infecção por Helicobacter pylori Citation:. Li G, H Wulan, Song Z, Paik PA, Tsao ML, Goodman GM, et al. (2015) Regulatory Função B celular é suprimida pelo tabagismo e obesidade em H editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPÃO Recebido: 03 de fevereiro de 2015; Aceito: 13 de julho de 2015; Publicação: 30 de julho de 2015 Direitos de autor: © 2015 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes Introdução Helicobacter pylori (H Recentemente, o papel de tolerance- indução de células B tem sido caracterizado por uma série de doenças infecciosas e doenças auto-imunes [12]. Em camundongos, CD1d hiCD5 + B células foram encontrados para ajudar a estabelecer ambiente tolerogênico em tecidos e ter um papel na prevenção de indução auto-imune [13]. Nos seres humanos, as células CD19 + CD24 hiCD38 oi B têm semelhante tolerância de indução de papel no saudável, bem como indivíduos infectados pelo VHB [14]; o início da doença auto-imune está correlacionada com a perda da função reguladora neste subconjunto de células B [15]. IL-10 é uma citocina imuno-regulador pleiotrópico que é capaz de inibir uma série de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-2, IL-17, IFN-g e TNF-a, e é mostrado para suprimir potencialmente a capacidade apresentadora de antigénio de As células apresentadoras de antigénio [16]. Central para todos os subconjuntos de células B de indução de tolerância, a produção de IL-10 é essencial para B regulação mediada por células na supressão da inflamação mediada por células T [12,17]. O papel da regulação mediada por células B em H Neste estudo, analisamos o perfil de composição de células B e de expressão das citocinas em H Os sujeitos do estudo Foram obtidas amostras de sangue periférico primárias 55 H periféricos células mononucleares do sangue (PBMC) foram isoladas de amostras de sangue periférico com procedimento de Ficoll-Hypaque padrão e congelados imediatamente em -150 ° C até à sua utilização, ou utilizados em experiências imediatamente se observou. meio de cultura regular é meio RPMI-1640 suplementado com soro fetal bovino a 10%, 5 mL de 100 U de penicilina /0,1 mg /mL de estreptomicina, e 5 mL de L-glutamina 2mM. As células foram cultivadas em 5% de CO 2 a 37 ° C durante o período de tempo indicado. T e B foram isolados utilizando celular T humanas ou células B negativa Kit Selection (Stemcell, Vancouver, Canadá), seguindo protocolos fornecidos pelo fabricante. As purezas dos isolamentos de células T e B foram superiores a 94% por citometria de fluxo. Para a depleção de CD24 + CD38 + B células Em algumas experiências, as células B purificadas foram coradas com PE anti-humano CD24 e APC CD38 anti-humano durante 30 min. As células foram, em seguida, enviado para viver e separação de células CD24 + CD38 + células foram esgotados. Na configuração de célula inteira B, células totais B foram enviados para viver separação de células, sem os anticorpos Foram utilizados os seguintes anticorpos monoclonais anti-humanos:. IL-10, TNF- um (eBioscience, San Diego, CA, EUA); CD3, CD4, CD19, CD20, CD21, CD24, CD27, CD38 (BioLegend, San Diego, CA, EUA); IFN-g (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA); CD8 (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA). Purificada de IgG humana (BioLegend, San Diego, CA, EUA) foi utilizado para bloquear os receptores Fc, quando coloração contendo populações de células B. Para algumas experiências,-forbol 12-miristato-13-acetato (PMA, Sigma), ionomicina (Sigma, Munique, Alemanha), ou H IL-2, IL-17, IFN-g, TNF-a e IL-10 a partir de células T e as células B foram medidos quantitativamente por ensaio Luminex multiplex seguindo protocolos fornecidos pelo fabricante, com modificações (EMD Millipore, Etobicoke, Canadá). Um total de 2x10 5 células T e /ou células B foram semeadas em cada poço da placa de 96 poços (Corning, Tewksbury, MA, EUA). Para a estimulação das células B, mortas pelo calor H D'Agostino e Pearson teste de normalidade omnibus foi usado para examinar se os dados foram distribuídos normalmente. one-way análise de variância (ANOVA) foi utilizada para as comparações entre vários grupos, seguido pelo teste de Dunn. O teste t de Student foi utilizado para comparações entre os dois grupos. Se os conjuntos de dados significativamente desviado distribuição normal, foram utilizados testes não paramétricos. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando Prism (GraphPad Software). P < 0,05 foi considerado significativo. Os resultados foram apresentados como média ± S.E.M. H Para analisar as possíveis mudanças no papel das respostas de células B no H Circulação células B no sangue periférico de indivíduos saudáveis são compostas principalmente de IgD + CD27 - células B virgens e CD21 + CD27 + descansando células B de memória, enquanto que em infecções crónicas, existe, frequentemente, uma diminuição de células B virgens e que descansa células B de memória, e um aumento em CD21 lo células B activadas e CD24 + CD38 + células B [15,18]. Em primeiro lugar, examinou a composição das células B em circulação no H Anteriormente, as células B foram encontrados para amplificar ou suprimir as respostas imunes através da produção de uma série de citoquinas com funções diferentes, incluindo pro- citoquinas inflamatórias, tais como IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IFN-g e TNF-a, bem como IL-10 e fator de crescimento transformador beta (TGF-b), como citoquinas reguladoras [19] . Aqui, examinámos a expressão de citoquinas de células B em sujeitos do estudo. Verificou-se que o ex vivo CD24 + CD38 + B células têm funções reguladoras em outros estudos e tinha níveis de expressão interessantes em diferentes H Em conjunto, estes dados demonstraram que a citocina reguladora IL-10 é produzida principalmente por CD24 + CD38 + células B e é aumentado em H células B reguladoras eram conhecidos por inibir as respostas de células T em infecções crónicas, tais como a infecção da hepatite B e infecção pelo vírus da imunodeficiência humana [14,20], através do estabelecimento de tolerogénico ambiente através de IL-10 antes da indução da inflamação [15,21]. Nós examinamos se o CD24 IL-produzindo-10 + CD38 + B células teve efeitos regulatórios semelhantes em H A seguir, procurou examinar o mecanismo de IL-10 regulação positiva nas células B de H
ocorre em mais da metade da população do mundo e é a principal causa para o câncer gástrico. Uma série de estilo de vida e nutricionais fatores, como tabagismo e obesidade, foram encontrados para elevar o risco de desenvolvimento de câncer. Neste estudo, buscou-se determinar os aspectos imunológicos durante H
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infecção e desenvolvimento de câncer gástrico. Descobrimos que as células B de H
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pacientes infectados apresentaram composição e função alterada em comparação com pacientes não infectados. IL-10 expressando CD24 + CD38 + B células foram upregulated em H
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pacientes infectados, continha actividade de regulação significativa na inibição de células T secreção de citocinas pró-inflamatórias, e respondeu diretamente ao H
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antígeno estimulação. Curiosamente, em H
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indivíduos fumadores infectados e pacientes obesos, o número de IL-10 + B células e CD24 + CD38 + B células foram reduzidas em comparação com H
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infectados indivíduos assintomáticos. As funções reguladoras mediadas por CD24 + CD38 + B células também foram prejudicadas. Além disso, os pacientes positivos câncer gástrico tinha reduzido IL-10 produtoras de frequências das células B após o H
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-stimulation. Em conjunto, esses dados sugerem que em H
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-infecção, CD24 + CD38 + células B é regulada positivamente e desempenha um papel na supressão de respostas pró-inflamatórias, possivelmente através de produção de IL-10, uma característica que não foi observada em fumadores e pacientes obesos
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Assuntos infectado e está correlacionada com elevado risco de câncer gástrico. PLoS ONE 10 (7): e0134591. doi: 10.1371 /journal.pone.0134591
. pylori)
é uma espécie de bactérias patogênicas Gram-negativos encontrados em mais da metade da população do mundo e preferencialmente inibe o trato gastrointestinal superior, incluindo o epitélio do estômago e o tracto duodeno [1,2]. Embora a grande maioria (> 80%) de infecções são assintomáticos, 10-20% dos indivíduos infectados irá desenvolver úlceras pépticas enquanto 1-2% adquirirá cancro gástrico [3]. O mecanismo preciso de desenvolvimento de câncer como resultado da H
.
pylori não está bem definida, mas não tratada inflamação crónica no tracto gastrointestinal superior é pensado para contribuir para a continuação danos do epitélio do estômago [4,5]. Especificamente, moléculas, tais como o factor de necrose tumoral alfa (TNF-a) sinalização associada à inflamação, têm sido encontrados para promover a tumorigénese gástrica e é regulada positivamente em H
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infecção [6]. Outras citocinas pró-inflamatórias segregadas pelas células T, incluindo IL-2, IL-17 e interferon gama (IFN-g), também são regulados positivamente em H
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infecção e estão associados ao aumento do risco de desenvolvimento de neoplasias gástricas [7-10]. Uma série de outros fatores, tais como a exposição contínua ao fumo do tabaco e obesidade, são positivamente correlacionados com o aumento do risco de câncer gástrico, embora o mecanismo subjacente não é clara [3,11].
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e indução subsequente de câncer gástrico, no entanto, não foi previamente estudado.
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indivíduos infectados. O aumento das percentagens de CD24 + CD38 + B células e reduzidas percentagens de células B virgens e células B de memória em repouso foram encontrados em H
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assuntos i-infectados. O CD24 + CD38 + células B em H
. indivíduos infectados com H. pylori tinham
aumento percentual da produção de IL-10, e suprimiu a expressão de citoquinas pró-inflamatórias quando co-cultivadas com células T autologous. H
. pylori-s
timulated CD24 + CD38 + B células de H
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indivíduos infectados potente secretadas IL-10. Curiosamente, H
. fumar infectadas pelo pylori
temas e subects obesos tinham reduzido os níveis de CD24 + CD38 + B células. Além disso, o CD24 + CD38 + células B reguladoras em fumadores e sujeitos obesos foram encontrados para exibir a perda da função supressora quando co-cultivadas com células T autologous e estimuladas reduziu os níveis de IL-10 após directo
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estimulação. Além disso, em fumadores e doentes obesos que mais tarde desenvolveram cancro gástrico, as frequências de células B de IL-10-secretores foram ainda mais reduzidos, em comparação com os indivíduos que não desenvolveram cancro gástrico. Em conjunto, estes dados demonstram que CD24 + CD38 + B células foram upregulated em H
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infectado e tinha funcionalmente suprimida células T de produção de citoquinas inflamatórias. O CD24 + CD38 + células B em indivíduos fumantes e obesos, no entanto, eram refratárias ao H
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-stimulation, produziram menos IL-10, e faltava capacidade supressiva.
Materiais e Métodos
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pacientes sem úlceras infectados, dos quais 15 são consumidores primários de fumo do tabaco e 15 são de classe I obesos (30kg /m 2 < IMC < 35 kg /m 2 indivíduos), bem como 15 saudável H
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indivíduos livre-ulcerosos -uninfected. Indivíduos com exposição crónica ao fumo de segunda mão foram excluídos do estudo. Não houve diferenças significativas em relação à idade, sexo e história de infecção prévia entre os grupos de estudo foram encontrados. Todos os indivíduos foram acompanhados por 5 anos para o estado de desenvolvimento do câncer. Todos os indivíduos eram indivíduos não aparentados da província de Henan e sua região envolvente. Os pacientes foram recrutados entre janeiro 2008 e dezembro 2013 do Hospital Central 155 de PLA na China. Controles eram indivíduos sem câncer selecionados aleatoriamente a partir de um programa de despistagem do cancro da comunidade para detecção precoce do câncer realizado nas mesmas regiões durante o mesmo período, os pacientes foram recrutados. A taxa de resposta para ambos os controlos e de casos foi de 95%. Os critérios de selecção para os controlos saudáveis incluiu indivíduos sem câncer e correspondência de frequência para casos por sexo e idade (± 5 anos). No recrutamento, consentimento informado foi obtido de cada dado assunto e pessoais, como sexo, idade, peso, altura e fumo de tabaco foram coletadas através de um questionário. Não amostras de todos os sujeitos foram usados em todos os experimentos, devido à adesão do paciente incompleta e células insuficientes em alguns pacientes. Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Hospital Central 155 de PLA.
preparação da amostra
células de isolamento de células
A citometria de fluxo
morta pelo calor. pylori
(Sigma, Munique, Alemanha) foram utilizadas para estimular as células. GolgiStop GolgiPlug e foram adicionados 6 h antes da colheita da célula para a coloração intracelular de IL-2, IL-17, IFN-g, TNF-a e IL-10. FlowJo foi usada para análise de citometria de fluxo.
Luminex ensaio
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foram adicionados às células B, que foram plaqueadas a parte inferior de um de 96 poços Transwell placa (Corning, Tewksbury, MA). Para a estimulação de células T, a parte inferior da placa transwell foi pré-incubada com CD3 (OKT3 clone) anti-humano durante a noite e lavou-se, após o que as células T purificadas foram transferidos para a placa. esferas de anticorpo de captura de citocina humana foram adicionadas à câmara superior do Transwell de 96 poços da placa. Doze horas depois, as pérolas foram colhidas, lavadas e interpretadas de acordo com o protocolo do fabricante.
A análise estatística
resultados
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indivíduos infectados tinha alterado a circular composição celular B
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infecção e como ela pode ser afetada pelo tabagismo e obesidade, 15 saudável H
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-uninfected ( H
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-uninfected) voluntários, 20 H
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infectados indivíduos assintomáticos não-fumadores não-obesos (assintomáticos), 15 H
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infectados fumar não-obesos (fumadores) indivíduos, e 15 H
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infectado fumar em indivíduos obesos (obesidade) foram recrutados para este estudo. Os dados demográficos e clínicos foram resumidos na tabela 1.
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indivíduos infectados. As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram coradas para expressão do marcador de superfície directamente ex vivo
(Fig 1A). Descobrimos que em comparação com H
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-uninfected indivíduos saudáveis, todos os H
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grupos infectados continham porcentagens mais baixas de IgD + CD27 - células B virgens (P < 0,001 para todos, Fig 1B e 1C). As percentagens de CD21 + CD27 células B de memória descansando + foram reduzidas em H
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indivíduos infectados por fumantes e obesos em comparação com indivíduos saudáveis (P < 0,001 para ambos), e a percentagem de CD21 + CD27 + B células em indivíduos obesos foi reduzida em comparação com H
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infectados assintomáticos (P < 0,01). Curiosamente, as percentagens de CD24 + CD38 + B células foram variou entre os diferentes grupos de H
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indivíduos infectados. H
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infectados assintomáticos contido porcentagens muito mais elevadas de CD24 + CD38 + B células do que controles saudáveis (P < 0,001). A percentagem de CD24 + CD38 + B células foi reduzido em indivíduos fumadores comparada com a de sujeitos assintomáticos (P < 0,05), mas ainda maior do que em indivíduos saudáveis (p < 0,001). Em indivíduos obesos, a percentagem de CD24 + CD38 + células B não foi significativamente diferente do que em indivíduos saudáveis, mas foi reduzido de que, em indivíduos assintomáticos (P < 0,001)
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indivíduos infectados tinham alterado B citoquina célula perfil de expressão
expressão de IL-2, IFN-g e TNF-a por células B foram aumentados em H
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infectado indivíduos fumadores e pacientes obesos do que em indivíduos saudáveis (Fig 2A). Nenhuma diferença significativa foi encontrada em TGF-b expressão.
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grupos infectados (Fig 1C). Foi examinada a expressão das citocinas intracelular por CD24 + CD38 + células B. Como mostrado na Fig 2B, a expressão de citoquinas de CD24 + CD38 + B células eram diferentes dos não-CD24 + CD38 + B (células B total menos CD24 + CD38 células + B) em que elas não produzem níveis elevados de IFN-g e TNF-a, quando estimuladas com PMA /ionomicina, mas expressa níveis muito elevados de IL-10, tanto em condições não estimuladas e estimuladas. Comparou-se a produção de IL-10 a partir de diversos subconjuntos de células B e verificaram que CD24 + CD38 + B as células em todos os grupos de estudo secretada muito mais elevada de IL-10 do que os não-CD24 + CD38 + células B, tanto em condições não estimuladas, assim como as condições de ionomicina /PMA estimuladas (Fig 2C). Nós, portanto, considerar o CD24 + CD38 + fração como a IL-10 de produção de subconjunto de células B principal. Dentro do H
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grupo infectado, indivíduos assintomáticos apresentaram maior percentual de IL-10 que expressam células CD24 + CD38 + B células do que indivíduos saudáveis, enquanto H
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infectados pacientes obesos apresentaram menores células IL-10 que expressam em CD24 + CD38 + B células do que os pacientes assintomáticos (Fig 2C). Nós então multiplicado a frequência de IL-10 + células na CD24 + CD38 + B células com a percentagem de CD24 + CD38 + células do total de células B para obter o "número" de células IL-10 expressa nas células B, e descobriu que ambos H
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infectados indivíduos assintomáticos e indivíduos fumadores tinham níveis mais altos de IL-10 + B células do que indivíduos saudáveis (P < 0,001 e P < 0,01, respectivamente). Dentro do H
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infectados grupo, tabagismo e obesidade baixou significativamente as frequências de IL-10 + células B (P < 0,001 para ambos). de indivíduos assintomáticos
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infectados indivíduos assintomáticos. Tabagismo e obesidade reduzida IL-10 expressão em CD24 + CD38 + B células.
H
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infectados assintomáticos tiveram mais atividade tolerogênico mediado por CD24 + CD38 + B células do que fumar e em obesos
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-infecção. CD4 + T células co-cultivadas com autóloga CD24 + CD38 + - células B empobrecido tinham significativamente elevados de produção de IL-2, IL-17, IFN-g e TNF-a, de CD4 + células T co-cultivadas com as células B inteiros, em H
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pacientes infectados assintomáticos (Fig 3A). Em indivíduos fumadores e indivíduos obesos, não foi observado o efeito. Da mesma forma, CD8 + células T de H
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indivíduos assintomáticos infectados por co-cultivadas com autóloga CD24 + CD38 + - células B empobrecido significativamente aumentada de IFN-g e TNF-a secreção do que os co-cultivadas com células B inteiras ( Fig 3B). Mais uma vez, tal efeito não foi observado em indivíduos fumadores e indivíduos obesos. A supressão da expressão de citocinas de células T parece ser mediada por CD24 + CD38 + células B, uma vez que menor produção de citocinas foi observada em células CD4 + e CD8 + T células co-cultivadas com CD24 + CD38 + B células sozinho. Em conjunto, esses dados demonstraram que o CD24 + CD38 células + B em H
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indivíduos infectados suprimida CD4 + e CD8 + células T produção de citocinas pró-inflamatória no H
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infectados indivíduos assintomáticos. Tabagismo e obesidade inibida ações regulatórias de CD24 + CD38 + B células.
IL-10 secreção por células CD24 + CD38 + B em cima do H
. estimulação pylori
em diferentes assuntos
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indivíduos infectados. produção de IL-10 é fundamental para a função das células B regulamentar [12,13]. a sinalização do receptor de tipo Toll é um importante mecanismo de regulação positiva de IL-10 em células B, e foi demonstrado que modula a expressão de citocinas em H