PLOS ONE: Photoimmunotherapy de câncer gástrico Peritoneal Carcinomatose em um modelo do rato

Abstract

Photoimmunotherapy (PIT) é um novo tratamento contra o câncer, que combina a especificidade dos anticorpos para alvejar tumores com a toxicidade induzida pelo fotossensibilizantes após a exposição ao infravermelho próximo (NIR) luz. Foi realizada PIT em um modelo de câncer gástrico carcinomatose peritoneal disseminada e monitorados eficácia com in vivo
GFP imagens de fluorescência. In vitro
e in vivo
experimentos foram realizados com um, line-expressando HER2-expressando GFP gástrica célula cancerosa (N87-GFP). Um conjugado constituído por um fotossensibilizador, IR-700, conjugado com trastuzumab (TRA-IR700), seguida de luz NIR foi usada para PIT. In vitro
PIT foi avaliada através da medição da citotoxicidade com coloração morto e uma diminuição da fluorescência de GFP. In vivo
PIT foi avaliada em um modelo de carcinomatose peritoneal disseminada e um xenoenxerto flanco usando medições de volume de tumor e intensidade GFP fluorescência. In vivo
efeitos anti-tumorais da PIT foram confirmadas por reduções significativas no volume do tumor (no dia 15, p < 0,0001 vs. controlo), e intensidade de fluorescência de GFP (modelo de flanco: no dia 3, PIT tratados vs. controle de p < 0,01 e modelo disseminada peritoneal: no dia 3 PIT tratados vs. controlo, p < 0,05). Os efeitos citotóxicos in vitro
mostraram-se dependentes da dose de luz e causou a ruptura celular por necrose conduzindo a libertação GFP e uma diminuição na intensidade de fluorescência de in vitro.
Assim, a perda de fluorescência da GFP servido como um biomarcador útil de necrose celular após PIT

Citation:. Sato K, Choyke PL, Kobayashi H (2014) Photoimmunotherapy de câncer gástrico peritoneal Carcinomatose em um rato modelo. PLoS ONE 9 (11): e113276. doi: 10.1371 /journal.pone.0113276

editor: Irina V. Lebedeva, Universidade de Columbia, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de julho de 2014; Aceito: 21 de outubro de 2014; Publicação: 17 de novembro de 2014

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Data Availability:. Os autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo programa NIH Intramural e JSPS Research Fellowship. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma gástrico causa mais de 740.000 mortes relacionadas ao câncer por ano no mundo, especialmente na Ásia [1] - [3]. A maioria dos pacientes com câncer gástrico presente com localmente avançado, recorrente ou doença metastática se opõe a cirurgia curativa que é maioritariamente controlado pela terapia não-curativa [1]. carcinomatose peritoneal e metástase hepática são manifestações fatais comuns de câncer gástrico fase avançada [1], [4]. carcinomatose peritoneal também ocorre no ovário, do apêndice, cólon, pâncreas e cancros gástricos. O prognóstico é universalmente pobres e tratamentos locais são invariavelmente mal sucedida com altas taxas de recidiva e morbidade associadas a ascite e obstrução intestinal. A terapia sistêmica também é geralmente sem sucesso. Assim, são necessários novos métodos de tratamento de carcinomatose peritoneal.

Photoimmunotherapy (PIT) é um tratamento de câncer específico de células-alvo novo que emprega um anticorpo conjugado fotossensibilizador (APSC), seguido de infravermelho próximo (NIR) a exposição à luz. Um APSC consiste de um anticorpo específico de células do cancro monoclonal (mAb) e um fotossensibilizador, IR700, que é um derivado de sílica-ftalocianina covalentemente conjugados com o anticorpo. O APSC liga-se moléculas alvo na membrana celular e, em seguida, induz necrose celular quase imediato após a exposição à luz NIR a 690 nm. In vitro
estudos têm mostrado PIT para ser altamente específico de células, por conseguinte, as células que não expressam imediatamente adjacentes a células alvo não apresentam efeitos tóxicos [5]. As células tratadas com PIT sofrer expansão rápida de volume conduz à ruptura da membrana celular, a extrusão do conteúdo da célula para o espaço extracelular, e necrose irreversível [6] - [8]. Nossos resultados e outros demonstram que a citotoxicidade induzida pelo PIT não totalmente dependem de espécies reativas de oxigênio ou a existência de oxigénio atómico supressores [9]. Além disso, a citotoxicidade induzida por PIT é principalmente dentro da membrana celular, em vez dentro da mitocôndria como ocorre com a TFD.

Enquanto PIT resulta em necrose celular rápida, o volume total do tumor não podem mudar durante vários dias. Isso é porque ele leva pelo menos vários dias para os macrófagos para entrar, processo e deixar o tumor tratado. Portanto, novos métodos, além de medidas de tamanho, são necessários para monitorar os efeitos da PIT. proteínas de fluorescência (FPS) são comumente usados ​​para a visualização de processos celulares [10], [11]. Enquanto a maioria dos resultados de morte celular apoptótica em preservação da membrana celular e de retenção do PQ fazendo fluorescência insensível à morte das células [12], [13], no poço, a ruptura súbita das membranas das células resulta em extrusão de PQ citoplasmático e, por conseguinte, uma relativamente rápida leitura de morte celular. Uma vantagem do FPS para In vivo
imagiologia é que eles não requerem injecções extrínsecos de agentes (tais como luciferina no caso de bioluminescência) e pode ser monitorado em tempo real [14] - [18]. Uma vez que exigem a transfecção de genes, eles provavelmente só iria ser útil em estudos pré-clínicos.

Neste estudo, nós examinamos a eficácia do PIT em um modelo de rato com câncer gástrico peritoneal disseminada in vivo utilizando GFP fluorescência de imagem para monitorar a resposta.

Materiais e Métodos

Reagentes

solúvel em água, derivado de silício-ftalocianina, IRDye 700DX NHS éster e 800 éster CW NHS IRDye foram obtidos a partir de LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, EUA). Panitumumab, uma IgG completamente humanizado _{2 de mAb dirigidos contra o EGFR, foi comprado a partir de Amgen (Thousand Oaks, CA, EUA). Trastuzumab, 95% de IgG humanizado um mAb dirigido contra HER2, foi adquirido da Genentech (South San Francisco, CA, EUA). Todos os outros produtos químicos foram de grau reagente.}

Síntese de trastuzumab IR700-conjugado ou panitumumab e IR800 conjugado com trastuzumab

Conjugação de corantes com mAbs foi realizada de acordo com um relatório anterior [19]. Em breve, panitumumab ou trastuzumab (1 mg, 6,8 nmol) foi incubada com éster IR700 NHS (60,2 mg, 30,8 nmol) ou IRDye 800 CW NHS éster (35,9 mg, 30,8 nmol) em 0,1 mol /L de Na _{2HPO 4 (pH 8,6) à temperatura ambiente durante 1 h. A mistura foi purificada com uma coluna de Sephadex G50 (PD-10; GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA). A concentração de proteína foi determinada com kit de ensaio de proteínas Coomassie Plus (Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford, IL, EUA), medindo a absorção a 595 nm com espectroscopia (8453 Valor do sistema; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). A concentração de IR700 ou IR800 foi medida, respectivamente, por absorção a 689 nm ou 774 nm, com espectroscopia para confirmar o número de moléculas de conjugados com fluoróforo cada mAb. A síntese foi controlada de modo a que uma média de quatro moléculas IR700 e IR800 duas moléculas foram ligadas a um único anticorpo. Foi realizada SDS-PAGE como um controlo de qualidade para cada conjugado tal como anteriormente relatado [19]. Nós abreviar IR700 conjugado com trastuzumab como tra-IR700, a panitumumab como pan-IR700 e IR800 conjugado com trastuzumab como tra-IR800.}

células N87-GFP cultura celular
expressando estavelmente GFP foram adquiridos de câncer ANTI (San Diego, CA, EUA). elevada expressão de GFP foi confirmado, na ausência de um agente de selecção com 10 passagens. Para avaliar a morte celular específica por PIT, células 3T3 expressando estavelmente DsRed (3T3 /DsRed) foram usadas como um controlo negativo [5]. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino e 1% de penicilina /estreptomicina (Life Technologies) em frascos de cultura de tecidos numa incubadora humidificada a 37 ° C a uma atmosfera de 95 % de ar e 5% de dióxido de carbono

a microscopia de fluorescência

Para detectar a localização específica de antigénio de conjugados IR700 ea mudança na morfologia celular após PIT, microscopia de fluorescência foi realizada (IX61 ou IX81.; América Olympus, Melville, NY, EUA). Dez mil células foram semeadas em placas de cobertura de fundo de vidro e incubadas durante 24 hr. Tra-IR700 foi então adicionada ao meio de cultura (sem vermelho de fenol) a 10 ug /mL e incubou-se a 37 ° C durante 6 h. As células foram então lavadas com PBS; Iodeto de propídio (PI) (1:2000) ou Cytox azul (1:500) (Life Technologies) foi adicionado aos meios de comunicação 30 min antes da PIT para detectar células mortas. As células foram então expostas à luz NIR e as imagens foram obtidas em série. Um dia após a TIP, as células foram lavadas e incubadas com meio novo após TIP (0,5 J /cm ^{2) e PI foi novamente adicionada. Para assegurar que a mesma região foi representada por imagem marcações foram feitas em cada placa de cultura, para indicar onde a imagem foi adquirida. O filtro foi ajustado para detectar a fluorescência IR700 com um filtro de excitação de 590-650 nm, e uma banda de 665-740 nm, filtro de emissão de passar. Análise das imagens foi realizada com o software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/).}

Citometria de Fluxo

fluorescência a partir de células após incubação com pan-IR700 ou TRA-IR700 foi medida usando um citómetro de fluxo (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) e o software CellQuest (BD Biosciences). As células (1 x 10 ^{5) foram incubadas com conjugado de cada durante 6 h a 37 ° C. Para validar a ligação do anticorpo conjugado específico, foi utilizado excesso de anticorpo (50 ug) para bloquear a 0,5 ^ g de conjugados anticorpo-corante [8].}

In vitro PIT

Cem mil células foram semeadas em placas de 24 poços e incubou-se durante 24 h. O meio de cultura foi substituído com meio de cultura fresco contendo 10 ug /ml de TRA-IR700 e as células foram incubadas durante 6 horas a 37 ° C. Após lavagem com PBS, foi adicionado meio de cultura livre de vermelho de fenol. Em seguida, as células foram irradiadas com luz laser NIR em 685-695 nm comprimento de onda (BWF5-690-8-600-0.37; B &. W TEK INC, Newark, DE, EUA). A densidade de potência real de mW /cm ^{2 foi medida com um medidor de potência óptica (PM 100, Thorlabs, Newton, NJ, EUA).}

citotoxicidade ensaio

Os efeitos citotóxicos de PIT com TRA-IR700 foram determinadas por coloração de citometria de fluxo PI, que detecta as membranas celulares comprometidas. Para o ensaio de citometria de fluxo, as células foram tripsinizadas após tratamento de 1 hora e lavou-se com PBS. PI foi adicionado na suspensão de células (final de 2 ug /mL) e incubou-se à temperatura ambiente durante 30 min, seguido por citometria de fluxo.

A estimativa de intensidade de fluorescência da GFP in vitro

cem mil As células foram semeadas em placas de cobertura de fundo de vidro e incubadas durante 12 hr. Tra-IR700 foi então adicionada ao meio de cultura (sem vermelho de fenol) a 10 ug /mL e incubou-se a 37 ° C durante 6 h. As células foram lavadas com PBS e substituído com um, meio de cultura sem fenol vermelho novo e o lado inferior do vidro de cobertura foi marcada (para determinar a posição de observação). Após PIT, as células foram novamente incubadas durante 1 dia. Um dia após a TIP, as células foram novamente observada. A intensidade de GFP foi avaliada com o total de pixels com o mesmo limiar no mesmo campo [20]. A análise das imagens foi realizada com o software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/).

de fluorescência das células tratadas foi também medido usando um citómetro de fluxo (FACS Calibur).
animal e tumorais

Todos in vivo
procedimentos foram realizados em conformidade com o Guia para o Cuidado e Utilização de Recursos Animais de laboratório (1996), do Conselho Nacional de Pesquisa dos Estados Unidos, e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso do NIH animal. Seis ratinhos nus atimicos de homozigotos fêmea com oito semanas de idade foram adquiridos de Charles River (NCI-Frederick). A fim de avaliar o efeito somente a célula tumoral direta matando de in vivo
PIT, foram utilizados ratos nus imunocomprometidos. Durante os procedimentos, os ratinhos foram anestesiados com isoflurano. Dez milhões de células N87-GFP foram injectados por via subcutânea no dorso direito dos ratinhos. A fim de determinar o volume de tumor, o diâmetro maior longitudinal (comprimento) e o maior diâmetro transversal (largura) foram medidos com um compasso de calibre externo. Os volumes de tumor com base em medições de calibre foram calculados pela seguinte fórmula; volume do tumor = comprimento x largura ^{2 × 0,5. Os tumores que atingem cerca de 100 milímetros 3 em volume foram selecionadas para o estudo. Para medir a fluorescência da GFP após PIT, dez milhões de células N87-GFP foram injectados por via subcutânea em ambos dorsal dos ratos. Para o modelo do rato do cancro peritoneal disseminada, cinquenta milhões de células N87-GFP com PBS (total 300 mL) foram injetados na cavidade peritoneal.}

In vivo fluorescência imagiologia

In vivo
imagens de fluorescência foram obtidos com uma pérola Imager (LI-COR Bioscience) para detectar IR700 /fluorescência IR800 e um Imager Maestro (CRI, Woburn, MA, EUA) para GFP. Para GFP, foram utilizados um filtro passa-banda de 445-490 nm (excitação) e um filtro azul-passe longo sobre 515 nm (emissão). O filtro de emissão ajustável foi reforçada automaticamente em incrementos de 10 nm 500-600 nm para os conjuntos de filtros verdes na exposição constante (500 ms). As imagens de fluorescência espectrais consistem de espectros de autofluorescência e os espectros de GFP (GFP-tumoral N87), que foram, então, não misturadas, com base no padrão espectral característica de GFP, utilizando o software Maestro (CRI). Regiões de interesse (ROI) foram desenhados manualmente, quer no tumor flanco ou sobre a região abdominal conforme apropriado para o modelo e intensidade de fluorescência foi medida [19].

Caracterização do modelo de rato peritoneal disseminada

Ratos com câncer peritoneal, tanto disseminado (a 6 semanas após o implante de células) ou tumores do flanco (a 7 dias após o implante de células) foram injectados por via intravenosa com 100 ug de tra-IR700 e tra-IR800. Um dia após a injecção, imagens seriadas foram realizadas com uma pérola Imager para detectar IR700 /fluorescência IR800, e o maestro para GFP. imagens de luz branca dos ratos foram obtidos com um iphone5 (Apple Inc., Cupertino, CA, EUA).

In vivo PIT

A fim de avaliar o efeito do PIT no modelo de flanco , os ratinhos portadores de tumores N87-GFP foram divididos aleatoriamente em 4 grupos de, pelo menos, 10 animais por grupo como se segue: (1) nenhum tratamento (controlo); (2), apenas a exposição à luz NIR a 50 J /cm ^{2 no dia 1 e 100 J /cm 2 no dia 2; (3) 100 mg de tra-IR700 i.v., sem exposição à luz NIR; (4) 100 ug de TRA-IR700 i.v., luz NIR foi administrada a 50 J /cm 2 no dia 1 após a injecção e 100 J /cm 2 no dia 2 após a injecção. Estas condições foram aplicados a cada semana, durante até 3 semanas. Os ratinhos foram monitorizados diariamente, e as imagens de fluorescência foram obtidos começando 1 dia antes da PIT, e os volumes dos tumores foram medidos três vezes por semana até que o diâmetro do tumor atingir 2 cm, após o que os ratinhos foram sacrificados com dióxido de carbono. Para imagens de fluorescência, os ratinhos foram injectados com 100 ug de TRA-IR700 ou irradiados como se segue: (1) a luz NIR foi administrada a 50 J /cm 2 no dia 1 após a injecção e 100 J /cm 2 sobre dia 2 ao tumor direita (2) nenhuma luz NIR foi administrada ao tumor esquerda que serviu como o controlo. Controles incluído (1), apenas a exposição à luz NIR a 50 J /cm 2 no dia 1 e 100 J /cm 2 no dia 2 ao tumor direita; (2) nenhum tratamento para o tumor esquerdo}

Para avaliar o cancro peritoneal disseminada, os ratos foram divididos aleatoriamente em 4 grupos de 5 animais por grupo para os seguintes tratamentos:. (1) sem tratamento (controle); (2), apenas a exposição à luz NIR a 50 J /cm ^{2 no dia 1 e 100 J /cm 2 no dia 2; (3) 100 mg de tra-IR700 i.v., sem exposição à luz NIR; (4) 100 ug de TRA-IR700 IV, luz NIR foi administrada a 50 J /cm 2 no dia 1 e 100 J /cm 2 no dia 2 após a injecção.}

Análise estatística

Os dados são expressos como média ± SEM a partir de um mínimo de quatro experiências, salvo indicação em contrário. As análises estatísticas foram realizadas utilizando um programa de estatística (GraphPad Prism, GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA). Para comparações múltiplas, foi utilizado um one-way análise de variância (ANOVA) com pós-teste (teste de Kruskal-Wallis com pós-teste) e teste de Tukey. A probabilidade cumulativa de sobrevivência, aqui determinado como o diâmetro do tumor não conseguindo atingir 2 cm, foi estimada em cada grupo com o uso da análise da curva de sobrevivência de Kaplan-Meier, e os resultados foram comparados com o teste log-rank e teste de Wilcoxon. Estudante de t
teste também foi utilizado para comparar o in vitro
estudo de dois; p < 0,05 foi considerado para indicar uma diferença estatisticamente significativa

Resultados

Confirmação do perfil de expressão de células N87-GFP como um alvo para PIT

Foram examinados os sinais de fluorescência. de serviços pan-IR700 e tra-IR700 ligado às células N87-GFP por FACS. Após 6 horas de incubação com qualquer pan-IR700 ou tra-IR700, as células N87-GFP mostrou consistentemente maior brilho com tra-IR700 de pan-IR700 (Fig. 1A). Estes sinais foram quase completamente bloqueada pela adição de excesso de trastuzumab ou panitumumab, sugerindo ligação específica e confirmando a maior expressão de HER2 de EGFR [21]. Estes dados sugerem que HER2 era o alvo preferido para PIT em células N87-GFP, devido à sua maior expressão.

Microscopia in vitro PIT

microscopia de fluorescência de série de células N87-GFP foi realizada antes e depois de PIT. Após a exposição à luz NIR (2 cm J ^{2 /) inchaço celular, formação de vesícula e ruptura do lisossoma foram observadas, resultando na extrusão de citoplasma extracelularmente (Fig. 1B). coloração PI mostrou dano à membrana citotóxica aguda causada por PIT. A maioria destas alterações celulares foram observados dentro de 30 minutos de exposição à luz (Apoiar Informações S1 e S2). Nenhuma mudança significativa foi detectada em EGFR-negativos 3T3 irradiadas com luz NIR, sugerindo PIT induzida nenhum dano nas células não-alvo (Fig. S1).}

Avaliação in vitro PIT efeito

de modo a quantificar o efeito de in vitro
PIT, foi realizado um ensaio de citotoxicidade com base na incorporação de PI, que demonstrou que a morte celular aumenta com o aumento da dose de luz (Fig. 1C). Nenhuma citotoxicidade significativa foi detectada com a exposição à luz NIR ou tra-IR700 sozinho.

Avaliação com fluorescência da GFP in vitro após PIT

Um dia após a exposição à luz NIR de 0,5 J /cm ^{2, aproximadamente 50% das células mostraram citotoxicidade aguda (Fig. 1C), e a intensidade de fluorescência da GFP foi grandemente reduzida em células mortas coradas (positiva com PI), enquanto que a fluorescência de GFP foi preservada em células sobreviventes (Fig. 1D). Estes estudos sugerem que a GFP foi extrudida a partir da célula após a ruptura da membrana. A fim de investigar a alteração da fluorescência de GFP, foram comparadas as total de pixels da GFP no mesmo campo antes e um dia após a TIP (Fig. S2). A relação GFP fluorescência diminuiu diretamente com dose de luz, enquanto nenhuma diminuição foi detectado com a exposição à luz NIR ou tra-IR700 sozinho (Fig. 1E). Estes resultados foram confirmados por análise de FACS (Fig. 1F e a Fig. S3) e sugerem que PIT leva a uma diminuição da fluorescência de GFP após a morte celular por necrose fim de 1 dia após a TIP de forma dependente da dose de luz.}

In vivo PIT reduz o volume do tumor no modelo de xenotransplante flanco

em seguida, examinaram o efeito da PIT in vivo
no tumor flanco rolamento camundongos (Fig. 2A). PIT induziu reduções significativas no volume do tumor (n = 10 em cada grupo, * P = 0,0456 < 0,05, teste de Tukey). Quatro ratinhos de cada dez em grupo PIT foram completamente curado pelo tratamento (Fig. 2B). A sobrevivência foi prolongada significativamente no grupo PIT comparado com o grupo controle (n = 10 em cada grupo, ** p < 0,0001, long-rank eo teste de Wilcoxon) (Fig 2C.). Estes dados sugerem que PIT provocou redução significativa do tumor e sobrevivência prolongada in vivo
.

GFP fluorescência imagiologia após In vivo PIT no modelo de xenotransplante flanco

A fim de acompanhar in vivo
PIT, imagiologia GFP em tempo real foi realizada em ratos com N87-GFP tumores flanco bilateral (Fig. 3a). GFP fluorescência demonstrou carga tumoral ea resposta ao PIT. fluorescência da GFP foi correlacionada com IR700 de fluorescência, que rapidamente diminuiu após PIT (Fig. 3C). imaging total de fluorescência (TFI) da GFP em tumores não tratados (controle) e em tumores que receberam luz aumentou apenas devido ao crescimento do tumor. Em tumores tratados com PIT, TFI de GFP diminuiu gradualmente no tumor tratado, enquanto o tumor oposto no mesmo rato (iv única, sem luz) demonstrou aumento fluorescência da GFP (Fig. 3B).

Quantificação do total GFP intensidade de fluorescência revelou que houve uma diminuição significativa após TIP (n = 5 ratinhos em cada grupo, * P = 0,0118 < 0,05, ** p = 0,0010 < 0,01, *** p = 0,0049 < 0,01, teste de Tukey com ANOVA) (Fig. 3C). Devido ao tumor re-crescimento, a relação GFP aumentou de novo a partir do dia 4 depois PIT, embora tenha sido menor do que outros grupos de controle. O tempo real de imagens GFP fluorescência e sua quantificação permitiu a comparação em tempo real dos grupos e mostrou uma forte correlação entre maior fluorescência da GFP e progressão do tumor em cada grupo
.

Para confirmar este efeito, ex vivo
análise foi realizada (Fig. 4A). O efeito PIT foi confirmado com uma diminuição da fluorescência IR700 (Fig. 4B). Sob esta condição, a intensidade da GFP de ex vivo
tumores diminuíram após PIT (Fig. 4B). Estes dados sugerem que em tempo real GFP imagens ao vivo é consistente com ex vivo
imagem.

Quando PIT foi repetido semanalmente, atividade GFP fluorescência acabou por desaparecer (Fig. 4C e D), indicando completa morte do tumor.

Caracterização do modelo peritoneal disseminada com imagens de fluorescência

a fim de determinar a história natural do modelo peritoneal disseminada, imagens de fluorescência de série foi realizada. Os tumores implantados demonstrado sinal de fluorescência com elevada IR700, IR800, e GFP, todos os quais co-localizada com o outro (IR800 foi usada para evitar a autofluorescência intestinal) (Fig. 5). Estes dados sugerem que este modelo de cancro peritoneal disseminada pode ser monitorado em ratos vivos usando GFP fluorescência.

GFP fluorescência imagiologia após In vivo PIT no modelo peritoneal disseminada

Em tempo real de imagens GFP fluorescência foi realizada no modelo peritoneal divulgados antes e após a TIP (Fig. 6A). IR700 fluorescência diminuiu após PIT (Fig. S4). GFP TFI aumentado gradualmente nos grupos não-pit devido ao crescimento do tumor. No grupo tratado PIT, GFP TFI diminuiu de 1 dia a três dias após a TIP (Fig. 6B). Quantificação da intensidade total de GFP de fluorescência revelou uma diminuição significativa após TIP (n = 5 ratinhos em cada grupo, * P = 0,0295 < 0,05, ** p = 0,0355 < 0,05, teste de Kruskal-Wallis com pós-teste) (fig. 6C). Devido ao tumor re-crescimento, a taxa de GFP aumentou de novo a partir de 4 dias após a TIP, embora seja mantida mais baixa do que outros grupos, como observado com o modelo de tumor do flanco. Assim, PIT causado significativa do tumor alvejado matando efeito em ambos os flancos e modelos de tumor peritoneal disseminados e isso pode ser monitorizada com GFP TFI.

Discussão

Este estudo demonstra que o efeito do PIT pode ser monitorizados com imagiologia de fluorescência de GFP. Ao contrário de apoptose [12], [13], em que GFP e proteínas fluorescentes relacionadas se tornar mais brilhante devido ao volume citoplasmático decrescente, durante a morte celular por necrose com PIT, dano à membrana conduz à libertação de conteúdos citoplasmáticos incluindo GFP. Esta característica única de GFP e proteínas fluorescentes relacionadas torna biomarcadores úteis para PIT.

In vivo
GFP fluorescência de imagem permite que o processo completo de desenvolvimento de neoplasias, o tratamento, a regressão, metástase ou recorrência, a ser detectado no mesmo animal sem procedimentos invasivos [10], [11]. Pelas células que expressam GFP citoplasmática empregando, os efeitos anti-tumorais induzidas pelo PIT pode ser facilmente monitorado devido à extrusão de GFP a partir de células tratadas.

O conceito de usar a terapia da luz alvejado é mais de três décadas de idade [22]. Devido à hidrofobicidade dos sensibilizadores tradicionais terapia fotodinâmica (PDT), a farmacocinética do anticorpo conjugado com agentes de PDT é altamente limitada na sua capacidade para proporcionar conjugados para o alvo. Portanto, sensibilizadores de PDT com anticorpos direcionados só foi bem sucedida em modelos em que o conjugado foi injectado directamente no tumor ou peritoneu [23]. A fim de proporcionar um conjugado anticorpo-fotossensibilizador (APSC) sistemicamente, o fotossensibilizador deve ser preferencialmente hidrofílico. O fotossensibilizador à base de ftalocianina hidrófilo, IR700DX quando conjugado com um anticorpo se torna uma APC que pode ser administrada por via intravenosa. Esta forma de terapia, denominado PIT, difere da tradicional PDT não só na hidrofilicidade do fotossensibilizador, mas também na sua dependência de luz NIR para activar o fotossensibilizador. NIR luz tem melhor penetração nos tecidos do que a luz de comprimento de onda inferior utilizado em PDT. Esta nova geração de APCs demonstra farmacocinética intravenosa semelhantes a anticorpos nus, resultando na acumulação de tumor altamente segmentados com ligação mínima não alvo e pode ser aplicada a um largo espectro de anticorpos, permitindo que muitas aplicações potenciais em todo o corpo.

Apesar quimioterapia citotóxica, o resultado para câncer em estágio gástrico avançado continua a ser pobre. Porque, a maioria dos pacientes com metástases peritoniais apresentam sintomas insidiosos, como falta de apetite, perda de peso, sensação de inchaço, dor ou diagnóstico de anemia é muitas vezes adiado e terapias locais não são mais viável [24]. PIT é um método promissor para o tratamento do cancro peritoneal disseminada. A fim de realizar PIT eficaz, o APSC deve ser entregue sistemicamente e a luz deve ser aplicado selectivamente ao peritoneu. Nestas condições, há um escoamento suficiente de PALOPs a resultar na redução de tumores disseminados após PIT. Este processo pode ser monitorado em tempo real com o in vivo
GFP fluorescência de imagem.

Existem várias limitações para este estudo. Deve notar-se que nem todos os cancros gástricos expressão de HER2 e por conseguinte, TRA-IR700 não pode ser uniformemente eficaz em cancro gástrico disseminada. Na verdade, pode ser necessário usar de um cocktail de PALOPs para cobrir eficazmente a maioria dos perfis de expressão de um dado tumor [25]. Outra ressalva neste estudo é de que a luz pode ser administrado por via transcutea ratinhos em pequenas mas isto não é possível em humanos. De modo a tratar eficazmente os seres humanos com PIT, será necessário aplicar luz por laparoscopia para evitar a absorção pela pele. Outra limitação é que o nosso modelo só foi avaliada em ratinhos imunocomprometidos. A reação imunológica do PIT será avaliada no futuro em camundongos imunocompetentes. Finalmente, na imagiologia de fluorescência da GFP prazo próximo será limitado a estudos em animais, uma vez que requer a transfecção do tumor com uma proteína endógena. No entanto, esta é uma leitura útil para estudos pré-clínicos.

Conclusões

PIT é eficaz contra câncer gástrico carcinomatose peritoneal HER2-positivo em um imaging modelo do rato e fluorescência da GFP permite o monitoramento dos efeitos de IRS.

Informações de Apoio
Figura S1.
morte celular por necrose específicos orientados foi observada após PIT in vitro.
células N87-GFP foram co-cultivados com 3T3 (sua não-expressando) células /DsRed. Eles foram tratados com tra-IR700 e observados (antes e após a irradiação de luz NIR). a morte celular por necrose específica alvo foi observada após excitação com luz NIR (após 30 min). Nenhum dano foi demonstrado em 3T3 /células dsRed. . * Células 3T3 /DsRed, Bar = 25 um
doi: 10.1371 /journal.pone.0113276.s001
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Figura S2.
diminuição da fluorescência a-GFP um dia após a TIP foi observada in vitro.
de diminuição da intensidade de fluorescência de GFP-fim de 1 dia após a TIP foi observada ser de uma forma dependente da dose de luz. Barra = 100 um. A linha preta na borda foi o marcador para determinar a posição de observação
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113276.s002
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Figura S3.
diminuições na GFP-fluorescência em 1 dia após PIT avaliados por citometria de fluxo. A diminuição da intensidade de fluorescência de GFP-fim de 1 dia após a TIP foi de uma forma dependente da dose de luz por meio de análise de citometria de fluxo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113276.s003
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Figura S4.
In vivo
fluorescência de imagem em resposta ao PIT repetido na peritoneal disseminada modelo de camundongos. In vivo
fluorescência de imagem em resposta ao PIT repetido. fluorescência IR700 foi diminuída em resposta ao PIT
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113276.s004
(TIFF)
Vídeo S1. Images of Time-lapse DIC de uma célula N87-GFP tratado por cova. imagens de lapso de tempo sequenciais DIC (vídeo) de uma célula N87-GFP mostra alterações na morfologia da célula após a irradiação de luz NIR em células tratadas com tra-IR700 (para 25 min de observação no total). Piscar a luz é irradiação NIR de luz (2 J /cm ^{2)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113276.s005
(AVI)
Vídeo S2.
Time-lapse imagens PI fluorescência de uma célula N87-GFP tratado por PIT. seqüenciais imagens PI fluorescência de lapso de tempo (vídeo) mostra dano à membrana rápida de uma célula N87-GFP após a irradiação de luz NIR em células tratadas com tra-IR700 (para 25 min de observação no total). Piscar a luz é irradiação de luz NIR (2 J /cm 2)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113276.s006
(AVI)}

Reconhecimentos

esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de investigação Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Câncer, Centro de pesquisa do Câncer. Kazuhide Sato é suportado com JSPS Research Fellowship for Biomedical japonês e pesquisadores Comportamental no NIH.

• PLOS ONE: MED30 Regula a proliferação ea motilidade do câncer gástrico Cells
• PLoS ONE: Comparativo Proteomics Análise de câncer gástrico Stem Cells