PLoS ONE: Tonic og phasic kontraksjon av glatt muskulatur er ikke regulert ved PKCα - KPI-17 Pathway i Swine mage antrum og Fundus

Abstract

Regulering av myosin lett kjede fosfatase (MLCP) via protein kinase C ( PKC) og den 17 kDa PKC-inhibitor forsterkes av myosinlettkjedefosfatase fosfatase (KPI-17) er blitt rapportert som en Ca ^{2+ sensibilisering signalveien i glattmuskel (SM), og kan således være involvert i tonic vs. phasic sammentrekninger. Denne studien undersøkte protein uttrykk og romlig-temporal fordeling av PKCα og KPI-17 i intakte SM vev. KCl eller karbakol (CCH) stimulering av tonic mage fundus SM genererer en vedvarende sammentrekning mens phasic mage antrum genererer en forbigående sammentrekning. I tillegg tonic fundus genererer større relativ styrke enn fasisk antrum med 1 uM forbol-12, 13-dibutyrate (PDBu) stimulering som er rapportert å aktivere PKCα - CPI-17 reaksjonsveien. Western blot-analyser viste at dette kontraktile forskjellen ikke var forårsaket av en forskjell i protein uttrykk for PKCα eller KPI-17 mellom disse to vev. Immunhistokjemiske resultater viser at fordelingen av PKCα i de langsgående og sirkulære lag av fundus og antrum ikke varierer, idet hovedsakelig er lokalisert nær SM celleplasmamembranen. Stimulering av enten vev med en mikrometer PDBu eller 1fiM CCH endrer ikke dette perifert PKCα distribusjon. Det er ingen forskjeller mellom disse to vev på KPI-17 distribusjon, men i motsetning til PKCα distribusjon, vises KPI-17 til å bli diffust fordelt over hele cytoplasma under de mindre vev forhold, men skifter til et primært perifer fordeling på plasmamembranen med stimulering av vev med 1fiM PDBu eller 1fiM CCH. Resultater fra dobbel merking viser at hverken PKCα eller CPI-17 ko-lokalisering ved adherens kobling (vinculin /Talin) på membranen, men de har samtidig lokalisere med hverandre og med caveoli (caveolin) på membranen. Denne mangelen på forskjellen tyder på at PKCα - KPI-17 veien er ikke ansvarlig for tonic vs. phasic sammentrekninger observert i magen fundus og antrum}

Citation: Zhang Y, Hermanson ME, Eddinger TJ (2013) Tonic. og phasic kontraksjon av glatt muskulatur er ikke regulert ved PKCα - KPI-17 Pathway i Swine mage antrum og Fundus. PLoS ONE 8 (9): e74608. doi: 10,1371 /journal.pone.0074608

Redaktør: Wenhui Hu, Temple University School of Medicine, USA

mottatt: 13 mars 2013; Godkjent: 04.08.2013; Publisert: 18.09.2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (NSF), Biological Sciences Department og Graduate School, Marquette University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

mekanismen (e) bestemme tonic (vedvarende) vs. phasic (forbigående) glatt muskulatur (SM) kontraksjoner forblir uløst. Diverse innervasjon og sirkulerende signalmolekyler i tillegg til unike reseptor og protein (isoform) uttrykk og intracellulære signalveier komplisere saken. Ikke uventet er det flere forslag til hypoteser for å forklare tonic kraft vedlikehold i SM inkludert: slowly- eller ikke-sykling glatt muskulatur myosin cross-broer som kalles klinke broer [1], [2], [3], [4]; rekruttering av ikke-muskel myosin II [5], [6], [7]; dannelse av caldesmon eller calponin avhengige aktin-myosin til-tverrbindinger [8], [9]; dannelse av cytoskeletal styrkebærende strukturer [10], [11], [12]; og regulering av myosin LC _{20 fosforylering via andre messenger-veier som påvirker myosin lettkjede-kinase (MLCK) og myosin lettkjede-fosfatase (MLCP) aktivitet [13], [14], [15], [16], [17] , [18]. Denne siste kategorien er av interesse på grunn av den rapporterte differensial uttrykk, lokalisering og regulering av disse andre messenger proteiner i ulike SM vev. Variabel regulering av MLCK og MLCP aktivitet kunne gi ikke bare et middel for Ca ^{2+ sensibilisering, men også en mulig mekanisme for tonic vs. phasic sammentrekning. Inaktivering av MLCP via PKCα -CPI-17 reaksjonsveien ville tillate for opprettholdt høy myosin lettkjede (MLC 20) fosforylering og således et vedvarende sammentrekningskraft. En unnlatelse av å inaktivere MLCP vil redusere MLC 20 fosforylering og kraft, noe som resulterer i en forbigående sammentrekning. Mage fundus SM genererer en tonisk (vedvarende) sammentrekning mens mage antrum SM genererer et fasisk (forbigående) sammentrekning som reaksjon på en rekke stimuli.}}

Ca ^{2+ sensibilisering, som innebærer aktivering av G- protein-koblede andre messenger trasé som sensitize kontraktile proteiner til [Ca 2 + _{i] ved å hemme MLCP, kan forekomme ved noen av mange veier. En av de rapporterte trasé for inhibering av MLCP aktivitet omfatter proteinkinase C /C-kinase aktivert PP1 inhibitor protein på 17 kDa (PKC /CPI-17) veien [19], [20]. G-protein koblet reseptor (GCPR) aktivering resulterer i aktivering av fosfolipase C (PLC), hydrolyserer fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP 2) for å fremstille inositol 1,4,5-trisphosphate (IP 3) og diacylglycerol (DAG). DAG er kjent for å aktivere PKC som kan føre til fosforylering av KPI-17 til selektivt hemme MLCP (vurdering for visceral SM i [17]). PKC er antatt å være regulert av aktiveringen og romlig fordeling i cellen, idet de sistnevnte styres ved hjelp av forankring proteiner som binder seg til og begrense plasseringen av PKC til spesifikke regioner i cellen [21], [22]. For eksempel, rapporter om konstitutivt aktiv L-type Ca 2 + kanaler og deres regulering av PKC [23], [24] tyder på at PKC er lokalisert nær membranen i glatte muskelceller. Den cellulære funksjon av KPI-17 i cellen kan variere avhengig av nivået av protein uttrykk og om det ligger i nærheten av plasmamembranen hvor PKCα ligger /aktivert, eller i forbindelse med de kontraktile myosin tykke filamenter hvor MLCP ville bli plassert for å de -phosphorylate myosin lett kjede 20 (MLC 20).}}

uttrykk for PKCα og KPI-17 og deres romlige-temporal re-distribusjon på vev aktivering er foreslått i Ca ^{2 + allergi av glatte muskler (for vurdering [14], [15], [16], [17]). Således er det mulig at forskjeller i deres ekspresjon og cellulær lokalisering /trans kan være involvert i å bestemme tonisk vs. fasisk kontraktile responser. For disse to proteinene til å være en del av en vei som er involvert i å hemme MLCP aktivitet under vev aktivering, og dermed forårsaker en tonic eller phasic respons, de trenger å bli uttrykt på riktig nivå og plassert på riktig sted i cellen på riktig tidspunkt. Fordi PKC aktiveres med DAG (en membranbundet fosfolipid), må det også være i membranen i det minste temporært for at dette skal skje. Og hvis CPI-17 kommer til å inhibere MLCP fra dephosphorylating MLC _{20 på den tykke filamenter, CPI-17 på et bestemt tidspunkt må være i cytosol i forbindelse med tykke filamenter stede der. Med disse to trinn som forekommer i to romlig adskilte regioner av cellen, en eller begge av disse proteinene har til translocate til den andre regionen for dem å interagere og fullføre reaksjonsveien.}}

Hensikten med denne studien var å teste hypotesen om at PKCα - KPI-17 Ca ^{2 + allergi veien er involvert i å bestemme tonic (vedvarende) og phasic (forbigående) kontraktile responser i glatt muskulatur. For å gjøre dette bestemt vi protein uttrykk og romlig-temporal fordeling av PKCα og KPI-17 i phasic mage antrum og tonic mage fundus under de mindre og aktiverte forhold. Resultatene viser ingen signifikante forskjeller i uttrykket av en av disse to proteiner, og heller ikke i deres perifere fordelingen mellom disse to vev er i strid med hypotesen om at PKCα- KPI-17 Ca 2 + allergi veien er den avgjørende faktoren for tonic vs. phasic kontraktile responser observert i disse vevene.}

Metoder

organ og vev håndtering

svin vev (magene) ble hentet fra Hansen Kjøtt Tilbud (Franks, WI) og sette i kald fysiologisk saltløsning (PSS, (i mM): 140,1 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 Na _{2HPO 4, 2,0 MOPS (pH 7,4), 0,02 Na 2EDTA, 1,2 MgSO 4, 1,6 CaCl 2, og 5,6 glukose). Magene ble renset fra blod, løst bindevev, og i noen tilfeller, slimhinner, og fryses umiddelbart eller lagres i PSS i kjøleskap i 0-2 dager. Noen organer var frisk frosset så snart som mulig etter obduksjon (60-90 minutter). Enkelte organer ble inkubert i PSS og /eller stimulert med 1,0 uM CCH eller PDBu (Sigma) ved 37 ° C i forskjellige tidspunkter før frysing. Variable inkubasjonstider og agonist-konsentrasjoner ble også testet. For immunhistokjemi alle vev ble lagret frosset inntil seksjonert og immunologisk. Frysing i alle tilfeller involverte å plassere stykker av vev eller vev strimler i isopentan avkjølt i flytende nitrogen, fulgt av lagring ved -80 ° C. Fem til seks mikrometer deler av den frosne vev ble kuttet på en Leica CM1900 cryostat, plukket opp på objektglass og lagringstid (0-1 dager) til immunologisk.}

Immunoreaksjoner og reagenser

antistoffer som ble anvendt ble oppnådd fra følgende kilder: PKCα (H-7 og C-20) og CPI-17 (H-60) fra Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA; Vinculin og Talin fra Sigma, Saint Louis, Missouri; Caveolin en fra BD Biosciences, San Jose, CA; Cy2 og Cy3 esel anti mus eller kanin sekundære er fra Jackson Immunoresearch, West Grove, PA; Alexa Fluor 594-phalloidin og DAPI fra Molecular Probes, Eugene, OR. Alle disse antistoffer er blitt brukt tidligere i vårt laboratorium for immunhistokjemi og western-blotting, hvor de viser spesifisitet for et bånd med den riktige molekylvekt for det respektive proteinet indikerte [25], [26], [27]. Negative kontroller hvor det primære antistoff ikke er inkludert viser ingen reaktivitet for disse båndene og ikke immunfluorescens på vevssnitt.

Fryse vevssnitt plukket opp på objektglass ble tint ved romtemperatur og deretter fiksert med 2% paraformaldehyd i 10 minutt, permeabiliserte i 0,5% Triton X-100 i 10 minutter og blokkert med 5 mg /ml BSA i 1 time forut for reaksjon med det primære antistoff over natten (4 ° C) og deretter det passende sekundære antistoff i en time ved romtemperatur. Etter at det sekundære antistoff, ble vevene inkubert med DAPI (0,5 uM), phalloidin (10-50 nM) eller DAPI /phalloidin som passer for farging kjerner og /eller trådformede aktin. Flere vaskinger ble anvendt følgende primære og sekundære inkubasjoner, og kontra. Dekkglass ble montert ved hjelp av bufret 75% glyserol med 0,2% n-propyl gallate å redusere falming. Alle immunoreagerende løsninger ble gjort i PBS-Tween [(i g /liter: NaCl 8,0, KH _{2PO 4 0.2, Na 2HPO 4 1.15, KCl 0,2,), 1% tween- 20, pH 7,4] med 0,1% BSA. Negative kontroller inkludert 0,1% BSA uten primære antistoff, og viste ingen immunoreaksjon.}

Mikros

Avsnitt ble observert ved hjelp av et Olympus IX70 mikroskop med epifluorescence belysning. Digitale bilder ble tatt med en 16 bit Princeton Instruments (Princeton, NJ) CCD-kamera, kontrollert gjennom et PCI-kort via IPLab for Windows på en PC (Ver 3.6, Scanalytics;. Fairfax, VA). Bilder ble tatt ved hjelp av enten en 100 × (1,3 NA) eller 60 × (1,25 NA) olje linse eller en 40 × (0,9 NA) luft linse og lagret på PC-en. Emisjonsfiltre som ble brukt var 405, 490 og 570 nm. Snittene ble også sett ved hjelp av et Nikon konfokal mikroskop (Nikon A1 konfokal Eclipse Ti). Målene som ble brukt var 100 × (1,4 NA) olje linse på 425, 488 og 561 nm. Lignende resultater ble observert i immunofluorescens-fordelinger ved hjelp av disse to forskjellige systemer.

Image Analysis of Distribusjon av PKC /CPI-17 av individuelle celler i vev

Profiler av fluorescens-intensitet ble tatt for individuelle celler i tverr vevssnitt. Snittene ble observert ved lav forstørrelse (10-20x) for å unngå områder med synlige artefakter (folding vev, fryseskade, etc). I en gjenstand fritt område forstørrelsen ble økt til 40-100x, og bildene ble tatt på disse høyere forstørrelser. Tre forskjellige områder innenfor en vev seksjon ble valgt til å ta bilder. Z-stabel serie ble tatt individuelt for hver av de tre fargekanalene som brukes. 1 mikrometer tykke Z seksjoner ble tatt, og 15-25 Z-snitt ble tatt for hvert vev seksjon (figurene S1 &Co. S2 viser Z-stack eksempler på KPI-17 immunoreaktivitet i antrum med og uten vev aktivering). Hver Z stabel serien ble undersøkt for hver del for å identifisere sentrum z bildet, og dette bildet ble konvertert til a.bmp fil, som ble importert til NIS-Elements AR 3.0 (Nikon) på en PC for å analysere dataene.

Profiler av PKCα og Phalloidin fluorescens intensitet ble oppnådd for individuelle celler i tverr vevssnitt. En linje ble trukket tvers over midten av bildefeltet. Ti-celler som krysses av linjen ble valgt for målingene. Basert på våre tidligere protokoller [25], de første fem piksler (~0.7 mikrometer) på hver side av cellen der phalloidin intensiteten økte kraftig fra baseline ble definert som periferien av cellen. For cytosoliske målinger, ble en linje plassert på minst 2 um bort fra cellen periferien. Intensitetsmålinger ble foretatt ved bruk av et område av interesse (ROI) omtrent på midten av cellen (for cytosoliske mål), eller langs cellens membran (for perifere målinger). For konsistens, blir størrelsen av ROI holdt konstant i de perifere og cytosoliske målinger. Celler i den delen med meget liten diameter (ikke i stand til å måle cytosolisk avkastning på minst 2 um fra periferien) eller med kjerner tilstede (synlig DAPI farging hvor romlige begrensninger og perinukleære organeller kan forvirre fordeling) ble ekskludert fra analysen. For PKCα, ble forholdet mellom den gjennomsnittlige intensitet av PKCα ved periferien i den totale PKCα intensitet (sum av PKCα intensitet fra ROI ved periferien og ROI i cytosol) anvendt. Ti celler pr feltet og tre forskjellige områder ble utsatt for måling av data analyse for hvert vev region, dvs. tretti celler ble tellet, og gjennomsnitt av for hver prøve (n = 1). Den endelige prøvestørrelse ble n = 5.The samme prosedyrer ble anvendt for å måle intensiteten av CPI-17, bortsett fra at bare ett felt av 10 celler ble anvendt for hver prøve (n = 1), med en endelig prøvestørrelse på n = 3.

Mekaniske Målinger

Umiddelbart før bruk, ble vev strimler skåret og festet i hver ende, med klemmene sikret mellom kroker på en stasjonær metallstang og en isometrisk kraft svinger (Harvard Apparatus, Holliston, MA), i PSS boblet med 95% O _{2/5% CO 2 i vannkappe muskel kamre (Radnóti Glass Technology, Monrovia, CA) ved 37 ° C. Lengden av hver strimmel ble variert ved å reposisjonere den stasjonære metallstang.}

glatt muskelvev strimler (mage antrum og fundus) ble ekvilibrert i 1 time og strukket til en passiv spenning tilnærmet Lo ved hjelp av en forkortet lengde-strekk kurve . Til kontrakt vev, ble PSS erstattet med K ^{+ - PSS (109 mM KCl erstattes iso-osmotisk for NaCl) [28]. Muskelstrimler ble aktivert gjentatte ganger med strekking av vevet mellom hver aktivering, inntil toppkraften ikke lenger viste en signifikant økning i forhold til den foregående sammentrekning. Chambers ble spylt tre ganger med PSS etter hvert vev aktivering. Minst to repeterbare suksessive K + - PSS kontraksjoner ble brukt for å få en standard kraft spor med en 10 minutters hvile mellom hver sammentrekning før start av eksperimentet. De vev ble deretter aktiveres med en mikrometer karbakol og avslappet igjen, som ble utført i løpet av K + - PSS sammentrekninger. Følgende sammentrekninger alle inkluderte 1 uM fentolamin og propranolol for å blokkere α- og β - adrenerge reseptorer, respektivt. Etter den siste 1fiM CCH sammentrekning og vaske, ble vevene aktivert med en mikrometer PDBu å spille inn sin mekaniske respons.}

Analyse av Force data

Spennings signaler fra krafttransdusere ble digitalisert av PowerLab 400 eller 4 SP maskinvare (ADInstruments, Castle Hill, Australia) visualisert på en dataskjerm (Figur v3.6 eller 4.0, ADInstruments) som force (g) ved 10 Hz og lagret av programvare kommandoen til en harddisk for senere analyser. Tallene ble gjort med regnearkprogram Excel 2000 (Microsoft, Redmond, Washington).

Gel elektroforese og Western blotting

Protein uttrykket ble analysert som beskrevet tidligere [29]. Vevene ble homogenisert ved 50 mg /ml i 0,125 M Tris, 2% natrium-dodecylsulfat (vekt /volum), 20% glycerol, 0,1% bromfenolblått (vekt /volum) og 20 mM ditiotreitol. Proteinene ble gjenoppløst på lav kryssbindings natriumdodecylsulfat-geler [30] og immunblotting ble utført som tidligere beskrevet [31]. Den PKCα antistoff anerkjent enten en enkelt band eller oftere en dublett på ~76 kD mens KPI-17 antistoffet anerkjent et enkelt bånd på ~17 kD. Disse størrelsene er i overensstemmelse med den forventede størrelse for disse proteinene basert på gel mobilitet. For å sikre nøyaktigheten av vestlige blotter ble lastekurver gjort for både mage fundus og antrum prøver i løpet av en 5-fold spekter av belastninger (4-20 ul) i aktin (Coomassieblå flekker) og PKCα og KPI-17 (western blotting) . Resultatene viste et lineært forhold over dette området for alle tre proteiner fra begge vevene (R ^{2 > 0,98 for alle resultater, n = 3). Kvantifisering av PKCα og KPI-17 protein uttrykk ble gjort på vestlige blotter bruker 5-10 mikroliter belastninger som var innenfor denne lineære området (n = 6).}

statistikker

statistiske sammenligninger ble utført ved hjelp av MINITAB (Minitab Inc. State College, PA). En én prøve t-test ble anvendt for å teste fordelingen av PKCα /CPI-17 (et perifert i forhold til total avkastning innhold på 0,5 indikerer en "uniform" fordeling i glatte muskelceller (SMC)) i antrum og fundus i henhold til hviletilstand. En måte ANOVA ble utført for å teste for PKC /KPI-17 distribusjons forskjeller for de to vev med forskjellige stimulerende parametere. To eksempler på t-tester ble brukt til å teste betydningen av forskjell for uttrykk nivå PKCα eller KPI-17 i antrum og fundus. En to-halet F-test for likhet mellom to standardavvik (SDS), fastlagt en betydelig lavere SD i forholdet caveolin til PKCα i forhold til SD av forholdet mellom vinculin til PKCα. En verdi på P < 0,05 ble ansett som vesentlig for alle statistiske tester. Det er ingen statistiske tester ble utført på styrkedata og figur 1 er representativ for tilsvarende data fra 6 forskjellige dyr. Western blot data er fra seks dyr. PKCα fordeling av data er et gjennomsnitt av tretti celler, målt per dyr og fem dyr ble testet. CPI-17 fordeling av data er et gjennomsnitt av 10 celler, målt per dyr og tre dyr ble testet. Protein samlokalisering informasjonen er basert på en 'n' på minst 20 celler fra minst 3 dyr.

Resultater

Svine mage fundus er et primært tonic glatt muskelvev som reagerer på stimulering med en vedvarende kontraksjon mens antrum er et primært fasisk glatt muskelvev som responderer på stimulering med en forbigående sammentrekning (fig. 1). I vev disse responser er sannsynligvis et resultat av direkte stimulering av glatt muskulatur som tilsetning av 1 uM propranolol (β agonist blokker) og fentolamin (α agonist blokker) ble anvendt for å forhindre aktivering av adrenerge reseptorer på grunn av potensielle frigjøring av sympatiske nevrotransmittere. Stimulering av glatt muskulatur med PDBu brukes rutinemessig for å bevirke kontraksjon av glatt muskulatur via PKC-aktivering [32], [33], [34]. Ett pM PDBU bevirker en liten langsom sammentrekning i mage fundus strimler (~40% K ^{+ stimulering reaksjon), mens den antrum viser i det vesentlige ingen reaksjon (mindre enn 5% K + stimulering) (Fig. 1). Forskjellen mellom de vedvarende og transiente reaksjoner hos disse to vev til KPSS og CCH, og tilstedeværelse eller fravær av en kontraktile respons på PDBu stimulering kan skyldes ekspresjonen og /eller romlig-temporale fordeling av nedstrøms andre budbringere (PKCα og KPI-17) som er påstått å være ansvarlig for MLCP hemming med PDBu stimulering. For å undersøke dette har vi målt uttrykket nivåer og bestemt romlig-temporal fordeling av PKCα og KPI-17 i disse vevene.}

Figur 2 viser Western blot resultater for uttrykket av KPI-17 og PKCα i magen antrum og fundus. Vevene ble behandlet styring for proteinkonsentrasjon, og resultatene ble beregnet basert på intensiteten av det respektive proteinet signal, og normalisert til aktin protein ekspresjon (Fig. 2). Begge metodene (bare normdata vist) indikerte at verken uttrykk for KPI-17 protein eller som av PKCα protein er signifikant forskjellig (p > 0,23 & p > henholdsvis 0,28, n = 6) når man sammenligner disse to SM vev. Kontrollene ble gjort ved hjelp av en rekke belastninger å bekrefte området linearitet av lasting, og at prøvene brukes for kvantifisering var innenfor dette området (data ikke vist, se metoder). Fordi det er ingen forskjeller i uttrykket for disse to proteinene mellom disse to vev, vi neste satte å avgjøre om forskjeller i deres romlige-tidsmessige fordelingen kan forklare forskjellen i sine svar til PDBu stimulering.

Figur 3 viser immuohistochemical resultater for fordeling av PKCα i de langsgående og sirkulære lag av fundus og antrum. Under hvilebetingelser i avslappende løsning når det ikke er noen kraft generering av vevet, vises PKCα å være entydig fordeles fortrinnsvis nær omkretsen av SMC (fig. 3- grønn farge, PSS). Stimulering av vevet med en pM CCH (3 ') eller 1 uM PDBu (10 og 30') ikke endrer denne omkretsfordeling PKCα. Forholdet mellom fordelingen av den PKCα nær plasmamembranen i forhold til total cellulær PKCα ble anvendt for å kvantifisere mulige endringer i fordelingen av dette proteinet under disse forskjellige forhold. Figur 4 viser resultatene som forholdet mellom PKCα ved celle periferien i forhold til de totale PKCα til stede i cellen (perifere /(perifer + cytosol), se metoder). Et forhold på 0,5 ville indikere en "uniform" fordeling av proteinet gjennom hele cellen. Den PKCα ratio (perifer /totalt) varierte 0,64 til 0,68 i alle forhold undersøkt. Disse verdiene er betydelig større enn 0,5 (p 0,05), noe som indikerer at PKCα er plassert hovedsakelig i cellen periferien (det er ikke "jevnt" fordelt i cellen), og at denne fordeling ikke endres mellom den avslappede eller stimulerte betingelser <. br>

Fordi PKCα er foreslått for å aktivere KPI-17, vi gikk videre for å bestemme den romlige-tidsmessige fordelingen av KPI-17 i disse vev under lignende forhold. Figur 5 viser immuohistochemical resultater for distribusjon av CPI-17 i de langsgående og sirkulære lag av fundus og antrum. Under hvilebetingelser i avslappende løsning når det ikke er noen kraft generering av vevet, vises KPI-17 for å bli diffust fordelt over hele SMC (fig. 5- PSS, fig. S1). Stimulering av vev med 1 pM CCH (30 ') (men ikke 1 uM CCH for 3', data ikke vist) eller 1 uM PDBu (30 ') resulterer i en betydelig endring i denne fordeling slik at CPI-17 nå vises å være i første rekke ved periferien av cellen i en fordeling lik den som er observert for PKCα (fig. 5, fig. S2). Forholdet for fordeling av KPI-17 nær plasmamembranen i forhold til total CPI-17 (perifer + cytosolisk) ble anvendt for å kvantifisere mulige endringer i fordelingen av dette proteinet under disse forskjellige forhold. Figur 4 viser resultatene som forholdet mellom perifer-til-total CPI-17. KPI-17-forhold (perifer /totalt) varierte 0,49 til 0,67 i alle vev og betingelser undersøkt. Forholdet mellom KPI-17 perifer /totalt i avslappede forhold er ikke vesentlig annerledes enn 0,5 (betyr 0,49 til 0,5; P > 0,19) indikerer at KPI-17 er diffust fordelt over de glatte muskelcellene i henhold til denne tilstanden. Dette endrer ikke følgende tre "av en mikrometer CCH stimulering som det er noen vesentlig forskjell fra den avslappede forhold (betyr = 0,53 til 0,55; P > 0,05) med unntak av fundus vev der KPI-17 perifer /total ratio er signifikant høyere (p 0,05) ved 3 '(fig. 4). Med 30 "av enten en mikrometer CCH eller 1fiM PDBu stimulering, blir KPI-17 distribusjon betydelig større enn 0,5 for alle vev og lag (betyr = 0.62-0.67, P < 0,01), noe som indikerer at KPI-17 er nå plassert fremst ved celler periferien (det er ikke lenger "jevnt" fordelt gjennom hele cellen), i likhet med fordelingen av PKCα (fig. 4).

i hovedsak perifer fordeling av PKCα (under både avslappet og stimulert forhold) og KPI-17 (etter 30 'stimulering med CCH eller PDBu) er ikke ensartet på celle periferien, men punktat i fordelingen (fig. 6). Det er også en punktformet fordeling av anatomisk og funksjonelt distinkte adherens veikryss og caveoli på SMC plasmamembranen [26]. For å avgjøre om fordelingen av PKCα og KPI-17 på membranen tilsvarer punktformet mønster av adherens veikryss, gjorde vi dobbel merking med to adherens krysset forbundet proteiner, vinculin og Talin. Den alternative mønster av fordeling av de røde og grønne fluorophores på membraner viser at PKCα og KPI-17 ikke co-lokalisere med enten vinculin eller Talin (Fig. 6), noe som tyder på at ikke PKCα og KPI-17 ikke forbinder med den adherens krysset kompleks under de forholdene vi undersøkte. Fordi caveoli veksler med adherens veikryss på perifere membranen [26], kan PKCα og KPI-17 co-lokalisere med caveoli. For å finne ut om punktat fordelingen av PKCα og KPI-17 på membranen tilsvarer punktformet mønster av caveoli, vi gjorde også dobbel merking av PKCα med caveolin. Fordelingen av PKCα og caveolin co-lokalisering på membran i både avslappet og aktiverte tilstander som kan observert ved utseendet av det gule /orange fluorescence i stedet for distinkt rød og grønn fluorescens (fig. 6). En to-halet F-test for likhet mellom to standardavvik (SDS), fastlagt en betydelig lavere SD i forholdet caveolin til PKCα i forhold til SD av forholdet mellom vinculin til PKCα (n = 20 celler; p < 0,05) . I tillegg dobbel merking av PKCα med CPI-17 etter aktivering av vevet også viser signifikant co-lokalisering (n = 20 celler; p < 0,05) av disse to proteiner i nærheten av plasmamembranen (fig 7.). Disse data viser at PKCα primært er lokalisert i nærheten av caveloi på SMC plasmamembranen til enhver tid, og at etter vev aktivering, en betydelig del av den cytosoliske KPI-17 translocates til caveoli ved plasma hvor den co-lokaliserer med PKCα.

Diskusjoner

Glatte muskler blir rutinemessig karakterisert som enten "tonic" (generere en langsom opprettholdes isometrisk kontraksjon) eller "phasic" (generere en rask transient isometrisk kontraksjon). Styrkegenerering og /eller vev matfett i SM er antatt å kreve forhøyede myosinlettkjedefosfatase fosforylering, ATP-forbruk og kryss bro sykling. En mulig mekanisme ansvarlig for disse to typene av sammentrekninger er differensial Ca ^{2 + allergi. Ca 2+ sensibilisering i glatt muskulatur antas i stor grad å skyldes inhibering av MLCP samtidig med eller etter aktiveringen av MLCK under vev aktivering [15], [35]. En av de store trasé foreslått å være involvert i Ca 2+ sensibilisering er via G-protein-koblede reseptorer (GPCR) /fosfolipase C (PLC) /diacylglycerol (DAG) /PKC /CPI-17 for å inhibere MLCP. GPCR-tallet, PLC, og DAG er alle plassert på /i plasmamembranen. Plasseringen av MLCP er mindre sikker, men på et tidspunkt etter vev aktivering MLCP trenger å bli forbundet med MLC _{20 på myosin molekyl av den tykke filamenter for å dephosphorylate dette proteinet. Fordi tykke filamenter har blitt rapportert å bli distribuert over hele SMC cytoplasma [36], [37], [38], [39], vil MLCP også trenger å bli distribuert over hele cytoplasma på et tidspunkt under avslapping [40]. Hvis ligger innenfor cytosol og i nærheten av MLC 20 under sammentrekning, og PKCα og KPI-17 MLCP spille en rolle i å hemme MLCP under kontraksjon, så i hvert fall KPI-17 forventes å ligge i cytosol på noen gang under sammentrekning. Resultatene av denne studien viser at PKCα fortrinnsvis lokalisert nær plasmamembranen under avslappede og aktiverte tilstander og at CPI-17 er også fortrinnsvis lokalisert nær plasmamembranen under aktiverte forhold. Dermed disse data tyder på at forskjeller i PKCα- KPI-17 Ca 2 + allergi sti kan ikke forklare tonic og phasic SM sammentrekninger i magen fundus og antrum og videre arbeid er nødvendig for å finne ut hvordan den romlige-tidsmessige fordelingen av KPI 17 med vev aktivering kan regulere MLCP å forårsake Ca 2+ sensibilisering av SM sammentrekning i intakte SM vev.}}

Mens PDBu fører til en langsom sammentrekning i fundus som er ~40% av KPSS indusert toppkraft , lite sammentrekning genereres i antrum med PDBu stimulering. Siden fundus og antrum representerer to hovedtyper av glatt muskulatur, tonic og phasic henholdsvis, virker det logisk å tilskrive forskjellen i styrkegenerering til forskjellige egenskaper phasic og tonic muskel. Woodsome et al [41] rapporterte at ekspresjonsnivået av CPI-17 i tonic vaskulær SM er høyere enn det som i fasisk vaskulær SM. Dette kan forklare de forskjellige evne til toniske muskler for å opprettholde kraft (en høy konsentrasjon av CPI-17 inhiberer MLCP slik MLC _{20 fosforylering å bli for høyt og kraft for å bli opprettholdt i tonic SM). Denne studien undersøkte PKCα og KPI-17 protein uttrykk og distribusjon i visceral svin magen. Til vår overraskelse var ingen signifikant forskjell i protein ekspresjonsnivået av PKCα eller CPI-17 detektert mellom fundus og antrum (fig. 2).}

• PLoS ONE: Nikotin demper Aktivering av Tissue Resident Makrofager i Mouse magen gjennom β2 Nikotin Acetylkolin Receptor
• PLoS ONE: Kirurgisk behandling for pasienter med Krukenberg Tumor av magen Origin: klinisk utfall og prognostiske faktorer analyse