PLOS ONE: MED30 Regula a proliferação ea motilidade do câncer gástrico Cells

Abstract

MED30 é um membro essencial do complexo mediador que forma um hub entre activadores de transcrição e RNA polimerase II. No entanto, as expressões e papéis de MED30 foram mal caracterizado pelo câncer. Neste estudo, nós examinamos os papéis funcionais de MED30 durante a progressão do cancro gástrico. Verificou-se que MED30 foi sobre-expresso em tecidos de cancro gástrico e linhas celulares. Além disso, a sobre-expressão MED30 aumentou a proliferação, a migração e a invasão de células de cancro gástrico, enquanto que MED30 knockdown inibida estes efeitos. Além disso, o knockdown tumorigenicidade significativamente inibida em ratinhos SCID. MED30 também promoveu as expressões de genes relacionados com a transição epitelial-mesenquimal e induziu uma morfologia de fibroblastos-like. Este estudo mostra MED30 tem papéis fisiopatológicos na proliferação, migração e invasão das células cancerosas gástricas e sugere que MED30 deve ser visto como um alvo terapêutico potente para maligna gástrica carcinoma

Citação: Lee YJ, Han ME, Baek SJ, Kim SY, Oh SO (2015) MED30 Regula a proliferação ea motilidade das células cancerosas gástricas. PLoS ONE 10 (6): e0130826. doi: 10.1371 /journal.pone.0130826

editor: Aamir Ahmad, Escola de Medicina da Universidade Estadual Wayne, United States |

Recebido: 22 de setembro de 2014; Aceito: 26 de maio de 2015; Publicação: 25 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Lee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Bio & Programa Medical Technology Development (2012M3A9C6050213) e Fundação Ciência Básica Pesquisa (2012R1A1A3010521), da Fundação Nacional de Pesquisa (NRF), financiado pelo governo coreano (MEST) e uma bolsa da R &Nacional; Programa D de Controle do Câncer, Ministério da Saúde, Bem-Estar e Assuntos da família, República da Coreia (0920050). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é uma das principais causas de morte por cancro em todo o mundo [1, 2]. Cerca de 95% dos cancros gástricos são adenocarcinomas e em estudos epidemiológicos câncer gástrico foi classificado pela localização anatômica como cárdia /proximal ou noncardia /distal [3] e pelo fenótipo histológico como intestinal, difusa, ou misto /inclassificável como descrito por Lauren [4 ]. Além disso, os pacientes com câncer gástrico proximal têm pior independente sobrevivência de estágio TNM [5]. infecção por Helicobacter pylori
foi demonstrado ser um agente etiológico de cancro gástrico, particularmente de cancros encontrados nos estômagos distais dos machos idosos, que são geralmente do tipo intestinal. Mais recentemente, várias classificações moleculares do câncer gástrico foram propostas com base nas conclusões de todo o genoma estudos de expressão gênica e /ou estudos de número de cópias do gene [6-10].
Regulamento

transcricional é um passo crucial que controla identidade da célula, crescimento, diferenciação e desenvolvimento. mediador humano (MED) complexo, que contém ~ 30 proteínas, é um coactivador chave /activador das expressões da ARN polimerase II (pol II) -transcribed genes [11]. MED complexo facilita a montagem complexo de pré-iniciação (PIC), por interacção com pol II e factores de transcrição de genes específicos (TFS), tais como, TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, e TFIIH [12, 13]. complexo MED consiste em três sub-módulos estruturais distintos (cabeça, meio e cauda). O módulo de cabeça interage diretamente com Pol II, enquanto o módulo de cauda alongada interage com proteínas específicas do gene de regulamentação [12, 13], eo módulo de meio atua na transferência de sinal de regulamentação numa fase de ligação pós-[13]. Embora o mecanismo não é completamente compreendido, MED complexo liga-se firmemente a pol II, muda a sua conformação e afecta o processo de iniciação da transcrição [14, 15]. Desde MED complexo é um componente essencial da maquinaria de transcrição, a maioria das subunidades no núcleo de MED são necessários para o crescimento e a viabilidade das células embrionárias [16].

estudos de sequenciação do genoma do cancro relataram mutações ou alterações no ARN componentes de máquinas de transcrição contidos em subunidades MED, e correlações entre algumas destas mudanças em subunidades MED, (MED1, MED12, MED19, MED23, MED28, CDK8, e ciclina C) e progressão do câncer foram relatados para vários tipos de câncer, embora os mecanismos responsáveis ​​pela estas correlações são desconhecido [17].

recentemente, foi relatado que um MED19 pode participar na progressão do cancro gástrico, como o seu knockdown a proliferação celular e a capacidade de formação de colónias, e fase G1 induzida paragem do ciclo celular significativamente inibida em duas linhas humanas gástricas celulares de cancro (SGC7901 e MGC803) [18]. No entanto, os papéis funcionais e relevância patológica de outras subunidades MED em câncer gástrico permanecem obscuros.

No presente estudo, para revelar a importância funcional do MED30 durante a progressão do cancro gástrico, nós examinamos seus papéis na proliferação, migração, invasão e tumorigenicidade das células cancerosas gástricas. Antes do exame funcional, verificamos o padrão de MED30 expressão em células cancerosas gástricas e tecidos.

Materiais e Métodos

As culturas de células e transfecção

linhas celulares de cancro gástrico (SNU1 , SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 e N87) foram adquiridos a partir da Korean Linha Cell Bank (Seul). As células foram cultivadas em RPMI1640 suplementado com HEPES 25 mM, 10% de soro fetal de bovino (FBS), e 100 ug /ml de penicilina /estreptomicina (1 × P /S) em 5% de CO _{2/95% de ar a 37 ° C. As células foram transfectadas com ARNsi utilizando DharmaFECT reagente 1 ou 3 (Dharmacon, Lafayette, CO), de acordo com as instruções do fabricante. As sequências de siRNA utilizados foram como se segue: MED30 siRNA (Bioneer, Daejeon, Coreia do Sul), 5'-CGA GCA ACU UAU UCC AUA L (dTdT) -3 ', 5'-CGC GCU AAA CAC UGG UGU L (dTdT) - 3 ', 5'-e CGA GAA GAA AUU GCU GUA A (dTdT) -3'; mexidos (SCR) siRNA (Dharmacon, Lafayette, CO), 5'-GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) -3 '.}

MED30 superexpressão

Para construir MED30- ao longo do vector de expressão, utilizou-se pLenti6.3-V5 /DEST lentiviral vector (Invitrogen, Carlsbad, CA). Resumidamente, cDNA MED30 foi clonado pLenti6.3-V5 /DEST vector usando o in vivo
sistema de clonagem de gateway baseada em recombinação (Invitrogen). O Dador de Vector (pDONR221) contendo a sequência de codificação de MED30 (MED30 ADNc) foi adquirido da Ultimate ^{TM ORF Clones (Invitrogen), e recombinado com o ccdB contra-seleccionável
gene do vector de destino gateway pLenti6.3-V5 /DEST utilizando a mistura de enzima clonase LR (Invitrogen). O pLenti6.3 vector vazio /V5-DEST foi utilizado como um controlo simulado. lentivírus recombinantes foram produzidos em células 293FT, e utilizado para infectar células SNU638 de acordo com as instruções do fabricante (ViraPower Lentivirus Expression System; Invitrogen). linhas de células estáveis ​​foram estabelecidas pela seleção com blasticidina (7,5 ug /ml) (Invitrogen).}

PCR em tempo real

tecidos câncer gástrico foram obtidos após a obtenção do consentimento informado por escrito dos pacientes que se submeteram à cirurgia ressecção do Hospital da Universidade Nacional de Pusan ​​ou Universidade Nacional de Pusan ​​Hospital Yangsan. O estudo foi aprovado pelo National University Hospital-Institutional Review Board Pusan ​​(PNUH-IRB) e da National University Yangsan Hospital-Institutional Review Board Pusan ​​(PNUYH-IRB). O ARN total foi extraído a partir de tecidos ou células, utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) ou o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA), de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc foi sintetizado utilizando transcriptase inversa de MMLV (Promega, Madison, WI), dNTP, e iniciadores oligo-dT. As sequências dos iniciadores utilizados foram os seguintes: MED30, 5'-ACC GGT TAA AAC AGC TAC AGG A-3 '(sentido) e 5'-TAA GCT CGA GTT GAA CTG TGG G-3' (anti-sentido); CDH1, 5'-TGG GCC AGG AAA TCA CAT CC-3 'e 5'-CTC AGC CCG AGT GGA AAT GG -3'; CDH2, 5'-CAC TGT GGA GCC TGA TGC CA -3 'e 5'-TCC CCA ATG TCT CCA GGG TG -3'; CDH3, 5'- CCC CCA GAA GTA CGA GGC CC-3 'e 5'-ACG CCA CGC TGG TGA GTT GG -3'; TWIST1, 5'- CGG GAG TCC GCA GTC TTA-3 'e 5'-TGG ATC TTG CTC AGC TTG TC -3'; TWIST2, 5'- CTT ATG TTT GGG GGG AGG TT-3 'e 5'-TAG CCA AGC AAT CAC GGA GA -3'; VIM, 5'-TGA GTA CCG GAG ACA GGT GCA G-3 'e 5'-TAG CAG CTT CAA CGG CAA AGT TC -3'; SNAI1, 5'-GAG GCG GTG GCA GAC TAG -3 'e 5'- GAC ACA TCG GTC AGA CCA G-3'; SNAI2, 5'-TAG GAA GAG ATC TGC CAG AC-3 'e 5' CCC CAA GGC ACA TAC TGT TA -3 '; GAPDH, 5'- GCA GCC TCC CGC TTC GCT CT -3 'e 5'-TGG TGA CCA GGC GCC CAA TAC G-3'. PCR em tempo real foi realizado utilizando um LightCycler ^{TM 96 em tempo real sistema de PCR (Roche, Nutley, NJ, EUA) com FastStart DNA Essencial verde mestre (Roche), de acordo com as instruções do fabricante. GAPDH foi usada como um controlo interno.}

análise Western blot

As células foram lisadas com tampão RIPA, foi adicionado cocktail de inibidor de protease, e as concentrações de proteína foram determinadas usando o kit de ensaio de proteína Bio-Rad ( bio-Rad, Hercules, CA). As amostras (80 ug /poço) foram sujeitos a SDS-PAGE e depois transferidos para membranas de PVDF. Anti-MED30 (1: 500, Proteína tecnologia§87-1-AP, Chicago, IL), anti-caderina-E (1: 1000, BD Bioscienceɢ181, San Jose, CA), anti-N-caderina (1 : 1000, BD Bioscienceɢ920), anti-P-caderina (1: 1000, BD Bioscienceɢ227), anti-TWIST1 /2 (1: 750, Santa Cruz Biotechnology # SC-15393, Santa Cruz, CA), anti -vimentin (1: 1000, DAKO # M7020, Carpentaria, CA) e anti-β-actina (1: 2.000, Santa Cruz Biotechnology # SC-47778) anticorpos foram diluídos em leite desnatado a 5% e incubada com as membranas a 4 ° C durante a noite. Aplicou-se o anticorpo secundário apropriado (1: 2000, peroxidase de rábano conjugado com anti-ratinho ou anti-coelho) à temperatura ambiente durante 1 h. detecção de quimioluminescência (GE Cuidados de Saúde, Little Chalfont, Reino Unido) foi utilizada para visualizar MED30, E-caderina, N-caderina, P-caderina, TWIST1, vimentina, actina e β-. análise de Western blot foi realizada em triplicado.

Imunohistoquímica

secções de tecido microarrays que contêm tecidos de câncer gástrico de pacientes foram obtidos a partir SuperBiochip (Seul). diagnósticos histopatológicos foram realizados no Departamento de Patologia, Hospital da Universidade Nacional de Pusan, e estadiamento clínico-patológico foi realizada utilizando a classificação TNM (AJCC, 7ª ed.). Todos os pacientes tinham confirmado histologicamente cancro gástrico, e amostras do tumor foram verificadas para garantir que o tecido do tumor composto por mais de 80% das amostras. Para imuno-histoquímica, as lâminas foram desparafinadas e re-hidratadas, tratada com peróxido de hidrogénio a 0,3% durante 30 minutos para extinguir a actividade da peroxidase endógena, e bloqueadas com 10% de soro de burro normal (NDS) e 1% de BSA em 1 × solução salina tamponada com fosfato (PBS). As lâminas foram então incubadas durante a noite a 4 ° C em tampão contendo o anticorpo primário de bloqueio (MED30 anti-humano; 01:50, Proteintech). O anticorpo secundário (conjugado com HRP) de ligação foi realizado com uma diluição de 1: 200 em tampão de bloqueio durante 2 horas à TA. As lâminas foram então coradas para HRP (Vector Laboratories) e contrastadas com tampão de coloração de hematoxilina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 1 min. Percentagens de células que coradas para MED30 nas seções foram determinadas e secções foram então classificadas de acordo com uma escala de 1-4 (1, < 24%; 2, 25-49%, 3, 50-74%, 4, 75-100% ). As intensidades de coloração das células de tumor foram classificados como 0, 1, 2, ou 3, o que correspondeu a basal, fraco, moderado, e forte, respectivamente. coloração geral foi então representado por escores compostos, que foram calculados pela multiplicação destes dois graus. Por conseguinte, em geral corada foi graduada de 0 a 12.

proliferação celular ensaio

Para examinar o efeito de ARNsi sobre a proliferação de células de cancro gástrico, os meios de cultura foram substituídos por 1% de FBS uma forma dias após a transfecção siRNA. Cinco dias após a transfecção, adicionaram-se 10 ul de Ez-Cytox (ITSBIO, Seul) e as células foram incubadas durante 0,5 a 2 horas, sob condições de cultura normais. Em seguida, a absorvância foi medida a 450 nm utilizando um leitor de ELISA (TECAN, Mannedorf, Suíça). Para examinar o efeito da sobreexpressão MED30, as células foram semeadas em meio com FBS a 1%. foi adicionado três dias após a semeadura 10 ml de Ez-Cytox.

Boyden ensaio de câmara

A câmara inferior de uma câmara de Transwell foi preenchido com meio contendo 10% de FBS. Um dia após a transfecção com mexidos (SCR) ou MED30 siRNA, células gástricas cancerosas foram semeadas para dentro da câmara superior a uma densidade de 5 x 10 ^{5 células /ml em 50 ul de meio isento de soro. Para examinar os efeitos da sobre-expressão MED30, as células simuladas (e MED30-over) foram semeadas a uma densidade de 1 × 10 5 células /mL. Para eliminar os efeitos associados proliferação, mitomicina C (0,01 ug /mL, Sigma-Aldrich) foi adicionada. As células foram deixadas migrar durante quatro ou seis horas. As membranas foram então fixados e corados utilizando Diff-Quik solução (Sysmex, Kobe, Japão) e lavou-se com água destilada. o número de células em 10 campos escolhidos aleatoriamente foram contadas utilizando um microscópio de luz.}

Matrigel ensaio de invasão

A capacidade das células de câncer gástrico para invadir foi investigada através de 24 poços BioCoat ^{TM Matrigel inserções de câmara TM (BD Bioscience, San Jose, CA, EUA). A superfície de topo de inserções em câmaras de invasão foram revestidas com 0,5 mg /ml de factor de crescimento reduzida Matrigel (BD Bioscience) e a superfície inferior com 0,5 mg /mL de fibronectina (Sigma-Aldrich). Um dia após a transfecção com o SCR ou MED30 siRNA, as células foram semeadas a uma densidade de 5 x 10 4 células /ml em meio isento de soro na 8 mícrons porosas insertos de câmara BioCoat Matrigel, e colocados em poços cheios com 750 ul de meio suplementado com FBS a 10% como um quimioatractor. Para examinar os efeitos da sobre-expressão MED30, as células simuladas (e células que sobre-expressam MED30) foram semeadas a uma densidade de 1 × 10 4 células /ml. Para remover os efeitos associados a proliferação, a mitomicina C (0,01 ug /ml, Sigma-Aldrich) foi adicionada. Após incubação durante 24 horas, as células não-invasoras sobre superfícies de topo de membranas foram removidas por raspagem. Invadir as células na superfície inferior foram fixadas e coradas com Diff-Quik solução. Os experimentos foram realizados em triplicado, e pelo menos 5 campos foram contadas por experiência.}

ensaio de xenoenxerto

As células SNU638 foram transfectadas com SCR ou MED30 siRNA. Após 2 dias, as células foram recolhidas por tripsinização, lavadas duas vezes com PBS, e foram injectados por via subcutânea (1 × 10 ^{6 células em 100 ul de PBS) em ratos imunodeficiência combinada grave (SCID). Os volumes tumorais foram calculados a cada semana de três semana para semana de sete após a injecção utilizando a seguinte fórmula: volume do tumor (mm 3) = ( a
× b
2 ) /2, onde a
= comprimento em mm e b
= largura em mm. Aos sete semanas, os ratinhos foram sacrificados e os volumes tumorais e os pesos foram registados. Este experimento foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório emitidas pelo Instituto Nacional de Saúde. O Comité de Pusan ​​National University Animal Care Institucional e Use (PNUIACUC) aprovou o protocolo experimental.}

A análise estatística

Os resultados são apresentados como médias ± SDs. O não-paramétrico de Mann-Whitney U-test ou o teste t de Student (desemparelhado) foi utilizado para determinar os significados de diferenças entre os valores médios dos dois grupos, e de um modo foi utilizada a análise de variância (ANOVA) seguida por comparações múltiplas de Tukey para analisar três ou mais grupos. * Indica um valor P
de < 0,05. O tempo de sobrevida foi definido como o tempo decorrido entre o tratamento e a morte ou até que o último objectivo informações de seguimento foi obtido. O método de Kaplan-Meier foi utilizado para determinar a relação entre a sobrevivência e expressão MED30. As curvas foram comparadas pelo teste de log-rank em um nível de significância de 95%. valores P
de < 0,05 foram considerados como sendo estatisticamente significativo. Os dados foram analisados ​​usando o software SPSS versão 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).

Resultados

A superexpressão de MED30 em tecidos com câncer gástrico

Para investigar papéis desempenhados por MED30 no câncer gástrico, primeiro analisava a situação das MED30 expressão nos tecidos tumorais de 23 pacientes com câncer gástrico. MED30 proteína foi encontrada para ser amplamente sobre-expresso em tecido canceroso regiões (Fig 1A-1D), e, obviamente, foi sobre-expresso em células cancerosas invasoras gástricos (Fig 1C) e em células metastáticas de cancro dentro dos gânglios linfáticos afectados (Fig 1D). A fim de validar os nossos resultados de imuno-histoquímica, foi realizada quantitativa PCR em tempo real em tecidos de cancro gástrico, utilizando iniciadores específicos do MED30. Como mostrado na Fig 1F, DPY30 foi sobre-expresso em 10 casos (10/23, 43%). Examinámos também o padrão de expressão de MED30 em linhas celulares de cancro gástrico por PCR em tempo real, e verificou-se ser sobreexpresso em cinco das linhas celulares de cancro gástrico testadas (excepto SNU1) versus tecidos normais gástricos (Fig 1E). Para investigar a correlação entre a expressão MED30 e as características clínicas, foi realizada imuno-histoquímica utilizando 41 amostras de tecido de cancro gástrico (Tabela 1). Curiosamente, a expressão de MED30 foi positivamente correlacionada com o estádio N (Fig 1G), mas não com a sobrevida dos pacientes (dados não mostrados).

Papéis de MED30 na proliferação, migração e invasão das células cancerosas gástricas

Para examinar os papéis de MED30 na carcinogénese gástrica, que examinou os efeitos de MED30 knockdown ou superexpressão sobre a proliferação, migração e invasão das seis linhas celulares de cancro gástrico (SNU1, SNUI16, SNU216, SNU620, SNU638, e NCI -N87 células). PCR em tempo real e Western blot foram utilizados para analisar o knockdown e sobre-expressão de MED30 em SNU216 e SNU638 células (Fig 2A-2C). Quando estas células foram transfectadas com ARNsi MED30 (100 nM), MED30 expressão diminuída na proteína e níveis de ARNm em cerca de 80%, dois dias depois contra SCR siRNA, e a sobre-expressão MED30 por transfecção de ADNc de ARNm aumentou MED30 e os níveis de proteína contra vetor de controlo vazia células transfectadas (células simulada) por mais de 3 vezes.

a seguir, investigou o papel da MED30 na proliferação das células cancerosas. Os ensaios de proliferação foram realizados 5 dias após a transfecção com o SCR ou MED30 siARN. Knockdown de MED30 inibiu as proliferações de todas as células cancerosas gástricas testados (SNU16, SNU216, SNU620 e SNU638) versus SCR em 18%, 68%, 98% e 42%, respectivamente (Fig 2D). Resultados similares foram observados quando foi feita a ensaios de proliferação de dois ou três dias após a transfecção (dados não mostrados). Consistentemente, MED30 superexpressão reforçada os crescimentos de SNU216 e SNU638 células em 1,9 e 2,2 vezes, respectivamente, contra células simulados.

Para determinar o papel desempenhado pela MED30 na migração de células cancerosas gástricas, foi utilizada uma câmara de Boyden ensaio. Knockdown de MED30 diminuiu migrações induzidas por FBS das células SNU216 e SNU638 por 90% e 52%, respectivamente, contra as células transfectadas SCR (Fig 3A e 3C). Além disso, a sobre-expressão MED30 aumentou a migração induzida por FBS das células SNU216 e SNU638 de 3,2 e 2,8 vezes, respectivamente, contra as células simuladas (Fig 3B e 3C). Estes resultados levaram-nos a examinar o papel do MED30 na invasão das células cancerosas gástricas. Num ensaio de invasão de Matrigel, MED30 siARN inibida invasões induzidas por FBS das células SNU216 e SNU638 contra SCR siRNA de 64% e 47%, respectivamente (Fig 4A e 4C), e MED30 superexpressão acelerado as invasões induzidas FBS de SNU216 e SNU638 células contra células simuladas por 2,5 e 2,2 vezes, respectivamente (Fig 4B e 4C).

efeito da MED30 knockdown no in vivo
tumorigenicidade

Para examinar o efeito do MED30 em crescimento do tumor, que injectado por via subcutânea SNU638 células transfectadas com ARNsi MED30 SCR ou em ratinhos SCID, e em seguida o crescimento do tumor monitorizada durante sete semanas (Fig 5A). tumores palpáveis ​​foram detectados no prazo de três semanas em os lados de controlo SCR. No entanto, as células cancerosas transfectadas com MED30 siRNA exibiu um crescimento mais lento. Sete semanas após a injecção, os ratinhos foram sacrificados, e os volumes tumorais e os pesos foram medidos (Figura 5B e 5C). Os resultados mostraram MED30 knockdown significativamente reduzidos volumes tumorais e pesos.

Regulamento do EMT via pela MED30

Para determinar o mecanismo subjacente a promoção da carcinogênese gástrica, por MED30, investigamos os padrões de expressão dos genes envolvido na epitelial-mesenquimal transição (EMT: um processo chave em metástase e invasão) por PCR em tempo real. Knockdown de MED30 aumentou ligeiramente o nível de E-caderina (CDH1) ARNm em SNU638 células contra SCR transfecção, mas diminuição da expressão de N-caderina (CDH2), P-caderina (CDH3) e vimentina (VIM) em 42%, 36% , e 41%, respectivamente (Figura 6A). Consistentemente, MED30 superexpressão diminuição dos níveis de ARNm CDH1 por 35% versus células falsamente, mas aumentou a expressão de N-caderina (CDH2), P-caderina (CDH3), família torção factor de bHLH transcrição 1 e 2 (TWIST1 /2), e vimentina (VIM) de 2,9, 3,3, 3,4, 2,4, 2,2, e 4,2 vezes, respectivamente (Figura 6A). Os níveis de ARNm de família caracol de dedo de zinco e 1 2 (SNAI1 /2) mantiveram-se inalterados. Em seguida, confirmou que a sobre-expressão MED30 também aumentou os níveis de proteína de E-caderina, N-caderina, P-caderina, TWIST1, e vimentina (Fig 6B). Um exame da morfologia das células SNU638 revelaram que a sobreexpressão MED30 desencadeada uma transição a partir de um paralelepípedo semelhante a uma morfologia do tipo fibroblastos alongada (Figura 6C), ao passo que MED30 knockdown não alterou a morfologia (dados não mostrados). Estes resultados sugerem que MED30 regula positivamente EMT.

Discussão

Os papéis funcionais do MED30 subunidade MED (também conhecido como TRAP25) são mal compreendidos. Num relatório recente, MED30 foi encontrada a desempenhar um papel significativo na regulação das funções mitocondriais e integridade em ratinhos homozigotos [19]. No presente estudo, examinamos os papéis funcionais de MED30 durante a progressão do cancro gástrico. Ele foi encontrado MED30 regulada a proliferação, migração e invasão das células cancerosas gástricas e sua in vivo
tumorigenicidade. Depois de garantir knockdown e eficiência sobre-expressão por quantitativa PCR em tempo real e análise de Western blot (Figura 2), verificou-se que MED30 knockdown notavelmente suprimida a proliferação, a migração e a invasão de células de cancro gástrico, e que MED30 superexpressão teve efeitos opostos (Figs 2-4). Além disso MED30 knockdown reduzida in vivo
tumorigenicidade (Fig 5). Além disso, também descobrimos que MED30 foi sobre-expresso em tecidos de câncer gástrico e linhas celulares de cancro gástrico (Fig 1). Estes resultados sugerem que MED30 pode desempenhar papéis fisiopatológicos importantes durante a carcinogênese gástrica.

Desde subunidades MED específicos estão associados a fatores ativada por sinais de transcrição e RNA polimerase II (Pol II) [20] e funcionam como condutas e integradores para canalização de diferentes vias de sinalização, tais como, a via de hormona nuclear do receptor (através MED1) [21], a via de TGF-sinalização-β (através MED12 ou MED15) [22, 23], a via Wnt-sinalização (através MED12) [ ,,,0],24], e a via de sinalização de Ras-MAPK (através MED23) [25-27]. Propõe-se que estas vias de sinalização pode induzir EMT [28-32], que é conhecido por estar associado com a metástase, invasão, proliferação, e quimiorresistência de cancro epitelial [29, 33, 34]. Por isso, perguntou se MED30 desencadeia EMT. MED30 induzida as expressões de genes relacionados com a EMT (N-caderina; CDH2, P-caderina; CDH3, relacionados torção proteína 1 e 2; TWIST1 /2, vimentina; VIM), mas inibiu a expressão de E-caderina (CDH1) um supressor de tumor conhecido (figura 6A e 6B). Além disso, MED30 superexpressão induzida uma morfologia de fibroblastos-like (Fig 6C), o que sugere MED30 desencadeia EMT em células cancerosas gástricas.

Em resumo, o presente estudo apoia a noção de que MED30 atua como um oncogene durante a carcinogênese gástrica e sugere MED30 pode regular a EMT no câncer gástrico. Embora mais estudos são necessários para determinar como MED30 desencadeia EMT, nossos resultados sugerem que MED30 ser considerado um alvo molecular inovador para o tratamento do cancro gástrico.

Reconhecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Bio & Programa Medical Technology Development (2012M3A9C6050213) e Fundação Ciência Básica Pesquisa (2012R1A1A3010521), da Fundação Nacional de Pesquisa (NRF), financiado pelo governo coreano (MEST), e por uma concessão do R &Nacional; Programa D de Controle do Câncer, Ministério da Saúde , Bem-Estar e Assuntos da família, República da Coreia (0.920.050).

• PLOS ONE: Papéis de DPY30 na proliferação e mobilidade das células de câncer gástrico
• PLOS ONE: Photoimmunotherapy de câncer gástrico Peritoneal Carcinomatose em um modelo do rato