biomarkers voor de vroege opsporing van de maag te onderzoeken kanker (GC), werd een populatie gebaseerde studie uitgevoerd in Linqu, een hoog risico gebied van GC in China.

Methodologie /voornaamste bevindingen

Alle proefpersonen werden geselecteerd uit twee grote cohortstudies . Differentiële miRNAs werden in serum pools van GC en controle via TaqMan lage dichtheid matrix en gevalideerd individu van 82 paren GC en controle en 46 paren dysplasie en controle door real-time kwantitatieve reverse transcriptie-polymerase kettingreactie. De temporele trends van de geïdentificeerde serum miRNA expressie werden verder onderzocht in een retrospectieve studie op 58 GC patiënten die ten minste één pre-GC diagnose serummonster had op basis van de lange-termijn follow-up bevolking. De miRNA profilering resultaten toonden aan dat 16 miRNAs sterk waren opgereguleerd in GC patiënten vergeleken met controles. Verdere validatie identificeerde een panel van drie serum miRNAs (miR-221, miR-744 en miR-376c) als potentiële biomarkers voor GC-detectie, en de ontvanger operating characteristic (ROC)-curve op basis van risicobeoordeling analyse toonde aan dat dit paneel kon onderscheiden GC van controles met 82,4% sensitiviteit en 58,8% specificiteit. MiR-221 en miR-376c aangetoond significant positieve correlatie met slechte differentiatie van GC en miR-221 weergegeven hoger niveau in dysplasie dan in de controle. Bovendien is de retrospectieve studie toonde een stijgende trend van deze drie miRNA niveaus tijdens de GC ontwikkeling ( P
voor trend < 0,05), en dit paneel serummonsters verzameld tot 5 jaar vooruit klinische GC diagnose met 79.3 kunnen classificeren % algehele nauwkeurigheid.

Conclusies /Belang

Deze gegevens suggereren dat serum miR-221, miR-376c en miR-744 hebben een sterk potentieel als nieuwe niet-invasieve biomarkers voor vroege opsporing van GC.

Visum: Song My, Pan Kf, Su Hj, Zhang L, Ma Jl, Li Jy, et al. (2012) Identificatie van Serum MicroRNA als nieuwe niet-invasieve biomarkers voor de vroege opsporing van maagkanker. PLoS ONE 7 (3): e33608. doi: 10.1371 /journal.pone.0033608

Uitgever: Joseph Califano, John Hopkins Medical School, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 15 november 2011; Geaccepteerd: 13 februari 2012; Gepubliceerd: 14 maart 2012

Copyright: © 2012 Song et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Nationale Basic Research Program van China (973 Programma: 2010CB529303), A3 foresight Program van Natural Science Foundation of China (30921140311) en de National Natural Science Foundation of China (81041012 en 81171989). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is de tweede belangrijkste oorzaak van kanker overlijden in de wereld, met bijna de helft zich in China [1], [2]. De prognose van GC varieert opvallend door het stadium van kanker met de 5-jaars relatieve overleving bereiken van 90% in fase I, maar minder dan 5% in de derde fase [3] IV. Aldus vroegtijdige opsporing van GC is van wezenlijk belang voor de sterfte te verminderen en de prognose van GC.

Hoewel gastroscopisch screening voor GC is zeer betrouwbaar, het is invasief en duur, met name voor de ontwikkelingslanden. Daarom is er veel moeite gedaan om minder dure oriënterende proeven gemakkelijk toegankelijke specimens ontwikkelen. Veel eerder onderzochte analyten, zoals pepsinogeen (PG) I /II verhouding carcinoembryonaal antigeen (CEA) en koolhydraat antigeen 19-9 (CA 19-9), waren niet gevoelig en specifiek genoeg voor GC screenen [3], [ ,,,0],4]. Er is dus een dringende behoefte aan nieuwe niet-invasieve biomarkers voor de vroege opsporing van GC te verbeteren.

MicroRNAs (miRNAs) zijn een overvloedige klasse van kleine niet-coderende RNA's die een negatieve reguleren genexpressie door baseparing met de 3'-ongetranslateerde regio doelwit mRNA, resulterend in ofwel mRNA splitsing of translationele onderdrukking [5], [6]. Toenemend bewijs heeft aangetoond dat miRNAs betrokken zijn bij verschillende biologische processen zoals ontwikkeling, celdifferentiatie, proliferatie en apoptose [7], en deelnemen aan humane carcinogenese zoals oncogenen of tumor suppressors [8]. Studies hebben aangegeven dat miRNA expressieprofiel varieert tussen tumortypen en kan kanker en normale weefsels te onderscheiden [9], [10]. Recent zijn circulerende miRNAs gesuggereerd groot potentieel als biomarkers voor vele soorten kanker, waaronder GC [11] - [16]. Echter, de waarde van de circulerende miRNAs in de vroege opsporing van GC is nog niet gemeld.

Sinds 1989 hebben we een reeks van studies in Linqu County, een hoog risico gebied van GC in de provincie Shandong, China uitgevoerd , met inbegrip van een basis van de bevolking cohort studie van precancerous maag-laesies [17], [18] en een gerandomiseerde trial om de progressie van de maag laesies [19] te remmen. Dit cohort laat ons toe om de dynamische veranderingen in circulerende miRNA niveaus tijdens de GC ontwikkeling te onderzoeken, en geeft ons een unieke kans om het potentieel van circulerende miRNAs in vroege opsporing van GC te verkennen.

Hierin worden de resultaten van differentiële melden wij miRNAs in het serum van GC en dysplasie (DYS), en een retrospectieve studie ontworpen om de dynamische veranderingen tijdens GC ontwikkeling te evalueren.

Materialen en methoden

studie ontwerp en de bevolking

De details van de studiepopulatie, procedures van endoscopisch onderzoek, criteria van maag histopathologie en follow-up zijn elders beschreven [17] - [19]. In het kort werd een endoscopische screening enquête gelanceerd in 1989 onder 3399 inwoners van 35-64 jaar in Linqu County, een hoog risico gebied van GC de leeftijd, en de proefpersonen zonder GC diagnose werden vervolgens gevolgd met de herhaalde endoscopisch onderzoek uitgevoerd in 1994 [17 ], [18]. In 1995 werd een gerandomiseerde, placebo-gecontroleerde interventie studie gestart in deze populatie tot 2003, toen herhaald endoscopisch onderzoek werd uitgevoerd [19]. Alle proefpersonen ondergingen bloedafname in zowel de baseline en eindpunt enquêtes van elk onderzoek, en sommige met geavanceerde maag laesies, zoals intestinale metaplasie (IM) of DYS, ook voorzien van bloed en endoscopisch onderzoek ontvangen in 1992 en 1999.

in de huidige studie, een multi-stage, geneste case-control studie van twee grote cohorten werd ontworpen om het differentieel serum miRNAs identificeren en te valideren in GC en DYS en een retrospectieve studie werd uitgevoerd om het potentieel van de kandidaat-serum onderzoeken miRNAs in vroege opsporing van GC (figuur 1).

De studie bestond uit vier fasen stapsgewijs. In fase I, serum pools GC 14 patiënten en 14 leeftijd en geslacht gematchte controles met de diagnose van oppervlakkige gastritis (SG) of milde chronische atrofische gastritis (CAG) gebruikt om miRNA profielen van array analyse te genereren. Differential miRNAs werden geïdentificeerd, en de extreem opgereguleerd miRNAs of matig opgereguleerd miRNAs met functionele of-biomarker gerelateerde rapporten werden geselecteerd voor verdere analyse. In fase II werden geïdentificeerd miRNAs gevalideerd met behulp van kwantitatieve reverse transcriptie-polymerase ketenreactie (qRT-PCR) op de individuele serummonsters van 14 GC en controles die werden gebruikt voor de array-test in fase I in fase III, de significant veranderd miRNAs werden vervolgens gevalideerd in 68 GC en 46 DYS patiënten en hun leeftijd en geslacht gematchte controles. Receiver operating characteristic (ROC) curve risicobeoordeling van analyse werd vervolgens uitgevoerd onder de 68 GC-control paren om het onderscheidende effect serum miRNAs van GC evalueren. Elk onderwerp werd toegewezen in ofwel hoge of lage risicogroepen door vergelijking van de expressie van miRNA biomarkers om de corresponderende cut-off-waarden afgeleid van ROC-curve. In fase IV, werd een retrospectief onderzoek uitgevoerd bij 58 GC patiënten, die minstens één aanmerking prediagnose serummonster in de follow-up studie langdurige ontvangen zoals hierboven beschreven, de temporele ontwikkeling van mogelijke miRNA biomarkers onderzoeken en kwantificeren in vroege detectie GC. Het hele onderzoek werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Universiteit van Peking kanker ziekenhuis & Institute, en alle patiënten gaven schriftelijk informed consent.

Sample verwerking en RNA-extractie

Tot 5 ml bloed uit elk vasten deelnemer werd verzameld met cases en controles gedaan op hetzelfde jaar. Bloedmonsters werden toegestaan ​​gedurende 30-40 min en serumafscheiding staan ​​werd bewerkstelligd door centrifugeren bij 965 g gedurende 15 min. Het supernatant werd gewonnen en serum bewaard bij -80 ° C tot analyse. RNA werd geïsoleerd uit 100 pi serum met de miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Duitsland) volgens het protocol van de fabrikant met geringe wijziging [20]. Voor miRNA profilering, werden twee zwembaden die door de mengsels van de bovenste waterfase combineren na fasescheiding en ethanol uit 14 GC patiënten (12 mannen, 2 vrouwen, leeftijd, 62 (SD 6.4) jaar) en 14 sexe en leeftijd gematchte controles (leeftijd 61 (SD 5,9) jaar), respectievelijk. Na binding aan het membraan van RNeasy Mini spinkolom en daaropvolgend wassen, werd RNA geëlueerd met 40 gl RNase-vrij water. Voor qRT-PCR experimenten RNA geëxtraheerd uit 100 pi serum werd geëlueerd met 100 gl RNase-vrij water. Om de sample-to-sample variatie in RNA-isolatie stap te normaliseren, werd synthetisch ATH-miR-159a aan elk serummonster voor miRNA profilering toegevoegd terwijl cel-miR-39 voor qRT-PCR-analyse werd toegevoegd zoals beschreven door Mitchell et al
[11].

miRNA profilering

miRNA profilering werd uitgevoerd met behulp van TaqMan lage dichtheid reeks A (v2.0) volgens de aanbevolen protocol van de fabrikant (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Dit qRT-PCR profilering platform bestaat uit een 384-well microfluïde-kaart waarop 377 miRNAs samen met drie endogene controles (U6, RNU44 en RNU48) en een negatieve controle verbonden op mens (ath-miR-159a) kan worden geanalyseerd. Kortom, het RNA afzonderlijk samengebracht uit 14 GC patiënten en controlepersonen zoals hierboven beschreven werd reverse getranscribeerd met behulp van de TaqMan miRNA reverse transcriptie kit en TaqMan RT miRNA multiplex assays (humaan pool; Applied Biosystems). Voor elk RNA pool werd 3 ui totaal RNA voor elk van de multiplex reverse transcriptie reacties toegevoegd.

De hoeveelheid cDNA vindt analysetijd ophoping van de doelgenen werd uitgevoerd met een voorversterking stap. De 25-gl reactiemengsel bestaande uit 2,5 pi onverdund cDNA gecombineerd met 12,5 ul TaqMan PreAmp Master Mix (2 x), 2,5 gl Megaplex PreAmp Primers (10 x) en 7,5 ul nuclease-vrij water. De vooramplificatie stap werd uitgevoerd op een GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) volgens het protocol van de fabrikant.

Voor real-time PCR-analyse, werd het product verdund door toevoeging van 75 pl nuclease-vrij water en 9 pl van het verdunde mengsel werd vervolgens gecombineerd met 450 ui 2 x TaqMan Universal PCR Master Mix zonder uracil-N-glycosylase en 441 pi nuclease-vrij water. Na het laden van 100 pi van elke multiplex pool mengsel, werd de reeks gecentrifugeerd en verzegeld. Amplificatie werd uitgevoerd op een Applied Biosystems 7900 HT thermocycler (Applied Biosystems) onder toepassing aanbevolen fietsomstandigheden de fabrikant. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van RQ Manager Software versie 1.2 en DataAssist ™ -software versie 2.0 (Applied Biosystems). Na normalisatie met behulp van de spiked-in ATH-miR-159a, de vouw verandering van miRNAs niveaus in GC vergelijking met de controlegroep werd berekend door de methode.

miRNA kwantificering door real-time PCR-qRT

Reverse transcriptie werd uitgevoerd met de TaqMan miRNA reverse transcriptie kit en miRNA-specifieke stamlus primers (Applied Biosystems). De 7,5-gl reactiemengsel bestond uit 0,75 gl 10 x reverse-transcriptiebuffer, 0,095 gl RNase-remmer (20 eenheden /gl), 0,075 ui 100 mM dNTPs met dTTP, 0,5 pl MultiScribe reverse-transcriptase (50 eenheden /pl), 1,5 pi primer, 2,5 pl RNA en 2,08 gl RNase-vrij water. Reverse transcriptie werd uitgevoerd op een T professionele PCR systeem (Biometra, Duitsland) volgens het protocol van de fabrikant.

Real-time PCR werd uitgevoerd in duplo en omvatte geen template negatieve controles. Voor de 20-ul reactie cDNA (3 pi) werd met 10 pl 2 x TaqMan Universal PCR Master Mix zonder uracil-N-glycosylase, 1 ui van het miRNA TaqMan assay mix en 6 pl water. Amplificatie werd uitgevoerd op een 7500 Real-Time PCR-systeem (Applied Biosystems) volgens het protocol van de fabrikant. De expressie niveaus van miRNAs werden genormaliseerd aan de spiked-in CEL-miR-39, en werden berekend met behulp van de methode.

Statistische analyse

De gepaarde t
test werd gebruikt om het verschil in gemiddelde leeftijd tussen groepen onderzocht. De Wilcoxon-test of Mann-Whitney U test werd gebruikt om het serum miRNA niveaus van verschillende groepen eventueel vergelijken. ROC curves werden opgericht om de diagnostische effecten van miRNAs te evalueren, en de gegeneraliseerde lineaire model met herhaalde metingen werd gebruikt om de temporele trends van serum miRNA niveaus analyseren tijdens GC ontwikkeling na logaritmische transformatie. Alle P
waarden waren tweezijdig en minder dan 0,05 werd als statistisch significant. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van het statistisch pakket voor de Social Sciences (SPSS 13.0, Chicago, IL).

Resultaten

Onderwerp kenmerken

Een totaal van 82 patiënten GC, 46 patiënten met DYS en 128 controles SG of milde CAG werden in deze studie. Zoals getoond in tabel 1, was er geen significant verschil in leeftijd tussen patiënten met GC of DYS en hun overeenkomstige controles ( P
= 0,329 en 0,214, respectievelijk).

miRNA profilering

Het differentieel tot expressie miRNAs werden geïdentificeerd in serum pools van 14 GC en 14 controles met behulp van TaqMan lage dichtheid array. Onder 377 miRNAs geanalyseerd, 99 toonde > 2-voudig opgereguleerd en 40 toonde < 0,5-voudige downregulated veranderingen in GC serum zwembad (tabel S1). Zestien opgereguleerd miRNAs (miR-221, miR-744, miR-376c, miR-191, miR-27a, laat-7e, miR-27b, miR-222, miR-21, miR-18a, miR-19a, buitenspiegels 17, miR-106b, miR-106a, miR-20a en miR-155) aan te tonen opmerkelijke expressie veranderingen in GC serum en met functionele of differentiële expressie verslagen in GC weefsel werden geselecteerd als kandidaten voor de vuist-stage validatie [21] - [28]

eerste fase validatie

De uitingen van de 16 kandidaat-miRNAs werden gemeten in de individuele serum monsters van 14 GC's en controles die werden gebruikt voor de serie te testen.. In overeenstemming met de profilering resultaten, Alle 16 miRNAs werden hogere serum niveaus in GC-groep dan in de controlegroep (figuur S1). Onder hen, 9 serum miRNAs (miR-221, miR-744, miR-376c, miR-191, miR-27a, laat-7e, miR-27b, miR-222 en miR-21) had > 2 gemiddelde voudig verandering in GC-groep in vergelijking met de controlegroep ( P Restaurant < 0,05), en werden dus gekozen voor verdere validatie

Tweede fase validatie

We hebben gekeken naar de 9 miRNA. uitdrukkingen op een grote set van serum van 68 paren van GC en controle. Zoals weergegeven in figuur 2, 8 van de 9 miRNAs (miR-221, miR-744, miR-376c, miR-191, miR-27a, laat-7e, miR-27b en miR-222) toonde significant verhoogde niveaus in GC groep met meer dan 2-voudige verandering ( P Restaurant < 0,05)., en deze miRNAs werden geselecteerd voor de volgende analyses

Risicobeoordeling van GC gevallen met behulp van een panel van miRNAs

de onderscheidende effect serum miRNAs van GC evalueren, werden ROC curves voor elk van de 8 miRNAs via 68 paren GC en controle in de tweede fase validatie (figuur 3). Uit de resultaten bleek dat miR-744, miR-376c, miR-221 en laat-7e leverde de grootste gebieden onder de ROC curves (AUC) en kan het potentieel als biomarkers voor GC detectie te hebben.

Risicobeoordeling op basis de vier miRNAs werd gebruikt om serummonsters van GC gevallen te onderscheiden van de controles. Voor elke miRNA, we eerst berekende de optimale cut-off waarde van de relatieve expressie niveau (miR-744: 5,49 × 10 ^{-4, miR-376c: 6.05 × 10 -4, miR-221: 1.47 × 10 -3, laat-7e: 1,61 × 10 -3), waarbij de Youden index (gevoeligheid + specificiteit-1) voor GC de diagnose was het grootst bij de ROC-curve. Vervolgens verdeeld we het onderwerp in een hoog-risico-groep, voor de mogelijke GC geval, als het serum niveau van elk van de vier miRNAs gelijk is aan of groter is dan de overeenkomstige grenswaarde was, en een laag risico-groep, die de controle wanneer de serumniveaus van alle vier miRNAs minder dan de grenswaarden.}

Volgens deze beoordelingscriterium, 56 GC en 32 controles werden correct voorspeld als GC en GC niet- gevallen produceren de gevoeligheid van 82,4% en de specificiteit van 47,1%. Aangezien let-7e lieten de kleinste waarde en breedste betrouwbaarheidsinterval van AUC tussen de vier miRNAs in de curve analyse (Figuur 3), herhaalden we de bovengenoemde risicobeoordeling na uitsluiting laat-7e en verkregen een hogere specificiteit (40/68, 58,8 %), terwijl de gevoeligheid bleef ongewijzigd, wat aangeeft dat de bijdrage van de laat-7e te differentiëren GC van de controles was te verwaarlozen, en het paneel drie-miRNA (miR-221, miR-376c en miR-744) was een meer efficiënte combinatie van biomarkers voor GC diagnose.

Om het potentieel van dit paneel voor de vroegtijdige opsporing van GC verder te onderzoeken, onderzochten we een subgroep van 30 GC patiënten in een vroeg stadium, en 22 werden correct voorspeld als GC gevallen met de gevoeligheid van 73,3% .

associatie tussen serum miRNA expressie en differentiatie kwaliteiten van GC

Bovendien zochten we naar de correlatie tussen de expressie van miR-221, miR-744 en miR-376c, en differentiatie kwaliteiten te onderzoeken GC. Zoals getoond in Figuur 4A-C, alle drie miRNAs vertoonden hogere serum niveaus in slecht gedifferentieerde GC groep (43 GC inclusief 29 mannelijke en 14 vrouwelijke, leeftijd 60 (SD 8,3) jaar) dan bij goed tot matig gedifferentieerde GC groep (24 GC waaronder 19 mannen en 5 vrouwen, leeftijd, 60 (SD 6.2) jaar). Onder hen, serum miR-221 en miR-376c toonden significant positieve correlatie met slechte differentiatie van GC ( P
= 0,006 en 0,004, respectievelijk).

Expressie serum miRNA biomarkers bij personen met DYS

Om verder de relevantie van deze drie miRNAs met premalignant maag letsel toe te lichten, hebben we onderzocht hun uitingen in 46 paren van DYS en controle. Zoals getoond in Figuur 4D-F, werd een significant verhoogd niveau van miR-221 in DYS groep vergeleken met controles ( P
= 0,027), terwijl er geen significant verschil gevonden voor miR-376c of buitenspiegels 744. Verdere risicoanalysebeoordeling volgende eerder vastgestelde procedures is gebleken dat dit panel van drie miRNA DYS kon onderscheiden van controle met de gevoeligheid van 56,5% en de specificiteit van 47,8%.

dynamische veranderingen van het serum miRNA biomarkers tijdens GC ontwikkeling

In de retrospectieve studie, de dynamische veranderingen van de drie serum miRNA biomarkers werden gedetecteerd op 58 GC patiënten die werden verdeeld in vier groepen op basis van het tijdsinterval van bloedafname GC diagnose: pre-diagnose 2-5 jaar , 6-9 jaar, 10-14 jaar en ≥15 jaar (tabel 2). Sommige onderwerpen kunnen gelijktijdig bestaan ​​in twee of meer dan twee groepen, omdat ze voorzien serummonsters in meerdere tijdstippen van de follow-up periode.

Zoals weergegeven in figuur 5A, alle drie serum miRNAs weergegeven aanzienlijk verhogen van de expressie tijdens GC ontwikkeling, behalve lichte stijging van serum miR-744 in de prediagnose ≥15 jaar groep. Verdere trend test toonde een statistisch significante lineaire trend in de drie miRNA niveaus bij 20 GC patiënten die drie serummonsters op verschillende tijdstippen tijdens de follow-up periode (figuur 5B) droeg.

Tot slot evalueerden wij de potentiële van miRNA biomarkers voor vroege voorspelling van GC bij 29 patiënten, die serummonsters 2-5 jaar voordat GC diagnose hadden ontvangen. Volgens het criterium risicoanalyse vooraleer opgericht, 23 van de 29 GC patiënten (79,3%) werden correct geclassificeerd als de vertegenwoordigde GC gevallen door deze drie-serum miRNA panel.

Discussie

Het is de bedoeling van dit onderzoek was het identificeren differentiële miRNAs in het serum van GC en DYS en onderzoekt het potentieel van serum miRNAs als biomarker voor de vroege detectie van GC. We vonden de significant verhoogde niveaus van serum miR-221, miR-376c en miR-744 in GC patiënten via systematische microarray-based screening en twee-traps validatie. Deze drie-serum miRNA panel kon GC onderscheiden van controles en een stijgende trend vertoonde tijdens de GC ontwikkeling. Om het beste van onze kennis, dit is de eerste populatie gebaseerde studie in het verkennen van de dynamische veranderingen van serum miRNAs in verband met GC en zijn voorlopers in een hoog-risico gebied van GC.

De incidentie van GC varieert sterk wereldwijd met de hoogste optredende in Oost Azië, waaronder Japan, Korea en China [1], [2]. In China, het grootste deel van GC worden gediagnosticeerd in gevorderde stadia resulteert in een slechte prognose, met een gemiddelde 5-jaarsoverleving < 30%, terwijl in Japan en Zuid-Korea meer dan 60% van de GC's in een vroeg stadium worden gediagnosticeerd door community-based endoscopische screening met 5-jaarsoverleving > 80% [29], [30]. Hoewel de impact van vroege opsporing van GC door endoscopische screening is significant in Linqu, is er slechts een paar basis van de bevolking screening voor GC in China vanwege de hoge kosten en het gebrek aan geschoolde endoscopists.

GC is een einde gevolg van meertraps maaglesies met verschillende biologische functies, die daartegen GC vroegtijdig detecteren via biomarkers biedt. In onze eerdere studie, vonden we de verhouding van serum PG I /II monotoon af van de ernst van maaglesies echter de gevoeligheid en specificiteit voor het voorspellen geavanceerde gastrische lesies en GC waren slecht [31]. Onlangs accumuleren bewijs aan dat miRNAs spelen een belangrijke rol bij de oncogenese en tumor afgeleide miRNAs kan de circulatie in een opmerkelijk stabiele vorm [11] voeren [32], [33], wat suggereert dat miRNAs kunnen worden gebruikt als nieuwe niet-invasieve biomarkers voor vroege opsporing van GC.

Meer recent een studie geïdentificeerd vier opgereguleerd-GC geassocieerde miRNAs (miR-17-5p, miR-21, miR-106a en miR-106b) [34], die ook weergegeven hogere expressie niveaus in GC serum op ons aanbod, terwijl de opvallende downregulatie van laat-7a in hun studie niet werd waargenomen door ons. Een andere studie wees uit vijf verhoogde serum miRNAs (miR-1, miR-20a, miR-27a, miR-34 en miR-423-5p) in GC patiënten [13], terwijl slechts miR-20a en miR-27a werden opgereguleerd op onze array en miR-27a werd gevalideerd opvallend worden overexpressie in GC patiënten. De gedeeltelijk inconsistente resultaten kunnen de verschillen in soorten monsters geven, screening hulpmiddelen of kwantificatie werkwijzen [35].

Van de drie serum miRNAs geïdentificeerd in onze studie, miR-221 is abnormaal opgereguleerd in weefsels van veel kankerpatiënten types, zoals maag [24], colorectale [21], prostate [36] en borstkanker [37]. MiR-221 kon een post-transcriptioneel onderdrukken p27 en p57, waardoor het gemakkelijker G1 /S fase-overgang en het verbeteren van celproliferatie en tumorgroei [24], [36], [38], [39]. Studies hebben aangetoond dat de expressie van miR-221 in plasma werd geassocieerd met overleving van colorectale kanker [40] en de progressie van prostaatkanker [41]. Slechts enkele onderzoeken hebben de functionele relevantie van miR-376c, zoals miR-376c verkend kon proliferatie, overleving en chemoresistance van eierstokkanker cellen te verbeteren door zich te richten ALK7 [42]. Voor miR-744, de expressie patroon, fysiologische functie en de relatie met carcinogenese zijn niet bekend op dit moment.

In onze huidige studie, vonden we dit panel van drie miRNA kon serummonsters van GC te onderscheiden van de knoppen met een gevoeligheid van 82,4% en een specificiteit van 58,8%. Bovendien, onze studie bleek dat bij 30 beginnende GC patiënten, 22 (73,3%) werden geclassificeerd correct, suggereert dit paneel kan dienen als een biomarker voor de vroege detectie van GC. Het werpt ook de mogelijkheid dat dit panel van miRNAs nuttig als een eerste screening methode voor het GC in de algemene bevolking met een hoog risico van GC kan zijn.

We waren ook geïnteresseerd in het verkennen van de associaties tussen deze drie serum miRNAs en differentiatie soorten GC. Door het vergelijken van miRNA niveaus in serum van GC patiënten met verschillende kwaliteiten, vonden we een hogere serum miRNA expressie in slecht gedifferentieerde GC. Dit resultaat toonde dat hoge expressie van deze miRNAs in serum GC patiënten werd geassocieerd met de vergevorderde GC. Hoewel het mechanisme van dit verschijnsel is onduidelijk, kan het hoge niveau van deze miRNAs in serum bepaalde waarde voor het aangeven van de voortgang en de behandeling selectie van GC hebben.

Verder hebben we onderzocht of dit paneel drie miRNA advanced maag kunnen voorspellen laesies, zoals DYS. We ontdekten miR-221 verschijnt een verhoogde expressie niveau in DYS, suggereert dit paneel was meer specifiek voor GC. Ondanks de beperkte effect van dit gedeelte van DYS detectie, miR-221, een van de drie serum miRNAs, kunnen nuttig zijn voor het identificeren van die DYS proefpersonen met de zeer hoog risico GC zijn. Interessant is dat door prospectief volgen van de evolutie van deze DYS onderwerpen, vonden we het lagere tarief van regressie naar de minder ernstige letsels en één incident GC in de voorspelde hoge risicogroep die hoger niveau van serum miR-221 had (gegevens niet getoond).

op retrospectief onderzoek van de expressie van miRNAs in serum drie prediagnose monsters GC patiënten, vonden we een stijgende trend in GC ontwikkeling en verdere analyse dat dit paneel GC kunnen voorspellen tot 5 jaar voor klinisch GC diagnose. Deze resultaten groot voorstander van de waarde van deze drie miRNAs voor het voorspellen van GC gebeurtenis. De combinatie van deze drie-serum miRNA handtekening met pathologische diagnose kan vroegtijdige opsporing van GC bij patiënten met gevorderde maag laesies, zoals IM en DYS verbeteren.

Om uit te sluiten dat de hogere leeftijd en kortere periode van serummonsters opslag bijgedragen tot hogere miRNAs tijd, analyseerden we miRNA expressie in 82 controles die bloedafname ondergingen tegelijkertijd punten met GC patiënten. Geen significant verschil werd waargenomen tijdens de follow-up periode (gegevens niet getoond), wat suggereert dat de stijgende serum miRNA niveaus gedurende GC verwerking niet kon worden toegeschreven aan de toegenomen leeftijd en de ondersteuning die miRNAs in serum aanwezig in een stabiele vorm zijn. Dienovereenkomstig kan circuleren miRNAs worden gebruikt als biomarker voor een niet-invasieve test voor GC detectie in de toekomst te ontwikkelen vanwege de goede bereikbaarheid, hoge stabiliteit en lage kosten assay.

Ons onderzoek heeft verschillende sterktes. Ten eerste alle vakken kwam uit een hoogrisicopopulatie GC en onderging strenge pathologische diagnose, die onze hypothese gemaakt dat het waargenomen verschil in serum miRNA niveaus tussen GC en controles veelal mogelijk was, zo niet alle, de neoplastische transformatie. Ten tweede, onze basis van de bevolking studie met een hoge nalevingskosten en meer dan 20 jaar follow-up verbeterde de betrouwbaarheid van het onderzoek, en op voorwaarde dat het eerste bewijs op dynamische veranderingen van het serum miRNA's tijdens de GC ontwikkeling en hun potentieel als biomarkers te identificeren hoog-risico individuen van GC.

Deze studie heeft ook een aantal beperkingen. Omdat maar weinig personen met een normale maagslijmvlies werden gediagnosticeerd in deze populatie [17], gebruikten we proefpersonen met SG /mild CAG als controles. Echter, vergeleken met studies met behulp van algemeen normale onderwerpen als controle, onze pathologische diagnose gebaseerde controle selectie strategie verwaterde het verschil tussen patiënten en controles, en kon dus alleen leiden tot de onderschatting van de resultaten. Daarnaast zijn de resultaten van deze eerste studie met een kleine steekproef noodzakelijk verdere bevestiging in grote prospectieve studies en de functionele relevantie van de nieuw geïdentificeerde miRNAs moet verder worden verduidelijkt.

Tot slot, door middel van deze populatie gebaseerde studie we een set van differentiële serum miRNAs (miR-221, miR-376c en miR-744) die in GC en stelde hun potentieel als nieuwe niet-invasieve biomarkers voor vroege opsporing van GC.

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
Serum niveaus van de 16 geselecteerde miRNAs in 14 paren van GC en controle onderwerpen in de eerste fase validatie. De mediane veelvoudveranderingen van miRNA niveaus GC vergelijking met controle kregen en de Wilcoxon tests werden uitgevoerd om het verschil tussen twee groepen onderzocht. De relatieve niveaus van miRNAs (log10 schaal bij Y-as) werden genormaliseerd aan de spiked-in CEL-miR-39
doi:. 10.1371 /journal.pone.0033608.s001
(JPG)
Table S1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0033608.s002
(XLS)

• PLoS ONE: Melk gefermenteerd door Propionibacterium freudenreichii apoptose van HGT-1 menselijke maagkanker Cellen
• PLoS ONE: genetische gevoeligheid op CagA-interagerende moleculen en Gen-omgeving interactie met Fyto-oestrogenen: een mogelijke risicofactor voor Gastric Cancer