PLoS ONE: Zic1 Rėmėjas Hypermethylation plazmoje DNR yra potencialus biologinis skrandžio vėžio ir intraepitelinei neoplazijai

Anotacija

Skrandžio vėžys (GC) išlieka viena iš labiausiai paplitusių virškinimo vėžio visame pasaulyje; Tačiau dauguma pacientų pristatyti gerokai pažengęs pirminės diagnozės. Zic1
yra naujas kandidatas navikas slopintuvas genų, kad yra epigenetically nutildė GC. Šiame tyrime mes ištirti, Zic1
rengėjas metilinimas plazmos DNR kaip naują molekulinės persekiotoją ankstyvo diagnozės nustatymo ir stebėsenos GC. Metilinimas konkrečių polimerazės grandininė reakcija (JEP) Analizės buvo atliktas siekiant nustatyti, Zic1
rengėjas metilinimas plazmos DNR iš 20 sveikų, 50 skrandžio intraepitelinei neoplazijos pacientų, ir 104 GC pacientams. Zic1
rengėjas metilinimas norma plazmos mėginių iš sveikų asmenų kontroline grupe, buvo 0%, bet jis pasiekė 54,0%, o intraepitelinės neoplazijos grupės ir 60,6%, o GC grupei. Kur dvi pastarosios vertės buvo žymiai didesnis, nei buvo nustatyta sveiką kontrolinės grupės (p < 0,05), su 100% specifiškumu intraepitelinės neoplazijos ir GC diagnozę. Teigiamas prognostinė vertė plazmos Zic1
rengėjas metilinimas dėl intraepitelinei navikų ir GC diagnozė buvo 100%. Metilinimas statusas GC grupės nebuvo reikšmingai susijęs su naviko dydžio, naviko diferenciacijos, limfmazgių metastazių, TNM sustojimo, arba naviko invazijos (p > 0,05). Vertinimas aptikimo kancerogenezės-embriono antigeno (CEA) lygio ir reikšmės Zic1
rengėjas metilinimas norma GC diagnozė parodė, kad jautrumo Zic1
rengėjas metilinimas buvo žymiai didesnis nei CEA lygis kaip persekiotoją ir kad kartu matavimo šių dviejų indeksų (lygiagretus tyrimas) Padidinus jautrumą. Kartu paėmus, mūsų rezultatai rodo, kad Zic1
rengėjas metilinimas norma plazmos išskirtu DNR yra labai svarbi ankstyvos patikros GC ir stebėsenos Tumorigenesis. Zic1
rengėjas metilinimas gali būti kaip naują neinvazinę plazmos biologinis žymuo ankstyvo aptikimo GC ir rizikos vertinimui didelės rizikos gyventojų. Bendras matavimas Zic1
rengėjas metilinimas norma ir CEA lygis (Lygiagretus tyrimas) gali sustiprinti dabartines gaires anksti diagnozuoti GC

nurodomoji dalis:. Chen X Lin Z Xue M Si J Chen S "(2015), Zic1
Rėmėjas Hypermethylation plazmoje DNR yra potencialus biologinis skrandžio vėžio ir intraepitelinei neoplazijai. PLoS ONE 10 (7): e0133906. Doi: 10,1371 /journal.pone.0133906

redaktorius: Hiromu Suzuki, Saporas medicinos universitetas, Japonija

Įstojo: Balandžio 10, 2015; Priimtas liepos 2, 2015 m Paskelbta 24 Liepos 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 Chen et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

finansavimas:. Šis darbas buvo finansuojamas iš nacionalinio Gamtos mokslo fondo Kinijos (81302070, 81.372.623) (http://www.nsfc.gov.cn), Zhejiang provincijos medicinos ir sveikatos bendrosios tyrimų planas (2014KYB121) (http://www.zjwst.gov.cn/) Zhejiang provincijos departamento švietimo tyrimų planą (Y201327398) (http://www.zjedu.gov.cn) ir Zhejiang province raktas mokslo ir technologijų naujovės komanda (2013TD13) (http://www.zjkjt.gov.cn/). Finansuotojas Shujie Chen sumanyta ir sukurta eksperimentus šiam rankraščio

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra vienas iš labiausiai paplitusių virškinimo vėžio ir trečioji pagrindinė priežastis, vėžio susijusių mirčių visame pasaulyje [1]. GC pacientų, esančių pažengęs pirminio diagnozę dauguma. Visame pasaulyje, GC sudaro beveik 952.000 naujų atvejų per metus pagal Globocan 2012 [2]. Japonijoje, 5 metų išgyvenamumas pradžioje GC (EGC) yra 86%, palyginti su 32% pažangių GC, kaip pranešė JAV SEER programos [3].

Aberrant DNR metilinimas yra svarbus epigenetinius kaita ir anksti renginys kancerogenezėje [4]. Neseniai kelios naviko slopintuvas genų (GTG), įskaitant FAM5C
MYLK
P16 parsisiųsti ir El cad
, buvo pranešta, kad denatūruotas serume plazma /GC pacientų [5-7]. Be to, hypermethylation iš GTG linkęs būti sustiprintas su iš anksto ikivėžiniai [8-9] progresavimo. Todėl iš metilo DNR serumo /plazmos aptikimo gali būti vienas žadantis metodas už iš anksto diagnozuoti GC. Intraepitelinės neoplazijos (IN) yra potencialiai priešvėžinė pažeidimas, suteikiantis aukštą riziką GC; Taigi, pacientams, atranka yra būtina diagnozuoti ir prognozuoti GC. Nedaug ataskaitos hypermethylated DNR analizės kraujo mėginių iš skrandžio intraepitelinei neoplazija (GIN) pacientams yra prieinami dienos.

Augantis duomenys rodo, kad Zic1
( Zic
šeimos narys 1 , keista-suporuotas Drosophila homologas) dalyvauja keli vėžio [10-13] progresavimą. Mes jau anksčiau pastebėjo, kad Zic1
, romanas GTG, yra nutildyti per promotoriaus hypermethylation tiek GC ląstelių ir audinių [14]. Mes taip pat parodė, kad Zic1
dalyvauja slopinimu GC ląstelių išlikimo ir sutrikusi ląstelių migraciją [15].

Šiame tyrime nustatėme anksti diagnostikos ir prognozavimo potencialą Zic1
hypermethylation į GC pacientų plazmoje. Mes matuojamas rengėjas metilinimo statusą, Zic1
plazmoje nuo pacientams, sergantiems GC ar Džinai ir normalu kontrolė (NC) dalykų. Iš asociacija Zic1
rengėjas metilinimas su klinikos parametrus taip pat buvo įvertintas. Be to, mes priskiriami aukštos kokybės ir T1 GC EGC ir pateikti GC ir Gin pacientus į GC plius grupėje (GPI). Tada mes analizuojami Zic1
hypermethylation normos tiek EGC ir GPI grupes. Be to, kartu vertinimas kancerogenezės-embriono antigeno (CEA) lygis ir Zic1
rengėjas metilinimas GC diagnozė buvo įvertintas naudojant plazmą iš GC ir Gin pacientams.

Medžiagos ir metodai

klinikinius mėginius

Plazmos mėginiai buvo paimti prieš operaciją metu seras Run Run Shaw ligoninė, Hangzhou, Zhejiang, Kinija, nuo 2012 lapkričio iki 2015 balandžio Visi pacientai įtraukti į mūsų tyrime buvo atlikta gastroendoscopy ir buvo sugrupuoti pagal histopatologinį diagnozę. Plazmos mėginiai buvo imami iš GC ir džinas, pacientams, kurie anksčiau negydyti gydomųjų procedūrų, pavyzdžiui, chemoterapija, radioterapija, ir chirurginės rezekcijos. Atmetimo kriterijai įtraukti virškinimo trakto ligų kartu su kitais priežasčių ir ligų kitus organus. Pacientai, sergantys skrandžio metastazių iš kitų navikų taip pat buvo atmesti.

sunumeruoti mėginius pagal ta tvarka, kuria jie buvo surinkti, o tada atlikto metilinimo konkrečių polimerazės grandininę reakciją (MSP) įvertinti mėginiai eilės. Mėginiai buvo toliau sugrupuoti pagal patologijos rezultatus. Plazmos mėginiai buvo imami iš 104 GC pacientams, kurių amžiaus vidurkis 59,8 metų, kurie buvo diagnozuota atsižvelgiant į Pasaulio sveikatos organizacijos kriterijais [16]. Penkiasdešimt Gin pacientams, kurių vidutinis amžius 58,0 metų buvo diagnozuota gastroskopijos. Kraujo mėginiai taip pat buvo renkami iš 20 sveikų savanorių NC grupėje amžiaus vidurkis 38,5 metų.

Etika pareiškimas

Mūsų projektas gavo patvirtinimą iš klinikinės tyrimų etikos komiteto Gastroenterologijos instituto Zhejiang universiteto. Parašė informuotas sutikimas buvo gautas iš kiekvieno paciento prieš mėginio paėmimo. Asmenys, kurie dalyvavo šiame tyrime davė raštišką sutikimą (kaip nurodyta PLoS pervežimas sutikimo forma) skelbti šiuos bylos detales.

DNR išskyrimas ir bisulfito modifikacija

DNR buvo išgauta iš plazmos mėginių naudojant QIAamp DNR kraujo Mini Kit (Qiagen, Hilden, Vokietija). DNR koncentracija buvo išmatuotas esant 260 nm bangos ilgiui pagal spektroskopijos. DNR buvo bisulfito-gydomi Zymo DNR modifikacija Kit (Zymo tyrimų, Orange, CA, JAV). Pakeista DNR buvo laikomi -20 ° C iki naudojimo.

MSP tyrimai

Zic1
rengėjas metilinimas buvo tiriama atliekant MSP tyrimą, naudojant pirmiau minėtų bisulfito modifikuoti nemokamai plazmos DNR kaip šabloną. MSP buvo atlikta 40 ciklų renatūracijos temperatūra 56 ° C, kaip buvo aprašyta anksčiau [14]. Metilinimo-specifinius pradmenis buvo ZIC1-MF (5'-GGATTTTTTGTTTCGTAATC) ir ZIC1-MR (5'-CCCGTTAACCACGTTAAACG), ir kad nemetilintas-specifinius pradmenis buvo ZIC1-UF (5'-GGGATTTTTTGTTTTGTAATT) ir ZIC1-UR (5'- CCCATTAACCACATTAAACA). PGR protokolas įtraukti pradinį denatūraciją ne mažesnis nei 95 ° C temperatūroje 10 min, po to 40 ciklų denatūruojant 95 ° C temperatūroje 30 S, atkaitinimo 56 ° C temperatūroje 40 S, gruntas, pratęsiant 72 ° C temperatūroje 40 S, ir paskutinį kartą pratęsti 72 ° C temperatūroje 7 min. PGR produktai buvo elektroforezė apie 1,5% agarozės gelyje, tamsintas su Gel raudona, ir regimos ultravioletinėje apšvietimas.

Serumas CEA bandymai

serumo mėginiai buvo išsiųsti į klinikinė laboratorija seras Run Run Šo ligoninės tikrinti, ir CEA koncentracija > 5 ng /ml buvo laikomas nenormalus.

statistines analizes

metilinimo dažnis ir CEA koncentracija plazmoje mėginių buvo lyginami naudojant Fisher'io testą. Tarp klinikos ypatybes ir DNR hypermethylation asociacija buvo analizuojami naudojant chi kvadrato testas. Diagnostinė vertė į Zic1
rengėjas metilinimas ir plazmos CEA lygis buvo įvertintas pagal plotą po ROC kreivė kreive (AUC) derinys. Jautrumas, specifiškumas, ir teigiami ir neigiami prognozinės vertės patologinės diagnozės buvo apskaičiuotos su 95% pasikliovimo intervalais Zic1
rengėjas metilinimo arba Zic1
promotoriaus metilinimo kartu su CEA lygiu. Teigiami ir neigiami tikimybė santykis taip pat buvo apskaičiuotas. Dėl visų šių bandymų, vertės p <atjungimo; 0,05 buvo taikomi siekiant nustatyti, statistinį reikšmingumą. Visi statistinės analizės buvo atlikta naudojant SPSS 19.0 programinę įrangą (SPSS Inc., Čikaga, IL).

Rezultatai

Metilinimas statusas plazmos

Norėdami įvertinti pakitimus, Zic1
rengėjas metilinimas GC, mes pirmą kartą aptikta metilinimo statusą šioje promotoriaus 104 pacientams, sergantiems GC, 50 su Gin, 31 su EGC ir 20 NCS ir atlikti palyginimus tarp grupių. Metilinimo normos Zic1
promotorius plazmos mėginiuose buvo 0%, o NC grupės (0%), padidėjo iki 54,0% per Gin grupės ir 60,6% į GC (p < 0,001 tiek Džinai ir GC vs NC), su 100% specifiškumą GPI diagnostika (20/20) (1 pav). Teigiami ir neigiami prognozuojantys vertybės ir teigiamos, ir neigiamos tikimybės santykis diagnozuoti ir GC buvo 100% (90/90), 23,8% (20/84), begalinis ir 0,42, atitinkamai. Atstovas JEP Analizės rezultatai Zic1
rengėjas metilinimas yra parodyta 2 pav

asociacija klinikos funkcijų su Zic1
rengėjas metilinimas į GC pacientų
tada koreliuoja su klinikos ypatybes su Zic1
rengėjas metilinimas norma GC pacientų plazmoje nustatyti jokių asociacijų. Tyrimo rezultatai atskleidė Nepažymėta asociacijas tarp Zic1
rengėjas metilinimas norma ir klinikiniai parametrai, įskaitant naviko dydžio, diferenciacijos laipsnio, limfmazgių būklę, naviko invazijos gylio ir TNM etape (p > 0,05) (1 lentelė) .

Kombinuotas nustatymas Zic1
hypermethylation ir CEA lygis

Kombinuotosios nustatymo reikšmė Zic1
hypermethylation norma ir CEA lygis už buvo analizuojami diagnostika ir anksti prognozė GC. Mes matuojamas CEA lygio 9 NCS, 24 Gin pacientų ir 71 GC pacientams prieš gydymą. Šio CEA lygio GC, IN ir EGC grupių jautrumas buvo 22,5% (16/71), 16,7% (4/24), o 10,5% (2/19), atitinkamai. Iš viso 3 grupių, jautrumo, Zic1
rengėjas metilinimas buvo gerokai didesnis nei CEA lygio (p < 0,05).

Kombinuotas nustatymas Zic1
hypermethylation ir CEA lygis GC grupei.

GC grupės, jautrumo ir specifiškumo Kombinuotosios nustatymo Zic1
rengėjas metilinimas normos ir CEA lygio (tandem bandymų) buvo 16,9 % ir 90,9%, atitinkamai (2 lentelė). Kombinuotosios analize šių dviejų parametrų (Lygiagretus tyrimas) jautrumas buvo 69,0% (2 lentelė), kuris buvo didesnis nei jautrumo pasiektų vien arba parametro bandymai. ROC kreivė analizė buvo atlikta siekiant įvertinti DNR metilinimo lygio ir CEA lygio GC diagnozės svarbą. AUC už Zic1
rengėjas metilinimas bandymai vien buvo 0,610 (S1 pav), ir kad dėl Kombinuotosios vertinimo Zic1
rengėjas metilinimo ir CEA lygio (tandem bandymų) buvo 0,539 (S2 pav) , Pažymėtina, kad kai Zic1
rengėjas metilinimas ir CEA lygis buvo tiriami kartu, AUC padidėjo iki 0,633 (3 pav). Remiantis pirmiau išdėstytais rezultatais, kartu nustatymas buvo rastas Zic1
rengėjas metilinimas norma ir CEA lygis (Lygiagretus tyrimas) GC diagnozė būtų sinergetinis palyginti su vien kiekvieno metodo naudojimo.

Kombinuotas nustatymas Zic1
hypermethylation ir CEA lygis GPI grupei.

GPI grupės, jautrumo ir specifiškumo Kombinuotosios nustatymo Zic1
promotoriaus metilinimo norma ir CEA lygis (tandeminis bandymas) buvo 15,8% ir 100,0%, atitinkamai (3 lentelė). Bendras įvertinimas šių dviejų parametrų (Lygiagretus tyrimas) turėjo didžiausią jautrumą 65,3%, su teigiama prognostinė vertė siekė 98,4% (3 lentelė). ROC kreivė analizė buvo atlikta siekiant įvertinti DNR metilinimo lygio ir CEA lygio GPI diagnozės svarbą. AUC už Zic1
rengėjas metilinimas bandymai vien buvo 0,792 (S3 pav), ir kad dėl Kombinuotosios vertinimo Zic1
rengėjas metilinimas norma ir CEA lygis (Lygiagretus tyrimas) buvo 0,771 (pav 4). Todėl aptikimo Zic1
rengėjas metilinimas gali būti efektyvesnė alternatyva GPI diagnozę.

Diskusijos

Neseniai buvo rasta daug genai turi būti denatūruotas GC audinių , įskaitant El cad
RASSF1A
P16
GSTP1
SOCS1
SFRP1
ir PTEN
[17]. Pranešama apie metilinimo dažnis svyravo nuo 56% iki 96% [17]. DNR metilinimas buvo stebimas kraujo mėginių GC pacientams. buvo rasta keletas GTG būti denatūruotas kraujo mėginių GC pacientų, įskaitant P16
El cad
, ir RRR
, su aptikimo normos 37% iki 48%, atitinkamai [18-21].

Zic1
yra nenormaliai downregulated tam tikrų rūšių vėžio, rodančių jo funkcija, kaip GTG. Mūsų Darbo parodė, kad Zic1
rengėjas dažnai denatūruotas pirminės skrandžio karcinoma audinių, su dideliu aptikimo norma 94,6%, bet ne įprastų skrandžio audinių [14]. Mūsų rezultatai parodė, kad Zic1
yra naujas kandidatas GTG, kad yra downregulated per promotoriaus hypermethylation GC. Tačiau į mūsų žiniomis, nėra atlikti tyrimai plazmos Zic1
rengėjas metilinimas GC ar džinas.

Šiame tyrime mes pirmą kartą įrodė, kad netipinė metilinimo Zic1
rengėjas gali būti aptikta kraujo plazmoje nuo GC ir Gin pacientams, esant dažniams, 60,6% ir 54,0%, atitinkamai, kurie buvo gerokai didesnis nei iš NCS. Šie rezultatai sutampa su ankstesnių tyrimų [14]. Nuo diagnostikos požiūriu Zic1
rengėjas metilinimas eksponuojami didelio specifiškumo diskriminuoti NCS iš GC ir Gin pacientų (100%). Mūsų rezultatai taip pat parodė, kad aptikimo Zic1
rengėjas metilinimas norma turėjo aukštą teigiamą prognostinė vertė ir teigiamą tikimybę santykis ir AUC GC ir džinas, diagnozę, tai rodo, kad Zic1
rengėjas metilinimas vertinimas turi potencialas Utility diagnozės ir anksti prognozuoti GC.

Daugelis ankstesnių tyrimų buvo siekiama periferinio kraujo DNR metilinimo GC, o ne GIN sergantiems pacientams, tik su studijų, daugiausia dėmesio skiriant DNR metilinimo Gin sauja. Endoskopijos metodų plėtra leido už efektyvesnių ir mažiau invazinius gydymo EGC ir Gin pacientams prieinamumą. Apskritai, tikrinant Gin prisideda prie GC stebėsenos ir GC susijusių mirčių sumažinimo. Vienas įdomus aspektas šiame tyrime yra tai, kad mes parodė netipinė, Zic1
rengėjas metilinimas plazmoje nuo Gin pacientų, su aptikimo norma, kuri buvo gerokai didesnis nei NC dalykų (p < 0,001). Ateityje aptikimas hypermethylation iš Zic1
rengėjas potencialiai gali būti naudojamas kaip išankstinio perspėjimo ženklą ar į ekraną GC didelės rizikos grupėms.

Taip pat įvertintas Zic1
rengėjas metilinimas plazmoje iš GC pacientams kartu su įvairių klinikos parametrus. Nėra statistiškai buvo pastebėta reikšmingų ryšių tarp Zic1
rengėjas metilinimas ir įvairūs klinikiniai parametrai, įskaitant naviko dydžio, diferenciacijos laipsnio, limfmazgių būklę, naviko invazijos gylio ir TNM etape; Tačiau, mūsų ankstesniame tyrime [15], , buvo nustatyta Zic1
metilinimas dalyvauti GC invazijos. Šiame tyrime, dauguma GC pacientų buvo diagnozuota ir gydoma ankstyvame etape, kuris gali turėti įtakos galutiniams rezultatams. Patvirtinimo didesniame gyventojų gali suteikti įžvalgų šių skirtingų rezultatų. Ar kuri nors koreliacija tarp nenormalaus Zic1
rengėjas metilinimas ir GC klinikinių charakteristikų, reikia patikslinti tolesnei analizei.

CEA yra klasikinis auglio žymeklis, kuris dažniausiai vertinamas atsižvelgiant į kliniką. Šis žymeklis yra laikoma labiausiai dažnai dalyvauja pabaigoje GC pacientams; Tačiau daugelis tyrimų parodė, kad DNR metilinimas gali būti nustatyta pradedant ankstyvuoju GC. Mūsų dabartinės Tyrime teigiama, kad ROC kreivė buvo sukurtas siekiant įvertinti Kombinuotosios nustatymo reikšmę Zic1
rengėjas metilinimas norma ir CEA lygis (Lygiagretus tyrimas) dėl GC diagnozę, atskleidžiantys, kad jų bendra aptikimo pagamino daugiau reikšmingų rezultatų, nei vien tik arba parametro aptikimo. Todėl mes rekomenduojame, kad bendras matavimas Zic1
rengėjas metilinimas norma ir CEA lygis gali padidinti GC diagnozę.

Taigi, mūsų rezultatai parodė, kad matavimo Zic1
rengėjas metilinimas plazmos išskirtu DNR yra reikšmę ankstyvam GC ir rizikos vertinimo didelės rizikos gyventojų. Bendras matavimas Zic1
rengėjas metilinimas norma ir CEA lygis (Lygiagretus tyrimas) gali sustiprinti dabartines gaires anksti diagnozuoti GC; Tačiau reikia tolesnių tyrimų su didesniais imties dydžių ir klinikinės patvirtinimo.

Pagalbinė informacija
S1 pav. Aptikta, Zic1
rengėjas metilinimas skrandžio vėžiu (GC) plazmos mėginiais.
An ROC kreivę įvertinti Zic1
rengėjas metilinimo tyrimas dėl GC diagnozės svarbą.
Doi : 10,1371 /journal.pone.0133906.s001
(TIF)
S2 pav. Kombinuoti aptikimas, Zic1
rengėjas metilinimas ir CEA lygis (tandemas bandymas) skrandžio vėžys (GC) plazmos mėginiais.
An ROC kreivę įvertinti Kombinuotosios aptikti dviejų rodiklių reikšmės (tandemas bandymai .) GC diagnozę
Doi: 10,1371 /journal.pone.0133906.s002
(TIF)
S3 pav. Aptikta, Zic1
rengėjas metilinimas skrandžio intraepitelinei neoplazija (GPI) plazmos mėginiais.
An ROC kreivę vertinant reikšmingumą Zic1
rengėjas metilinimas bandymai GPI diagnozę.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0133906.s003
(TIF)

• PLoS ONE reglamentavimą B ląstelių funkcija yra užslopinta rūkymas ir nutukimas H. pylori infekuotų dalykų ir yra susijęs su padidinta rizika Skrandžio Cancer
• PLoS ONE: Exosomal miRNAs iš pilvaplėvės plovimas Skysčių kaip potencialūs prognostiniai biologinių žymenų peritoninės metastazių skrandžio Cancer