PLOS ONE: Identificação do soro MicroRNAs como biomarcadores Novel não invasivos para a detecção precoce de gástrico Cancer

Abstract

Fundo

Para investigar o potencial dos miRNAs séricas como biomarcadores para a detecção precoce de gástrica câncer (GC), um estudo de base populacional foi realizado em Linqu, uma área de alto risco de GC na China.

Metodologia /Principais achados

Todos os indivíduos foram selecionados a partir de dois estudos de coorte grandes . miRNAs diferenciais foram identificados em pools de GC e controle usando um array TaqMan de baixa densidade, e validado em indivíduo de 82 pares de GC e controle, e 46 pares de displasia e controle de reação inversa quantitativa cadeia de polimerase em tempo real. As tendências temporais de expressão miRNA soro identificados foram mais explorado em um estudo retrospectivo em 58 pacientes GC que tiveram pelo menos uma amostra de soro diagnóstico pré-GC com base na população de acompanhamento a longo prazo. Os resultados de perfis de miRNA demonstrou que 16 miRNAs foram significativamente upregulated em pacientes GC relação aos controles. Mais uma validação identificou um painel de três miRNAs séricas (miR-221, miR-744 e miR-376c) como potenciais biomarcadores para a detecção de GC e receptor análise da avaliação de risco operating characteristic (ROC) com base em curva revelou que este painel poderia distinguir GCs dos controles com sensibilidade de 82,4% e 58,8% de especificidade. MiR-221 e miR-376c demonstrada correlação significativamente positiva com pobre diferenciação de GC, e miR-221 exibido nível mais elevado na displasia do que no controle. Além disso, o estudo retrospectivo revelou uma tendência crescente desses três níveis de miRNA durante o desenvolvimento GC ( P Compra de tendência < 0,05), e este painel poderia classificar amostras de soro colhidas até 5 anos antes do diagnóstico GC clínica com 79,3 % de precisão em geral.

Conclusões /Significado

Estes dados sugerem que o soro miR-221, miR-376c e miR-744 têm um forte potencial como biomarcadores não invasivos novos para a detecção precoce de GC.

Citation: Canção meu, Pan Kf, Su Hj, Zhang L, Ma Jl, Li Jy, et al. (2012) Identificação de soro MicroRNAs como novos biomarcadores não invasivos para a detecção precoce do câncer gástrico. PLoS ONE 7 (3): e33608. doi: 10.1371 /journal.pone.0033608

editor: Joseph Califano, John Hopkins Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de novembro de 2011; Aceito: 13 de fevereiro de 2012; Publicado: 14 Março 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Song et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Programa Nacional de Pesquisa básica da China (973 Programa: 2010CB529303), Programa Foresight A3 de Natural Science Foundation da China (30921140311) ea National Science Foundation Natural da China (81.041.012 e 81.171.989). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (GC) é a segunda principal causa de morte por câncer no mundo, com cerca de metade ocorrendo na China [1], [2]. O prognóstico da GC varia de forma significativa pela fase de cancro com a taxa de sobrevivência relativa de 5 anos atingindo 90% na Fase I, mas menos do que 5% em Fase [3] IV. Assim, a detecção precoce de GC é uma medida fundamental para reduzir a mortalidade e melhorar o prognóstico da GC.

Apesar de triagem gastroscópico para GC é altamente confiável, é invasivo e caro, especialmente para os países em desenvolvimento. Portanto, muito esforço tem sido feito para desenvolver testes de rastreio preliminares menos caros em amostras de fácil acesso. No entanto, muitos analitos anteriormente investigados, como pepsinogénio (PG) eu relação /II, antigénio carcinoembrionário (CEA) e antigénio de carbohidrato 19-9 (CA 19-9), não eram suficientemente sensíveis e específicos para o rastreio de GC [3], [ ,,,0],4]. Assim, existe uma necessidade urgente de novos biomarcadores não invasivos para melhorar a detecção precoce de GC.

Os microRNAs (miRNAs) são uma classe abundante de pequenos RNAs não-codificantes que regulam negativamente a expressão de genes por emparelhamento de base com a região 3 'não traduzida do ARNm alvo, resultando em ambos os ARNm ou de clivagem repressão translacional [5], [6]. Evidências crescentes mostrou que miARNs estão envolvidos em vários processos biológicos, incluindo o desenvolvimento, diferenciação celular, proliferação e apoptose [7], e participar na carcinogénese humana como oncogenes ou supressores de tumor [8]. Estudos indicaram que o perfil de expressão de miARN varia entre tipos de tumores e podem diferenciar o cancro e tecidos normais [9], [10]. Recentemente, miARNs circulantes foram sugeridos grande potencial como biomarcadores para muitos cancros, incluindo GC [11] - [16]. No entanto, o valor de miRNAs circulantes na detecção precoce da GC ainda não foi relatado.

Desde 1989, temos realizado uma série de estudos em Linqu County, uma área de alto risco de GC na província de Shandong, China , incluindo um estudo de base populacional coorte de lesões gástricas pré-cancerosas [17], [18], e um estudo randomizado para inibir a progressão de lesões gástricas [19]. Esta coorte nos permite investigar as alterações dinâmicas em níveis circulantes de miRNA durante o desenvolvimento GC, e nos proporciona uma oportunidade única para explorar o potencial dos miRNAs circulantes na detecção precoce da GC.

A seguir, relata os resultados de diferencial miRNAs no soro de GC e displasia (DYS), e um estudo retrospectivo desenhado para avaliar as mudanças dinâmicas durante o desenvolvimento GC.

Materiais e Métodos

desenho do estudo e população

Os detalhes da população do estudo, os procedimentos de exame endoscópico, critérios de histopatologia gástrica e acompanhamento foram descritos em outros lugares [17] - [19]. Resumidamente, uma pesquisa de rastreamento endoscópico foi lançado em 1989 entre 3399 residentes com idades entre 35-64 anos, em Linqu County, uma área de alto risco de GC, e os indivíduos sem diagnóstico de GC foram posteriormente seguiu com o exame endoscópico repetida realizado em 1994 [17 ], [18]. Em 1995, um estudo de intervenção randomizado, controlado por placebo foi iniciada nesta população até 2003, quando exame endoscópico repetida foi realizada [19]. Todos os indivíduos foram submetidos a coleta de sangue em ambas as linha de base e ponto final levantamentos de cada estudo, e alguns com lesões gástricas avançados, como a metaplasia intestinal (IM) ou DYS, também forneceu sangue e receberam exame endoscópico em 1992 e 1999.

no estudo atual, um multi-estágio, aninhado estudo caso-controle de dois grandes grupos foi desenhado para identificar e validar os miRNAs soro diferencial no GC e DYS, e um estudo retrospectivo foi realizado para investigar o potencial de soro candidato miRNAs na detecção precoce de GC (Figura 1).

Este estudo foi dividido em quatro fases graduais. Na fase I, piscinas de soro de 14 pacientes do GC e 14 controles pareados por idade e sexo com o diagnóstico de gastrite superficial (SG) ou leve gastrite atrófica crônica (CAG) foram usadas para gerar perfis de miRNA por análise de matriz. miARNs diferenciais foram identificados, e os miARNs extremamente regulados positivamente ou regulados positivamente miARNs moderadamente com relatórios funcionais ou relacionadas com o biomarcador foram seleccionados para posterior análise. Na fase II, miARNs identificados foram validados utilizando quantitativa de transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase (qRT-PCR) em amostras de soro individuais de 14 GC e controlos que foram utilizados para o teste de matriz em fase I. Na fase III, os miARNs significativamente alterados foram subsequentemente validado em pacientes 68 GC e 46 DYS, bem como os seus controles pareados por idade e sexo. análise da avaliação de risco de operação característica baseada em curva (ROC) foi então realizada entre os 68 pares de controle de GC para avaliar o efeito discriminante de miRNAs soro em GC. Cada indivíduo foi atribuído em ambos os grupos de alto ou baixo risco, comparando os níveis de biomarcadores miRNA expressão aos valores de corte correspondentes derivados de curva ROC. Na fase IV, um estudo retrospectivo foi realizado em 58 pacientes do GC, que forneceu pelo menos uma amostra de soro pré-diagnóstico elegíveis no estudo de acompanhamento de longo prazo, como descrito acima, para explorar a tendência temporal dos potenciais biomarcadores de miRNA e determinar a sua valor na detecção precoce de GC. Todo o estudo foi aprovado pelo Conselho de Pequim Hospital &University Cancer Institutional Review; Instituto e todos os indivíduos deram seu consentimento informado.

O processamento da amostra e RNA extração

Até 5 ml de sangue total de cada participante jejum foi coletado com casos e controles feitos no mesmo ano. As amostras de sangue foram deixadas em repouso durante 30-40 min e soro de separação foi realizada por centrifugação a 965 g durante 15 min. O soro sobrenadante foi recuperado e armazenado a -80 ° C até à análise. O ARN foi isolado a partir de 100 mL de soro utilizando o Kit miRNeasy Mini (Qiagen, Alemanha) seguindo o protocolo do fabricante com pequenas modificações [20]. Para miRNA perfil, duas piscinas foram criados pela combinação das misturas de fase aquosa superior após separação de fases e etanol a partir de pacientes 14 GC (12 do sexo masculino, 2 do sexo feminino; idade, 62 (SD 6,4) anos) e 14 de sexo e controles pareados por idade (idade, 61 (SD 5,9) anos), respectivamente. Após a ligação à membrana de RNeasy mini coluna de centrifugação e lavagem subsequente, o ARN foi eluído com 40 mL de água isenta de RNase. Para todas as experiências qRT-PCR, o RNA extraído a partir de 100 ul de soro foi eluída com 100 mL de água isenta de RNase. Para normalizar a variação de amostra-a-amostra no passo de isolamento de ARN, ATH-miR-159a sintética foram adicionados a cada amostra de soro para miARN perfis enquanto CEL-miR-39 foi adicionado para análise de qRT-PCR, como descrito por Mitchell et al
[11].

Mirna perfis

Mirna profiling foi realizada utilizando TaqMan matriz de baixa densidade a (v2.0) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Esta plataforma de perfil qRT-PCR consiste no cartão de microfluidos um de 384 poços em que 377 miRNAs podem ser analisados ​​em conjunto com três controles endógenos (U6, RNU44 e RNU48) e um controle negativo não relacionados ao ser humano (ATH-miR-159a). Em resumo, o ARN reunidas separadamente a partir de 14 pacientes e controles pareados GC como acima descrito foi transcrito de forma inversa utilizando o kit de transcrição reversa TaqMan miARN e TaqMan miARN ensaios multiplex (RT piscina humano; Applied Biosystems). Para cada conjunto de ARN, 3 ul de ARN total foi adicionada a cada uma das reacções de transcrição reversa multiplex.

Para aumentar a quantidade de ADNc disponíveis para análise, o enriquecimento de genes alvo foi realizada com uma etapa de pré-amplificação. A mistura de reacção de 25 ul consistia em 2,5 l de cDNA diluído combinados com 12,5 ul de TaqMan Mix Master PreAmp (2 ×), 2,5 ul de Megaplex pré-amplificador Primers (10 ×) e 7,5 ul de água livre de nuclease. O passo de pré-amplificação foi realizada num sistema de PCR GeneAmp 9700 (Applied Biosystems) seguindo o protocolo do fabricante.

Para a análise por PCR em tempo real, o produto foi diluída por adição de 75 ul de água isenta de nuclease e 9 ul da mistura diluída foi subsequentemente combinada com 450 ul de TaqMan Universal PCR 2 × master Mix sem uracilo-N-glicosilase e 441 ul de água isenta de nuclease. Depois de carregar 100 ul de cada mistura de piscina em multiplex, a matriz foi centrifugado e selado. A amplificação foi realizada num Applied Biosystems 7900 HT termociclador (Applied Biosystems) utilizando as condições dos ciclos recomendados pelo fabricante. Os dados foram analisados ​​usando RQ Manager Software versão 1.2 e Software DataAssist ™ versão 2.0 (Applied Biosystems). Após a normalização usando o cravado-em Ath-miR-159a, a mudança de níveis de dobragem miARNs em GC em relação ao controlo foi calculada pelo método.

miARN quantificação em tempo real por qRT-PCR

a transcrição reversa foi realizada utilizando o kit TaqMan miARN transcrição reversa e iniciadores de haste-laçada específicos miARN-(Applied Biosystems). A mistura de reacção 7,5-uL consistia em 0,75 ul de 10 x tampão de transcrição reversa, 0,095 ul de inibidor de RNase (20 unidades /ul), 0,075 ul de dNTPs 100 mM com dTTP, 0,5 ul de MultiScribe da transcriptase reversa (50 unidades /ul), 1,5 ul de iniciador, 2,5 ul de RNA, e 2,08 mL de água livre de RNase. A transcrição reversa foi realizada num sistema de PCR profissional T (Biometra, Alemanha) seguindo o protocolo do fabricante.

-PCR em tempo real foi realizada em duplicado e incluiu-molde sem controlos negativos. Para a reacção de 20 ul, o ADNc (3 ul) foi combinada com 10 ul de TaqMan Universal PCR 2 × Master Mix sem uracilo-N-glicosilase, 1 ul da mistura de ensaio TaqMan miARN, e 6 ul de água. A amplificação foi realizada num sistema 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems) seguindo o protocolo do fabricante. Os níveis de miRNAs de expressão foram normalizados ao cravado em cel-miR-39, e foram calculados utilizando o método.

A análise estatística

O emparelhado t
teste foi utilizada para examinar a diferença na média de idade entre os grupos. O teste de Wilcoxon ou o teste de Mann-Whitney foi usado para comparar os níveis séricos de miARN diferentes grupos se for caso disso. Curvas ROC foram estabelecidos para avaliar os efeitos de diagnóstico de miRNAs, eo modelo linear generalizado com medidas repetidas foi utilizado para analisar as tendências temporais dos níveis séricos de miRNA durante o desenvolvimento GC após transformação logarítmica. Todos os P valores
eram de dois lados e inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o Statistical Package for the Social Sciences (SPSS 13.0, Chicago, IL).

Resultados

características Assunto

Um total de 82 pacientes do GC, 46 indivíduos com DYS, e 128 controles com SG ou CAG leve foram incluídos neste estudo. Como mostrado na Tabela 1, não houve diferença significativa na idade entre pacientes com GC ou DYS e seus controles correspondentes ( P
= 0,329 e 0,214, respectivamente).

Mirna profiling

Os miRNAs diferencialmente expressos foram identificados em pools de 14 GCs e 14 controles usando matriz de baixa densidade TaqMan. Entre 377 miRNAs analisados, 99 apresentaram > 2 vezes regulada e 40 mostrou < 0,5 vezes mudanças reprimidos em conjunto de soros GC (Tabela S1). Dezesseis miRNAs regulados positivamente (MIR-221, miR-744, miR-376c, miR-191, miR-27a, deixe-7e, miR-27b, miR-222, miR-21, miR-18a, miR-19a, miR- 17, miR-106b, miR-106a, miR-20a e miR-155), demonstrando as mudanças de expressão notáveis ​​no soro GC e ter relatórios expressão funcional ou diferenciais no tecido GC foram selecionados como candidatos para a validação de um punho fase [21] - [28]

primeira fase de validação

As manifestações de 16 miRNAs candidatos foram medidos em amostras de soro individuais de 14 GCs e controles que foram usados ​​para o teste de matriz.. Consistentemente com os resultados de perfis, todos os 16 miRNAs apresentaram níveis mais elevados no grupo GC do que no grupo controle (Figura S1). Entre eles, 9 miRNAs séricas (miR-221, miR-744, miR-376c, miR-191, miR-27a, deixe-7e, miR-27b, miR-222 e miR-21) teve > 2 vezes média mudança no grupo GC comparado ao grupo controle ( P Art < 0,05), e assim foram escolhidos para posterior validação

validação segunda fase

foi examinada a 9 miRNA. expressões em um grande conjunto de soro de 68 pares de GC e controle. Como mostrado na Figura 2, 8 dos 9 miRNAs (MIR-221, miR-744, miR-376c, miR-191, miR-27a, deixe-7e, miR-27b, e miR-222) demonstraram níveis significativamente elevados no grupo GC com mais de 2 vezes a mudança ( P Art < 0,05)., e esses miRNAs foram selecionados para as seguintes análises

a avaliação de risco dos casos GC usando um painel de miRNAs

para avaliar o efeito discriminante de miRNAs soro no GC, curvas ROC foram estabelecidos para cada um dos 8 miRNAs usando 68 pares de GC e controle na validação do segundo estágio (Figura 3). Os resultados revelaram que miR-744, miR-376c, miR-221 e deixe-7e produziram as maiores áreas sob as curvas ROC (AUCs) e podem ter o potencial como biomarcadores para a detecção de GC.

A avaliação de risco com base nas quatro miARNs foi usada para distinguir amostras de soro de casos de GC dos controlos. Para cada miRNA, nós em primeiro lugar calculado o valor de corte ideal do nível de expressão relativa (miR-744: 5,49 × 10 ^{-4; miR-376c: 6,05 × 10 -4; miR-221: 1,47 × 10 -3; deixá-7e: 1,61 × 10 -3), em que o índice do Youden (sensibilidade + especificidade-1) para o diagnóstico de GC foi maior na curva ROC. Em seguida, divididos do sujeito em um grupo de alto risco, que representa o processo de GC possível, quando o nível de soro de qualquer um dos quatro miARNs foi igual ou maior do que o valor de corte correspondente, e um grupo de baixo risco, que representa o controle , quando os níveis séricos de todos os quatro miRNAs foram menores que os valores de corte.}

de acordo com este critério de avaliação, 56 GCs e 32 controles foram corretamente previstos como GC e não-GC casos, produzindo a sensibilidade de 82,4% ea especificidade de 47,1%. Desde let-7e demonstrou o menor valor e mais vasto intervalo de confiança de AUC entre os quatro miRNAs na análise da curva ROC (Figura 3), que repetiu a avaliação de risco acima após a exclusão de deixá-7e e obteve uma maior especificidade (40/68, 58,8 %), enquanto que a sensibilidade manteve-se inalterada, indicando que a contribuição de deixar-7e para diferenciar GC de controlo foi desprezável, e o painel de três miARN (miR-221, miR-376c e miR-744) era a combinação mais eficiente de biomarcadores para o diagnóstico de GC.

para examinar ainda mais o potencial deste painel para detecção precoce de GC, avaliou um subgrupo de 30 pacientes GC na fase inicial, e 22 foram previu corretamente como casos GC com a sensibilidade de 73,3% .

Associação entre miRNA do soro de expressão e diferenciação graus de GC

Além disso, procurou-se investigar a correlação entre os níveis de expressão de miR-221, miR-744 e miR-376c, e graus de diferenciação de GC. Como mostrado na Figura 4A-C, todos os três miARNs apresentaram maiores níveis de soro em grupo GC pouco diferenciado (43 GCs incluindo 29 do sexo masculino e 14 do sexo feminino; idade, 60 (SD 8,3) anos) do que o grupo GC no bem ou moderadamente diferenciado (24 GCs incluindo 19 do sexo masculino e 5 do sexo feminino; idade, 60 (DP 6,2) anos). Entre eles, o soro miR-221 e miR-376c demonstrada correlação significativamente positiva com pobre diferenciação de GC ( P
= 0,006 e 0,004, respectivamente).

Os níveis de expressão de biomarcadores miRNA do soro em indivíduos com DYS

Para elucidar ainda mais a relevância destas três miRNAs com lesão pré-maligna gástrica, examinamos suas expressões em 46 pares de DYS e controle. Como mostrado na Figura 4D-F, um nível significativamente elevado de miR-221 foi encontrada no grupo DYS quando comparados aos controles ( P
= 0,027), enquanto nenhuma diferença significativa foi encontrada para miR-376c ou miR- 744. Outras análises de avaliação de riscos de acordo com procedimentos previamente estabelecidos revelou que este painel de três miRNA poderiam distinguir DYS de controle com a sensibilidade de 56,5% e especificidade de 47,8%.

As mudanças dinâmicas de biomarcadores séricos de miRNA durante o desenvolvimento GC

no estudo retrospectivo, as mudanças dinâmicas dos três biomarcadores séricos de miRNA foram detectadas em 58 pacientes GC que foram divididos em quatro grupos de acordo com o intervalo de tempo de coleta de sangue para o diagnóstico GC: pré-diagnóstico 2-5 anos , 6-9 anos, grupos de 10-14 anos e ≥15 anos (Tabela 2). Alguns assuntos podem existir simultaneamente em dois ou mais de dois grupos, uma vez que forneceu amostras de soro em vários pontos de tempo do período de acompanhamento.

Conforme mostrado na Figura 5A, todos os três miRNAs soro exibido marcadamente aumento da expressão durante a GC desenvolvimento, excepto ligeiro aumento de soro de miR-744 no grupo de pré-diagnóstico ≥15 anos. Além disso teste de tendência mostrou uma tendência linear estatisticamente significativa nos três níveis de miRNA entre 20 pacientes GC que contribuíram três amostras de soro em diferentes momentos durante o período de acompanhamento (Figura 5B).

Finalmente, avaliamos o potencial de biomarcadores miRNA para detecção precoce do GC em 29 pacientes, que forneceram amostras de soro em 2-5 anos antes do diagnóstico GC. De acordo com o critério de avaliação de risco estabelecido antes, 23 dos 29 pacientes do GC (79,3%) foram corretamente classificados como os casos GC representado por este painel miRNA três soro.

Discussão

O objetivo deste estudo foi identificar os miRNAs diferenciais no soro de GC e DYS, e investigar o potencial dos miRNAs séricas como biomarcadores para a detecção precoce de GC. Achamos que os níveis significativamente elevados de soro de miR-221, miR-376c e miR-744 em pacientes GC através de um rastreio à base de microarray sistemática e validação de duas fases. Este painel miRNA três soro podia distinguir GCs dos controles e mostrou uma tendência de aumento durante o desenvolvimento GC. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo de base populacional em explorar as mudanças dinâmicas de miRNAs no soro associados a GC e seus precursores em uma área de alto risco de GC.

A incidência de GC varia muito em todo o mundo com as maiores taxas ocorrendo no leste da Ásia, incluindo Japão, Coréia e China [1], [2]. Na China, a maioria dos GCs são diagnosticados em estágios avançados, resultando em mau prognóstico, com uma taxa de sobrevivência média de 5 anos < 30%, enquanto no Japão e Coréia mais de 60% dos GCs são diagnosticados em estágio inicial por triagem endoscópica baseada na comunidade com taxa de 5 anos de sobrevida > 80% [29], [30]. Embora o impacto da detecção precoce do GC por triagem endoscópica é significativo em Linqu, houve apenas alguns rastreio populacional para GC na China devido ao alto custo e à falta de endoscopistas especializados.

GC é um fim resultado de lesões gástricas em várias fases com diferentes características biológicas, o que proporciona uma oportunidade para detectar GC na fase inicial, utilizando biomarcadores. No nosso estudo anterior, verificou-se a proporção de soro PG I /II diminuiu monotonicamente com a gravidade das lesões gástricas, no entanto, a sensibilidade e especificidade para predizer lesões gástricas avançada e GC foram pobre [31]. Recentemente, evidências acumuladas indicam que miARNs desempenham papéis importantes na oncogénese, e miARNs derivadas de tumor podem entrar na circulação numa forma extraordinariamente estável [11], [32], [33], sugerindo que miARN pode ser utilizado como um novo não-invasiva biomarcadores para a detecção precoce de GC.

Mais recentemente, um estudo identificou quatro miRNAs associados a GC regulada (miR-17-5p, miR-21, miR-106a e miR-106b) [34], que também exibido níveis de expressão mais elevados no soro GC na nossa matriz, enquanto que a regulação negativa impressionante de deixá-7a em seu estudo não foi observado por nós. Outro estudo descobriu cinco miRNAs séricos elevados (MIR-1, miR-20a, miR-27a, miR-34 e miR-423-5p) em pacientes GC [13], enquanto que apenas miR-20a e miR-27a foram regulados positivamente em nosso array, e miR-27a foi validado para ser notavelmente sobre-expressos em pacientes GC. Os resultados parcialmente inconsistentes pode refletir as diferenças de tipos de amostras, triagem ferramentas ou métodos de quantificação [35].

Entre os três miRNAs soro identificados em nosso estudo, miR-221 foi encontrado anormalmente regulada positivamente em tecidos de muitos câncer tipos, tais como gástrica [24], colorrectal [21], da próstata [36] e do cancro da mama [37]. MiR-221 poderia pós-transcricional p27 Repressão e p57, facilitando assim a transição de fase G1 /S e aumentando a proliferação celular e crescimento do tumor [24], [36], [38], [39]. Estudos têm mostrado que o nível de expressão de miR-221 no plasma foi associada com a sobrevivência global de cancro colorrectal [40] e a progressão do cancro da próstata [41]. Apenas alguns poucos estudos exploraram a relevância funcional do miR-376c, como miR-376c pode aumentar a proliferação, sobrevivência e chemoresistance de células de cancro do ovário, visando ALK7 [42]. Para miR-744, seu padrão de expressão, a função fisiológica e relacionamento com a carcinogênese são desconhecidas no momento.

Em nosso estudo, encontramos este painel de três miRNA poderiam distinguir amostras de soro de GC dos controles com uma sensibilidade de 82,4% e especificidade de 58,8%. Além disso, nosso estudo indicou que, entre os 30 pacientes do GC em estágio inicial, 22 (73,3%) foram corretamente classificados, sugerindo este painel pode servir como um biomarcador para a detecção precoce de GC. Ele também levanta a possibilidade de que este painel de miRNAs pode ser útil como um método de triagem preliminar para GC na população em geral em alto risco de GC.

Nós também estávamos interessados ​​em explorar as associações entre estes três miRNAs soro e diferenciação graus de GC. Ao comparar os níveis de miRNA no soro de pacientes GC com vários graus, encontramos uma expressão miRNA do soro maior em GC pouco diferenciado. Este resultado revelou que o elevado nível destes miARNs no soro em pacientes GC expressão foi associada ao estágio avançado de GC. Embora o mecanismo desse fenômeno é claro, o alto nível destes miRNAs no soro pode ter algum valor para indicar a seleção progressão e tratamento de GC.

Nós ainda avaliado se este painel de três miRNA poderiam prever gástrico avançado lesões, como DYS. Encontramos apenas miR-221 exibido um nível de expressão elevado em DYS, sugerindo deste painel foi mais específico para o GC. Apesar do efeito limitado deste painel sobre a detecção DYS, miR-221, um dos três miARNs soro, pode ser útil para identificar esses DYS sujeitos ao risco extremamente elevado de desenvolvimento de GC. Curiosamente, por prospectivamente acompanhando a evolução desses DYS assuntos, encontramos a menor taxa de regressão para as lesões menos graves e GC um incidente no grupo de alto risco previu que apresentaram maior nível de soro de miR-221 (dados não mostrados).

ao examinar retrospectivamente a expressão de três miRNAs soro em amostras de pré-diagnóstico de pacientes GC, encontramos uma tendência de aumento durante o desenvolvimento GC, e posterior análise indicou que este painel poderia prever GC até 5 anos à frente da clínica diagnóstico GC. Estes resultados apoiou fortemente o valor desses três miRNAs para a previsão de ocorrência GC. Combinando esta assinatura miRNA três soro com diagnóstico patológico pode aumentar a detecção precoce de GC em indivíduos com lesões gástricas avançados, como mensagens instantâneas e DYS.

Para descartar a possibilidade de que o aumento da idade e mais curto período de armazenamento das amostras de soro contribuiu para maior nível de miRNAs ao longo do tempo, analisamos a expressão miRNA em 82 controles que foram submetidos a coleta de sangue nos mesmos pontos de tempo com pacientes do GC. Não foi observada diferença significativa durante o período de seguimento (dados não mostrados), sugerindo que os níveis séricos de miARN crescentes ao longo do desenvolvimento de GC não pode ser atribuído ao aumento da idade e de suporte que miARNs estavam presentes no soro de uma forma estável. Assim, miRNAs circulantes pode ser usado como um biomarcador para desenvolver um teste não-invasivo para detecção GC no futuro devido à sua fácil acessibilidade, alta estabilidade e baixo custo ensaio.

O nosso estudo tem vários pontos fortes. Em primeiro lugar, todas as disciplinas veio de uma população de alto risco de GC e foram submetidos a diagnóstico patológico rigorosa, o que justifica a nossa hipótese de que a diferença observada nos níveis de miRNA séricos entre GCs e controles poderia ser atribuído, principalmente, se não todos, à transformação neoplásica. Em segundo lugar, o nosso estudo de base populacional com um elevado grau de cumprimento e mais de 20 anos de follow-up aumentado a credibilidade do estudo, e forneceu a primeira evidência de mudanças dinâmicas de miRNAs séricos durante o desenvolvimento GC, bem como o seu potencial como biomarcadores para identificar indivíduos de alto risco de GC.

Este estudo também tem algumas limitações. Porque muito poucos indivíduos foram diagnosticados com mucosa gástrica normal, nesta população [17], usamos indivíduos com SG CAG /leve como controles. No entanto, em comparação com estudos utilizando temas geralmente normais como controle, a nossa estratégia de seleção de controle patológico baseado no diagnóstico diluída a disparidade entre casos e controles, e, portanto, só poderia causar a subestimação dos resultados. Além disso, os resultados deste estudo preliminar com pequeno tamanho da amostra necessitam de mais uma confirmação em grandes estudos prospectivos e a relevância funcional do miRNAs recém-identificado precisa de ser clarificado.

Em conclusão, através deste estudo de base populacional identificamos um conjunto de miRNAs soro diferenciais (miR-221, miR-376c e miR-744) no GC e propôs o seu potencial como biomarcadores não invasivos novos para detecção precoce de GC.

Informações de Apoio
Figura S1. níveis séricos
dos 16 miRNAs selecionados em 14 pares de GC e controles na validação da primeira fase. A média de vezes mudanças de níveis de miRNA comparando GC com controle foram dados e os testes de Wilcoxon foram realizados para examinar a diferença entre dois grupos. Os níveis relativos de miRNAs (escala log 10 no eixo Y) foram normalizados para a cravado em cel-miR-39
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Tabela S1.
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