PLOS ONE: Zic1 hipermetilação do promotor no DNA plasma é um potencial biomarcador para o câncer gástrico e Intraepithelial Neoplasia

Abstract

O câncer gástrico (GC) continua a ser um dos cancros digestivos mais comuns em todo o mundo; no entanto, a maioria dos pacientes apresentar em um estágio avançado no momento do diagnóstico inicial. Zic1
é um gene supressor de tumor candidato romance que é epigenetically silenciada na GC. Neste estudo, nós investigamos Zic1
metilação do promotor no DNA no plasma como um marcador molecular da novela para o diagnóstico precoce e acompanhamento de GC. ensaio de metilação específicas de reação em cadeia da polimerase (MSP) foi realizado para detectar Zic1
metilação do promotor no DNA plasma de 20 voluntários saudáveis, 50 pacientes neoplasia intra-epitelial gástrico e 104 pacientes do GC. O Zic1
taxa de metilação do promotor nas amostras de plasma do grupo de controle saudável foi de 0%, mas atingiu 54,0% no grupo de neoplasia intra-epitelial e 60,6% no grupo GC. Os dois últimos valores foram significativamente mais elevada do que a encontrada no grupo de controlo saudável (p < 0,05), com uma especificidade de 100% para a neoplasia intra-epitelial e diagnóstico de GC. O valor preditivo positivo de plasma Zic1
metilação do promotor para o diagnóstico de neoplasia intra-epitelial e GC foi de 100%. estado de metilação no grupo GC não foi significativamente associada com o tamanho do tumor, diferenciação tumoral, metástase linfonodal, estadiamento TNM, ou invasão tumoral (p > 0,05). Avaliação do significado da detecção do antigénio carcino-embrionário (CEA) e nível Zic1
taxa de metilação do promotor para o diagnóstico CG revelou que a sensibilidade de Zic1
metilação do promotor foi significativamente mais elevada do que a de o nível de CEA como um marcador e que a medição combinada destes dois índices (testes em paralelo) melhorou a sensibilidade. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que o Zic1
taxa de metilação do promotor no DNA derivado de plasma é de grande importância para o rastreio precoce de GC e acompanhamento de desenvolvimento de neoplasias. Zic1
metilação do promotor pode servir como um biomarcador plasma não-invasivo da novela para a detecção precoce de GC e para a avaliação de risco em populações de alto risco. A medição combinada do Zic1
taxa de metilação do promotor e nível de CEA (testes em paralelo) pode aumentar as actuais orientações para o diagnóstico precoce da GC

Citation:. Chen X, Lin Z, Xue M , Si J, Chen S (2015) Zic1
hipermetilação do promotor no DNA plasma é um potencial biomarcador para o câncer gástrico e neoplasia intra-epitelial. PLoS ONE 10 (7): e0133906. doi: 10.1371 /journal.pone.0133906

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPÃO

Recebido: 10 Abril 2015; Aceito: 02 de julho de 2015; Publicação: 24 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (81302070, 81372623) (http://www.nsfc.gov.cn), Zhejiang provincial médicos e plano de saúde geral de pesquisa (2014KYB121) (http://www.zjwst.gov.cn/), Zhejiang provincial Departamento de plano de pesquisa Educação (Y201327398) (http://www.zjedu.gov.cn) e equipe de ciência e inovação tecnológica chave província de Zhejiang (2013TD13) (http://www.zjkjt.gov.cn/). O financiador Shujie Chen concebido e desenhado os experimentos para este manuscrito

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer gástrico (GC) é um dos cancros digestivos mais comuns ea terceira principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1]. A maioria dos pacientes apresentam GC numa fase avançada no momento do diagnóstico inicial. Globalmente, a GC é responsável por cerca de 952.000 novos casos anualmente de acordo com Globocan 2012 [2]. No Japão, a taxa de sobrevida em 5 anos para o início de GC (EGC) é de 86% em comparação com 32% para a GC avançado, conforme relatado pelo programa SEER US [3].

metilação do DNA aberrante é uma epigenético importante mudança e um evento precoce na carcinogénese [4]. Recentemente, vários genes supressores de tumor (ETG), incluindo FAM5C
, mylk
, p16
e E-caderina
, foram relatados para ser metilado no soro /plasma de pacientes GC [5-7]. Além disso, a hipermetilação de ETG tende a ser reforçada com a progressão de lesões pré-cancerosas [8-9]. Portanto, a detecção de ADN metilado no soro /plasma pode ser uma abordagem promissora para o diagnóstico precoce de GC. neoplasias intra-epiteliais (EM) é uma lesão pré-cancerosa potencial, que confere um risco elevado de GC; Assim, a triagem de pacientes nos é fundamental para o diagnóstico e previsão de GC. Poucos relatos de DNA hypermethylated análises de amostras de sangue de neoplasia intra-epitelial gástrico (GIN) pacientes estão disponíveis até à data.

A evidência crescente indica que Zic1
( Zic
membro da família 1 , odd-emparelhado homólogo Drosophila) participa na progressão de vários cancros [10-13]. Temos descoberto anteriormente que Zic1
, um romance TSG, é silenciado através de hipermetilação do promotor em ambas as células GC e tecidos [14]. Nós também têm demonstrado que Zic1
está envolvida na inibição da sobrevivência de células GC e comprometimento da migração celular [15].

No presente estudo, determinou-se as potencialidades de diagnóstico e previsão de início Zic1
hipermetilação no plasma de pacientes do GC. Medimos o status de metilação do promotor de Zic1
no plasma de pacientes com controles normais (NC) GC ou GIN e. A associação de Zic1
metilação do promotor com os parâmetros clínico também foi avaliado. Além disso, classificadas de alto grau IN e T1 GC como EGC e colocou os pacientes do GC e gim num GC Plus em grupo (GPI). Em seguida, analisamos o Zic1
taxas hipermetilação, tanto no EGC e grupos GPI. Além disso, a avaliação combinada do antigénio carcino-embrionário (CEA) nível e Zic1
metilação do promotor para o diagnóstico GC foi avaliada utilizando plasma dos pacientes do GC e gim.

Materiais e Métodos

amostras clínicas

as amostras de plasma foram obtidos no pré-operatório para Sir Run Run Shaw Hospital, Hangzhou, Zhejiang, China, a partir de novembro de 2012 a abril de 2015. Todos os pacientes incluídos no estudo foram submetidos a gastroendoscopy e foram agrupados de acordo com o diagnóstico histopatológico. As amostras de plasma foram coletadas de pacientes do GC e gim que estavam ingênuo tratamentos curativos, como a quimioterapia, radioterapia e ressecção cirúrgica. Os critérios de exclusão incluíram doenças gastrointestinais com outras causas e doenças em outros órgãos. Os pacientes com metástases gástricas de outros tumores foram também excluídas.

numeradas as amostras de acordo com a ordem na qual eles foram recolhidos e, em seguida, realizada de reacção em cadeia da polimerase-metilação específico (MSP) para avaliar as amostras em ordem numérica. As amostras foram ainda agrupados de acordo com os resultados de patologia. As amostras de plasma foram coletadas de 104 pacientes GC com uma idade média de 59,8 anos que foram diagnosticados de acordo com os critérios da Organização Mundial da Saúde [16]. Cinquenta pacientes GIN com uma idade média de 58,0 anos foram diagnosticados por gastroscopia. Amostras de sangue também foram coletadas de 20 voluntários saudáveis ​​no grupo NC, com uma idade média de 38,5 anos.

Ética declaração

Nosso projeto recebeu aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Clínica do Instituto de Gastroenterologia da Universidade de Zhejiang. consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente antes da coleta da amostra. Os indivíduos que participaram do estudo assinaram consentimento informado (conforme descrito na PLOS
formulário de consentimento) para publicar estes detalhes do caso.

isolamento de ADN e modificação bisulfite

DNA extraiu-se as amostras de plasma utilizando um DNA QIAamp sangue Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). As concentrações de DNA foram medidas por espectroscopia a um comprimento de onda de 260 nm. ADN foi bissulfito-tratada com um kit de ADN Zymo modificação (Zymo Research, Orange, CA, EUA). O ADN modificado foi armazenado a -20 ° C até à sua utilização.

Os ensaios de MSP

Zic1
metilação do promotor foi examinada através da realização de ensaio de MSP usando o acima mencionado livre modificado com bissulfito DNA plasmático como molde. MSP foi realizada durante 40 ciclos a uma temperatura de recozimento de 56 ° C como descrito anteriormente [14]. Os iniciadores específicos de metilação foram ZIC1-MF (5'-GGATTTTTTGTTTCGTAATC) e ZIC1-MR (5'-CCCGTTAACCACGTTAAACG), e os iniciadores específicos não metilados foram-ZIC1-F (5'-GGGATTTTTTGTTTTGTAATT) e ZIC1-UR (5'- CCCATTAACCACATTAAACA). O protocolo de PCR incluiu desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 30 s, emparelhamento a 56 ° C durante 40 s, de prolongamento do iniciador a 72 ° C durante 40 s, e extensão final a 72 ° C durante 7 min. Os produtos de PCR foram sujeitos a electroforese em gel de agarose 1,5%, corado com Gel Vermelho, e visualizados por iluminação UV.

Serum CEA testes

As amostras de soro foram enviadas para o laboratório clínico de Sir Run Run Hospital Shaw para teste, e uma concentração de ACE > 5 ng /mL foi considerado como anormal.

Análise estatística

As frequências de metilação e níveis de CEA em amostras de plasma foram comparadas pelo teste exato de Fisher. A associação entre as características clínicas e hipermetilação DNA foi analisado utilizando o teste do qui-quadrado. O valor diagnóstico da combinação de Zic1
metilação do promotor e do nível CEA plasma foi avaliada de acordo com a área sob a curva ROC (AUC). A sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivos e negativos para diagnóstico patológico foram calculados com intervalo de confiança de 95% para Zic1
metilação do promotor ou Zic1
metilação do promotor combinado com o nível de CEA. razões de probabilidade positivas e negativas também foram calculados. Para todos os testes, um valor de corte de p < 0,05 foi aplicada para determinar a significância estatística. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).

Resultados

Padrão de metilação no
plasma

Para avaliar alterações em Zic1
metilação do promotor no GC, primeiro detectou o estado de metilação deste promotor em 104 pacientes com GC, 50 com GIN, 31 com EGC e 20 CNs e realizou comparações entre os grupos. As taxas de metilação do Zic1
promotor nas amostras de plasma foram de 0% no grupo NC (0%), o aumento de 54,0% no grupo GIN e de 60,6% no grupo GC (p < 0,001 tanto para GIN e GC vs. NC), com 100% de especificidade para o diagnóstico de GPI (20/20) (Figura 1). Os valores preditivos positivo e negativo e razões de probabilidade positivas e negativas para o diagnóstico IN e GC foram de 100% (90/90), 23,8% (20/84), infinito e 0,42, respectivamente. Os resultados do ensaio MSP Representante para Zic1
metilação do promotor são mostrados na figura 2.

Associação de características clínico-patológicas com Zic1
metilação do promotor no plasma de pacientes GC

em seguida, correlacionados as características clínico-patológicas com a Zic1
taxa de metilação do promotor no plasma dos pacientes GC para identificar quaisquer associações. Os resultados não revelaram associações marcantes entre o Zic1
taxa de metilação do promotor e dos parâmetros clínicos, incluindo o tamanho do tumor, grau de diferenciação, status do nó de linfa, profundidade de invasão tumoral e estádio TNM (p > 0,05) (Tabela 1) .

determinação combinada de Zic1
hipermetilação e nível de CEA

a importância da determinação combinada do Zic1
taxa de hipermetilação eo nível CEA para o diagnóstico e detecção precoce do GC foi analisada. Nós medimos o nível de CEA em 9 CNs, 24 pacientes GIN e 71 pacientes GC antes do tratamento. As sensibilidades do nível de CEA nos grupos GC, EM, e EGC foram 22,5% (16/71), 16,7% (4/24) e 10,5% (2/19), respectivamente. Em todos os três dos grupos, a sensibilidade de Zic1
metilação do promotor foi significativamente maior do que o do nível de ACE (p < 0,05).

determinação Combinada de Zic1
hipermetilação e nível de CEA no grupo GC.

no grupo GC, a sensibilidade e especificidade da determinação combinada do Zic1
taxa de metilação do promotor e do nível CEA (testes em tandem) foram de 16,9 % e 90,9%, respectivamente (Tabela 2). A sensibilidade da análise combinada destes dois parâmetros (testes em paralelo) era 69,0% (Tabela 2), que foi mais elevada do que as sensibilidades obtidas pelo ensaio de qualquer um dos parâmetros sozinho. análise da curva ROC foi realizada para avaliar a importância da taxa de metilação de ADN e nível de CEA para o diagnóstico de GC. A AUC para Zic1
testes de metilação do promotor só foi 0,610 (S1 Fig) e que para a avaliação combinada de Zic1
metilação do promotor e do nível CEA (testes em tandem) foi 0,539 (S2 Fig) . Notavelmente, quando Zic1
metilação do promotor e o nível de CEA foram testadas em paralelo, a AUC aumentada para 0,633 (Figura 3). Com base nos resultados acima, a determinação da combinadas Zic1
taxa de metilação do promotor e o nível de CEA (testes em paralelo) para o diagnóstico de GC mostrou ser sinérgico em comparação com a utilização de cada um dos métodos sozinho.

determinação combinada de Zic1
hipermetilação e nível de CEA no grupo GPI.

no grupo GPI, a sensibilidade e especificidade da determinação combinada da em> Zic1
taxa de metilação do promotor Zic1
testes de metilação do promotor só foi 0,792 (S3 Fig) e que, para a avaliação conjunta do Zic1
taxa de metilação do promotor e do nível CEA (testes em paralelo) foi 0,771 (Fig 4). Portanto, a detecção de Zic1
metilação do promotor pode ser uma alternativa mais eficaz para o diagnóstico de GPI.

Discussão

Recentemente, numerosos genes foram encontrados para ser metilado em tecidos GC , incluindo E-caderina
, RASSF1A
, p16
, GSTP1
, SOCS1
, SFRP1
e PTEN
[17]. frequências de metilação relatados variaram de 56% a 96% [17]. A metilação do DNA também foi observada em amostras de sangue de pacientes de GC. Vários ETG foram encontrados para ser metilados em amostras de sangue de pacientes GC, incluindo p16
, E-caderina
, e RAR
, com taxas de detecção de 37% para 48%, respectivamente [18-21].

Zic1
é aberrante reprimidos em certos tipos de câncer, indicativos de sua função como um TSG. Nosso trabalho anterior revelou que o Zic1
promotor é frequentemente metilado em tecidos de carcinoma gástrico primários, com uma alta taxa de detecção de 94,6%, mas não em tecidos gástricos normais [14]. Nossos resultados revelaram que Zic1
é um candidato romance TSG que é regulada negativamente via hipermetilação do promotor em GC. plasma No entanto, com o melhor de nosso conhecimento, nenhum estudo investigou Zic1
metilação do promotor em GC ou GIN.

No presente estudo, demonstrou pela primeira vez que a metilação aberrante do Zic1
promotor poderia ser detectado no plasma de pacientes de GC e GIN a frequências de 60,6% e 54,0%, respectivamente, que eram significativamente mais elevada do que a dos NCs. Estes resultados são consistentes com os de estudos anteriores [14]. Do ponto de vista diagnóstico, Zic1
metilação do promotor apresentou elevada especificidade para discriminar os CNs dos pacientes GC e GIN (100%). Nossos resultados também demonstraram que a detecção do Zic1
taxa de metilação do promotor tinha um alto valor preditivo positivo e razão de verossimilhança positiva e AUC para o GC e diagnóstico GIN, sugerindo que Zic1
avaliação promotor metilação tem utilidade potencial para o diagnóstico e detecção precoce do GC.

Muitos estudos anteriores têm-se centrado na metilação do DNA do sangue periférico em GC, em vez de pacientes GIN, com apenas um punhado de estudos sobre a metilação do DNA no GIN. O desenvolvimento de técnicas endoscópicas tem permitido a disponibilidade de tratamentos mais eficazes e menos invasivos para pacientes EGC e gim. No geral, o rastreio para GIN contribui para o monitoramento da GC e da redução das mortes relacionadas com o GC. Um aspecto interessante do presente estudo é demonstrado que aberrante Zic1
metilação do promotor no plasma de doentes Gin, com uma taxa de detecção de que foi significativamente maior do que a dos sujeitos NC (p < 0,001). No futuro, a detecção de hipermetilação do Zic1
promotor poderia ser usado como um sinal de alerta precoce ou para o rastreio de GC em grupos de alto risco.

Também avaliamos Zic1
metilação do promotor no plasma de doentes GC em associação com vários parâmetros clínico. Não foram observadas relações significativas entre o Zic1
metilação do promotor e os diversos parâmetros clínicos, incluindo o tamanho do tumor, grau de diferenciação, status do nó de linfa, profundidade de invasão tumoral e estádio TNM; no entanto, em nosso estudo anterior [15], Zic1
metilação tem sido encontrado para ser envolvido na invasão GC. No presente estudo, a maioria dos pacientes do GC foram diagnosticados e tratados numa fase precoce, o que pode ter influenciado os resultados finais. Validação em uma população maior pode fornecer insights sobre estes resultados divergentes. Se existe alguma correlação entre aberrante Zic1
metilação do promotor e as características clínicas GC exige clarificação por uma análise mais aprofundada.

CEA é um marcador tumoral clássico que é comumente avaliado na clínica. Este marcador é considerado o mais frequentemente presente em pacientes GC final; No entanto, muitos estudos indicaram que a metilação de ADN pode ser detectado a partir dos estágios iniciais de GC. Em nosso estudo, uma curva ROC foi gerado para avaliar a importância da detecção combinada do Zic1
taxa de metilação do promotor e nível de CEA (testes em paralelo) para o diagnóstico de GC, revelando que a sua detecção combinada produziu mais resultados significativos do que a detecção de qualquer parâmetro sozinho. Portanto, sugerimos que a medida combinada da Zic1
taxa de metilação do promotor e do nível CEA pode aumentar o diagnóstico de GC.

Em conclusão, nossos resultados revelaram que a medição de Zic1
metilação do promotor no DNA derivado de plasma é de importância para a detecção precoce de GC e para a avaliação de risco em populações de alto risco. A medição combinada do Zic1
taxa de metilação do promotor e nível de CEA (testes em paralelo) pode melhorar as actuais orientações para o diagnóstico precoce de GC; no entanto, são necessários mais estudos com amostras maiores e validação clínica.

Informações de Apoio
S1 Fig. Detecção de amostras de plasma Zic1
metilação do promotor no câncer gástrico (GC).
Uma curva ROC para avaliar o significado do Zic1
testes de metilação do promotor para o diagnóstico GC.
Doi : 10.1371 /journal.pone.0133906.s001
(TIF)
S2 Fig. detecção combinada de amostras de plasma Zic1
metilação do promotor e do nível CEA (testes em tandem) em câncer gástrico (GC).
Uma curva ROC para avaliar a importância da detecção combinada dos dois parâmetros (teste em tandem .) para o diagnóstico GC
doi: 10.1371 /journal.pone.0133906.s002
(TIF)
S3 Fig. Detecção de amostras de plasma Zic1
metilação do promotor de neoplasias intra-epiteliais gástricas (GPI).
Uma curva ROC para avaliar o significado do Zic1
testes de metilação do promotor para o diagnóstico GPI.
doi: 10.1371 /journal.pone.0133906.s003
(TIF)

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