PLOS ONE: MUC4 e MUC1 Expressão em Adenocarcinoma do estômago se correlaciona com Vessel Invasion e Linfonodo Metástase: Um Estudo imuno-histoquímica de câncer gástrico precoce

Abstract

Temos relatado anteriormente que a expressão MUC4 é um factor de mau prognóstico em vários carcinomas. Nosso estudo anterior também mostraram que a expressão MUC1 em cancros gástricos, incluindo os estágios iniciais e avançados é um factor de mau prognóstico. No presente estudo, os perfis de MUC4 e MUC1 de expressão foram analisados ​​por imuno-histoquimica (IHC), utilizando dois anticorpos monoclonais anti-MUC4 (MAbs), 8G7 e 1G8, e anti-MUC1 MAb DF3 em 104 espécimes gastrectomia de adenocarcinoma gástrico precoce com submucosa invasão (pT1b2), incluindo 197 lesões subtipos histológicos. Antes do estudo IHC das amostras humanas, avaliou-se a especificidade dos dois MAbs por Western blotting e IHC de dois ARNm que expressam MUC4 linhas celulares de cancro gástrico. MAb 8G7 reagiu claramente, enquanto que o MAb 1G8 não apresentaram qualquer reactividade, quer em Western blotting ou IHC. No IHC dos cancros gástricos, as taxas de expressão de MUC4 /8G7 detectados pelo MAb 8G7, MUC4 /1G8 detectados pelo MAb 1G8 e MUC1 /DF3 detectados pelo MAb DF3 em tipos bem diferenciados (70%, 38/54; 67%, 36/54; 52%, 28/54) foram significativamente maiores do que os tipos em pouco diferenciados (18%, 10/55; 36%, 20/55; 13%, 7/55) ( P
< 0,0001; P
= 0,0021; P Art < 0,0001), respectivamente. A expressão MUC4 /8G7 estava relacionada com a invasão linfática (r = 0,304, P
= 0,033). Por outro lado, a expressão MUC4 /1G8 estava relacionada com invasão linfático (r = 0,395, P
= 0,001) e metástase linfática (r = 0,296, P
= 0,045). A expressão MUC1 /DF3 estava relacionada com a invasão linfática (r = 0,357, P
= 0,032) e invasão venosa (r = 0,377, P
= 0,024). Em conclusão, a expressão de MUC4, bem como MUC1 em cancros gástricos precoces é um marcador útil para prever fatores de mau prognóstico relacionadas com a invasão de vasos

Citation:. Tamura Y, Higashi M, Kitamoto S, Yokoyama S, Osako H, Horinouchi M, et al. (2012) MUC4 e MUC1 Expressão em Adenocarcinoma do estômago se correlaciona com Vessel Invasion e Linfonodo Metástase: Um Estudo imuno-histoquímica de câncer gástrico precoce. PLoS ONE 7 (11): e49251. doi: 10.1371 /journal.pone.0049251

editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne Escola de Medicina da Universidade de Estado, Estados Unidos da América

Recebido: 17 Agosto, 2012; Aceito: 05 de outubro de 2012; Publicação: 13 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Tamura et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte por Princes Cancer Research Fund Takamatsu para S. Yonezawa; Grants-in-Aid para a Investigação Científica da Pesquisa Científica (B) 23.390.085 de S. Yonezawa; Investigação Científica (C) 21590399 para M. Higashi; Jovens Cientistas (B) 24701008 para S. Yokoyama; Investigação Científica em Áreas Prioritárias 239349 para S. Kitamoto (JSPS Fellowship) do Ministério da Educação, Ciência, Desporto, Cultura e Tecnologia, Japão; a Fundação de Pesquisa de Pâncreas do Japão para S. Yokoyama; eo Memorial Foundation Kodama, no Japão para M. Higashi. S. Batra é apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de bolsas de Saúde (CA78590, CA163120, CA133944 e CA111294). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo

Conflito de interesses:.. Os autores declaram não haver conflito de interesse em relação ao trabalho no estudo

Introdução

O câncer gástrico é o quarto cancro mais comum em todo o mundo e mais de 90% dos cancros gástricos são adenocarcinomas [1]. Recentemente, no Japão, a detecção precoce pelo exame endoscópico rotina nas clínicas gastroenterologia resultou diagnósticos precisos e tratamentos cirúrgicos endoscópicos ou eficazes, resultando numa relativamente melhor prognóstico. Na análise de 11.261 pacientes com câncer gástrico tratado por ressecção gástrica, a taxa de sobrevida em 5 anos TNM para o estágio IA foi de 91,8% e para a fase IB a taxa de sobrevivência foi de 84,6% [2]. Para os cânceres gástrico precoce, uma submucosa dissecção endoscópica (ESD) é o tratamento de primeira escolha no Japão, mas os critérios da cirurgia adicional, incluindo dissecção de linfonodos após a ESD ainda são controversos [3].

Nossa série de imuno-histoquímica (IHC) estudos para mucina expressão em várias neoplasias humanas demonstraram que a expressão da proteína MUC1 mucina (mucina associada a membrana pan-epitelial) está relacionada com a proliferação invasivo dos tumores e mau resultado dos pacientes, ao passo que a expressão de MUC2 a mucina (tipo intestinal mucina secretora) está relacionado com a proliferação não-invasivo de tumores e um resultado favorável para os pacientes [4], [5]. Nosso estudo anterior mostrou que a expressão de MUC1 em cânceres gástrico é um factor de mau prognóstico [6].

MUC4 foi relatada pela primeira vez como mucina traqueobrônquica [7] e é uma mucina associada à membrana [8]. Em nossa série estudo, a expressão de MUC4 no colangiocarcinoma intra-hepático, adenocarcinoma ductal pancreático, carcinoma do ducto biliar extra-hepática, adenocarcinoma de pulmão e carcinoma epidermóide oral foi um fator independente de mau prognóstico e é um marcador útil para prever o resultado dos pacientes [ ,,,0],5], [9], [10], [11], [12], [13]. Infelizmente, existem poucos estudos sobre o perfil de expressão MUC4 no cancro gástrico humano. No presente estudo, examinamos os perfis de MUC4, bem como MUC1 expressão em tecidos câncer gástrico precoce, e descobriram que a expressão MUC4 e MUC1 nos cancros gástricos precoces se tornaria fatores de mau prognóstico por invasão de vasos linfáticos, invasão dos vasos sanguíneos e dos linfonodos metástase.

Como os anticorpos anti-MUC4 monoclonais (mAbs), 8G7 e 1G8, são conhecidos para detectar diferentes locais da molécula MUC4. O MAb 8G7 reconhece uma sequência de repetição em tandem (STGDTTPLPVTDTSSV) da subunidade MUC4α humana [14]. O MAb 1G8 é levantado contra a sequência de rato (rato ASGP-2), e reconhece um epitopo no rato ASGP-2 sub-unidade, o que corresponde à subunidade MUC4β humana, e apresenta uma reactividade cruzada com amostras humanos [15]. Assim, uma atenção especial foi dada à comparação dos dois MAbs anti-MUC4 por Western blot e IHC de duas linhas celulares de cancro gástrico, antes do estudo IHC de tecidos de câncer gástrico humano. Além disso, uma vez que há controvérsias em relação ao significado prognóstico destes anti-MUC4 MAbs, uma revisão da literatura de expressão MUC4 em vários tipos de câncer, também foi realizada.

Materiais e Métodos

Pacientes e amostras de tecido

espécimes gastrectomia de 104 tipos de câncer gástrico precoce, que mostram a invasão submucosa, pT1b2, com ou sem metástase ganglionar, foram recuperados a partir do arquivo, entre 1994 e 2008 do Kagoshima-shi Hospital Medical Association. A idade média dos pacientes era 65,7 (S.D., 9,8; gama, 39-92 anos; idade mediana, 66 anos); 64 casos eram do sexo masculino e 40 casos eram do sexo feminino. Este estudo foi realizado em conformidade com os princípios orientadores da Declaração de Helsínquia, e aprovado pela Comissão de Ética para Kagoshima-shi Hospital Medical Association (KMAH 2011-02-02). Informado, o consentimento escrito foi obtido de todos os pacientes. Nos casos com mais de dois tipos histológicos misturados uma lesão, cada um padrão histológico foi avaliada de forma independente, de acordo com a Classificação japonesa de carcinoma gástrico (JCGC) [16].

Avaliação de anticorpos monoclonais para MUC4

células e condições de cultura.

linhas celulares de cancro gástrico humano linhas de células do cancro do pâncreas (PANC1 e CAPAN1) foram adquiridos da American Type Culture Collection ((SNU-16 e NCI-N87) e Manassas, VA). Ambas as células gástricas cancerosas foram mantidas em meio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO); células PANC1 foram mantidas em DMEM (Sigma-Aldrich); Capan1 células foram mantidas em DMEM /F-12 (Sigma-Aldrich). Todos os meios foram suplementados com soro fetal bovino a 10% (GIBCO, Breda, The Netherlands) e 100 U /mL de penicilina /100 ug /ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich). Todas as células foram incubadas em 5% de CO2 a 37 ° C e mantida a níveis sub-confluentes.

extracção de ARN e RT-PCR.

O ARN total foi extraído das células utilizando o RNeasy mini- kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) e quantificado por NanoDrop espectrofotómetro ND-1000. O ARNm obtido (2 ug) foi transcrito de modo reverso em ADNc com o ARN de Alta Capacidade ao kit de ADNc (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os seguintes iniciadores foram concebidos para a PCR subsequente: MUC4, 5'-TGGGACGATGCTGACTTCTC-3 ', 5'-CCCCGTTGTTTGTCATCTTTC-3'; ACTB, 5'-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCTG-3 ', 5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'. A PCR foi realizada com os AmpliTaq Gold Master Mix rápida de PCR (Applied Biosystems) seguindo o protocolo do fabricante.

Extracção de proteínas e Western blotting.

lisados ​​celulares totais foram preparados usando tampão RIPA contendo mistura de inibidores de protease (Nacalai Tesque, Kyoto, Japão). A concentração de proteína foi medida pelo ensaio BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL). Uma quantidade igual de lisado de proteína foi resolvido em 2% de gel de agarose contendo SDS e passivamente transferidos para membrana de PVDF durante a noite à temperatura ambiente. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 1% /PBST durante 2 horas e submeteu-se o procedimento padrão de imunodetecção utilizando os anticorpos primários específicos. Os anticorpos primários são como se segue: anti-humano MUC4 MAb 8G7 (1:1000, gerado pelo Dr. K. Surinder Batra, Universidade do Nebraska Medical Center, Omaha, NE) e 1G8 (1:1000, adquirido de Invitrogen, Camarillo, CA), e um anti-humano-tubulina MAb DM1A (1:2,000, Sigma-Aldrich).

imunocitoquímica para as células cultivadas.

para a coloração MUC4 em células em cultura, as células foram semeadas em placas lâminas de 8 câmaras (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) e incubadas durante a noite. As células foram fixadas com formaldeído a 3,7% durante 10 min à temperatura ambiente e coradas com MAb 8G7 (1:24,000) e MAb 1G8 (1:4,000) durante a noite a 4 ° C, respectivamente. detecção de sinal foi realizada por um método de imunoperoxidase utilizando um estojo Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

A imuno-histoquímica em tecidos humanos

IHC para humanos carcinomas gástrico foi realizada utilizando os seguintes anticorpos nas secções máximas de corte em cada tumor. MUC4 foi detectada por dois mAb, 8G7 e 1G8. Para o estudo comparativo, a expressão MUC-1 foi também examinada por MAb DF3 (IgG de ratinho, de TFB, Tóquio, Japão). O IHC foi realizada pelo método da imunoperoxidase como se segue. A recuperação antigênica foi realizada utilizando o antígeno CC1 tampão de recuperação (pH 8,5 EDTA, 10037 ° C, 30 min., Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) para todas as seções. A seguir à incubação com os anticorpos primários (mAb MUC4 /8G7 diluída 1:3000, 37 ° C, 32 min .; MAb MUC4 /1G8 diluída 1:500, 37 ° C, 24 min .; MAb MUC1 /DF3 diluída 1:50, 37 ° C, 32 min.) em solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 (PBS) com 1% de albumina de soro bovino, as secções foram coradas com um corante XT automatizado corrediça Referência usando um kit de detecção de diaminobenzidina (DAB UltraView, Ventana Medical Systems). Para simplificar, MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 e MUC1 /DF3 são usados ​​para indicar os antígenos mucina detectadas por cada anticorpo.

Scoring dos resultados e análise estatística.

Quatro cego investigadores ( YT, MH, MG e SY) avaliou os dados de coloração IHC de forma independente. Quando a avaliação diferiu entre os quatro, a decisão final foi tomada por consenso. Os resultados foram avaliados com base na percentagem de células coradas positivamente carcinoma, e os dados percentuais foram classificados em seis classes usando o seguinte sistema de pontuação: negativo, nenhuma das células de carcinoma coradas; fraco, < 5% de células de carcinoma coradas; 1+, ≥5% para < 25%; 2+, ≥25% para < 50%; 3+, ≥50% para < 75%; e 4+: ≥75% corado. Casos com ≥5% de células de carcinoma coradas foram considerados positivos. A análise estatística foi realizada por métodos não-paramétricos usando o Excel-Estatísticas software ver.3 gerado pelo Hisae Yanai, Faculdade de Ciências da Universidade de Saitama (OMS Publishing, Japão).

A sobrevivência dos pacientes foi comparada entre o grupo com positiva MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 ou MUC1 /DF3 expressão e o grupo com expressão negativa de acordo com o método de Kaplan-Meier, e as diferenças entre as curvas de sobrevivência foram testadas usando o teste log-rank. A probabilidade de P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Avaliação de dois anticorpos monoclonais para MUC4

Para investigar a diferença na especificidade do anticorpo entre 8G7 e 1G8, nós. realizada por RT-PCR, transferência de Western e análise de IHC utilizando duas linhas celulares de cancro gástrico, SNU-16 e NCI-N87 células. O ARNm MUC4 foi detectada nas duas linhas celulares de cancro gástrico (Fig. 1a). Consistente com o relatório anterior [14], os nossos dados mostraram que 8G7 reconheceram uma proteína muito elevado peso molecular (mais de 500 kDa, o qual foi o tamanho esperado para MUC4 nativo). Pelo contrário, 1G8 não mostra quaisquer bandas imuno (Fig. 1B). O mesmo resultado foi observado na análise IHC (Fig. 1C).

imuno-histoquímica Coloração de gastrectomia espécimes

coloração imuno-histoquímica da mucosa gástrica não-neoplásica.

No non -neoplastic mucosa dos casos com cancro gástrico, MUC4 /8G7 foi expressa, por vezes, no citoplasma do epitélio mucoso superfície, e frequentemente, mas fracamente no citoplasma das glândulas fúndicas e pilórica (Figura S1 a e D). MUC4 /1G8 foi expresso frequentemente no ápice célula e no citoplasma do epitélio mucoso superfície, e frequentemente, mas fracamente no citoplasma das glândulas fúndicas e pilórica (Figura S1 B e E), e foi visto constantemente no endotélio vascular. MUC1 /DF3 foi por vezes expressa no epitélio mucoso superfície, e sempre nas glândulas fúndicas (particularmente intensamente nos vértices das células), mas não nas glândulas pilórica (Figura S1 C e F).

coloração imuno-histoquímica de adenocarcinoma gástrico.

Foram examinadas amostras de gastrectomia de 104 tipos de câncer gástrico precoce (pT1b2), já que desejava evitar as principais alterações degenerativas que são frequentemente observados em tecidos de câncer avançado, e para ajustar o estágio para a comparação precisa entre achados IHC e os fatores clínico-patológicas.

Quando mais de dois tipos histológicos foram misturados em uma lesão nas amostras gastrectomia de 104 tipos de câncer gástrico precoce, cada padrão histológico foi avaliada de forma independente, de acordo com o JCGC [16]. Portanto, nas amostras gastrectomia 104, poderíamos avaliar 197 carcinoma focos de vários tipos histológicos no total.

Entre as 197 lesões, houve 15 lesões de adenocarcinoma papilar (PAP) (fig. 2A-D), 39 de adenocarcinoma tubular bem diferenciado (tub1) (Figs. 2E-H), 52 de adenocarcinoma tubular moderadamente diferenciado (tub2) (fig. 2I-l), 6 dos carcinomas de mucina (MUC) (Figs. 2 M-P), 8 do tipo sólido adenocarcinoma pouco diferenciado (por1) (fig. 2T-T), 47 do tipo não-sólido adenocarcinoma pouco diferenciado (por2) (fig. 2 U-X) e 30 de carcinoma de células em anel de sinete (SIG) (fig. 2Y-b), com base no contexto de classificação histológica comum de cancro gástrico em JCGC [16]. De acordo com o contexto na classificação da OMS de tumores do estômago [17], bem como que em JCGC [16], o PAP e o tub1 foram classificadas em "adenocarcinoma bem diferenciado", e por1 e por2 foram classificadas em "pobremente diferenciadas adenocarcinoma ". Os dados da taxa de MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 e MUC1 /DF3 expressão foram resumidos na Figura 3. O número detalhada e a percentagem de células neoplásicas positivamente coradas utilizando o sistema de pontuação foram resumidos na Tabela S1.

perfil de expressão de MUC4 /8G7.

Entre as lesões adenocarcinoma 197, MUC4 /8G7 foi expresso em 83 lesões (42%). MUC4 /8G7 mostrou uma taxa significativamente mais elevada da expressão positiva (≥5% de células de carcinoma manchado), em tipos bem diferenciados (pap + tub1: 70%, 38/54) do que nos tipos pouco diferenciados (por1 + por2: 18% , 10/55) ( P Art < 0,0001) (Figura 3A, setas).. MUC4 /8G7 foi expresso principalmente no citoplasma das células neoplásicas de PAP (Fig. 2B), tub1 (Fig. 2F) e tub2 (Fig. 2J), nos casos com expressão positiva.

perfil de expressão de MUC4 /1G8.

Entre as lesões adenocarcinoma 197, MUC4 /1G8 foi expresso em 95 lesões (48%). MUC4 /1G8 mostrou taxas significativamente mais elevadas da expressão positiva em tipos bem diferenciados (PAP + tub1: 67%, 36/54) do que nos tipos pouco diferenciadas (por1 + por2: 36%, 20/55) ( P
= 0,0021) (Fig. 3B, setas). MUC4 /1G8 foi expresso principalmente nos vértices de células de PAP (Fig. 2C), tub1 (Fig. 2G) e tub2 (Fig. 2K), ou na substância mucina intracitoplasmática de sig (Fig. 2a), nos casos com expressão positiva.

perfil de expressão de MUC1 /DF3.

Entre as lesões de adenocarcinoma 197, MUC1 /DF3 foi expressa em 62 lesões (31%). MUC1 /DF3 mostraram taxas significativamente mais elevadas da expressão positiva em tipos bem diferenciados (PAP + tub1: 52%, 28/54) do que nos tipos pouco diferenciadas (por1 + por2: 13%, 7/55) ( P
< 0,0001) (Figura 3C, setas).. MUC1 /DF3 foi expresso principalmente nos vértices celulares de pap, tub1 e tub2 (Fig. 2 L), nos casos com expressão positiva.

Comparação de mucina expressão em cada tipo histológico.

em tub1, as taxas de MUC4 /8G7 e MUC4 /1G8 expressão foram significativamente maiores do que a MUC1 /DF3 ( P = 0,0106
e P
= 0,039, respectivamente) (Fig. 3, * 1). Em por2, a taxa de MUC4 /1G8 expressão foi significativamente mais elevada do que a de MUC4 /8G7 ( P
= 0,0286) ou que de MUC1 /DF3 ( P
= 0,0005) (Fig. 3, * 2). Em SIG, taxa de MUC4 /1G8 expressão foi significativamente mais elevada do que a de MUC4 /8G7 ( P
= 0,0158) ou que de MUC1 /DF3 (SIG, P
= 0,0019) (Fig . 3, * 3). Nos outros tipos histolgical (PAP, tub2, muc e por1), não houve diferença significativa nas taxas de expressão entre MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 e MUC1 /DF3 (Fig. 3).

Relação entre MUC4 ou MUC1 expressão e de invasão de vasos linfáticos, invasão dos vasos sanguíneos e metástases em linfonodos.

a avaliação semiquantitativa de invasão linfática (ly), invasão venosa (v) eo status dos linfonodos metástases (N) é definido no JCGC [16]. A linfática (LY) foi avaliada como se segue; ly0, nenhuma invasão linfática; Ly1, mínima invasão linfática; LY2, invasão linfática moderada; e ly3, marcada invasão linfática. Para a invasão venoso (v), a avaliação semelhante (V0 a V3) foi feito por meio da coloração elástica (Victoria-Azul) que foi adicionada a coloração com hematoxilina-eosina. O número total de nodos linfáticos e ao número de nodos linfáticos envolvidos em cada estação nodal (N) foram registadas como se segue; N0, sem metástase em linfonodo regional; N1, metástases em nodos linfáticos regionais 1-2; e N2, metástases em nodos linfáticos regionais 3-6. Regional metástases em linfonodos foi observada em 55 pacientes (N1, 41 casos; N2, 14 casos). Não houve correlação significativa entre os tipos histológicos e invasão linfática, invasão venosa ou o status dos linfonodos metástases.

Em cada caso, a maior pontuação dos seis graus de IHC (negativo, fraco, 1+, 2+, 3+ ou 4+) nos diferentes tipos histológicos foi contado como a pontuação IHC em cada indivíduo, por exemplo, "Pontuação IHC 4+" para um caso com [pontuação tub1, 3+; pontuação tub2, 4+]. Avaliou-se a correlação entre a pontuação IHC ea ly, v e fatores de N em cada paciente. Como mostrado na Tabela 1, a expressão MUC4 /8G7 estava relacionada com invasão linfático (r = 0,304, P
= 0,033). A expressão MUC4 /1G8 estava relacionada com a invasão linfática (r = 0,395, P
= 0,001) e metástase linfática (r = 0,296, P
= 0,045). A expressão MUC1 /DF3 estava relacionada com a invasão linfática (r = 0,357, P
= 0,032) e invasão venosa (r = 0,377, P
= 0,024).

Além disso, examinamos a correlação entre os escores IHC de MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 e MUC1 /DF3. Como mostrado na Tabela 2, houve uma correlação entre pontuação MUC4 /8G7 e pontuação MUC4 /1G8 (r = 0,486, P Art < 0,0001). Em contraste, não houve correlação entre a pontuação MUC4 /8G7 e pontuação MUC1 /DF3 (r = 0,267, P
= 0,202) e não houve correlação entre a pontuação MUC4 /1G8 e pontuação MUC1 /DF3 (r = 0,245, P
= 0,269).

Relação entre a expressão e sobrevivência MUC4 ou MUC1.

entre os 104 pacientes, o acompanhamento dados foram obtidos para 87 pacientes. Período médio de acompanhamento foi de 47,5 meses (variação, 0-193 meses). Nos 87 pacientes, um paciente morreu do carcinoma gástrico 39 meses após a cirurgia, um paciente apresentou metástase hepática, mas sobreviveu por 78 meses, e dois pacientes morreram de outras doenças. Em 85 pacientes, excluindo dois pacientes morreram de outras doenças, Kaplan-Meier estimativa foi testada pelo teste de log-rank. Entre o grupo positivo e grupo negativo (MUC4 /8G7 + vs -, MUC4 /1G8 + vs - ou MUC1 /DF3 + vs -), teste log-rank de sobrevida global (MUC4 /8G7, P = 0,27; MUC4 /1G8, P = 0,37; MUC1 /DF3, P = 0,22) e a sobrevivência livre de progressão (MUC4 /8G7, P = 0,85; MUC4 /1G8, P = 0,23; MUC1 /DF3, P = 0,83) não apresentaram diferenças significativas. Uma análise mais aprofundada dos 42 pacientes sobreviveram por mais de 5 anos também não apresentaram diferenças significativas.

Discussão

Recentemente, nós relataram que a expressão de MUC4 é um fator de prognóstico independente de adenocarcinomas pancreatobiliary [ ,,,0],10], [11], [12], bem como adenocarcinoma de pulmão [13] e carcinoma de células escamosas oral [9]. MUC-1 também tem sido relatado para ser um factor de prognóstico pobre em várias neoplasias humanas [4], [5]. Nosso estudo anterior em cancros gástricos, incluindo ambos os cânceres precoces e cancros avançados demonstraram que MUC1 é um fator prognóstico útil para o mau resultado nos pacientes [6]. No presente estudo, a relação entre a expressão de mucina e os resultados do paciente não pode ser avaliado, porque os cancros gástricos estão em fase adiantada em pT1b2 ea maioria dos pacientes tiveram um resultado favorável. No entanto, foram obtidos os seguintes resultados: (1) O MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 e expressões MUC1 /DF3 estavam relacionados com invasão linfática. (2) A expressão MUC4 /1G8 estava relacionada com metástase axilar. (3) A expressão /DF3 MU1 estava relacionada com a invasão venosa. No Japão, a ESD é o tratamento de primeira escolha para o câncer gástrico precoce [3]. Exame de MUC4, bem como MUC1 nas amostras ESD pode esclarecer se a cirurgia adicional, incluindo a dissecção de linfonodos ou freqüente follow-up para a metástase são necessárias.

Os nossos estudos anteriores demonstraram que não houve correlação entre siginificant expressão MUC4 e expressão MUC1 [10], [11], [12], [13]. Além disso, no presente estudo dos cancros gástricos na fase precoce, não houve correlação entre a expressão de siginificant MUC4 e MUC1. Ambos expressão MUC4 e MUC1 nas câncer gástrico pode estar relacionado com os fatores de mau prognóstico, como a invasão linfática, invasão venosa e metástases em linfonodos, por meio de mecanismo diferente.

No estudo anterior de cancros gástricos usando MAb 8G7, Senapati et ai. demonstraram que a expressão MUC4 /8G7 não foi associado com o tipo de tumor, estádio ou com o grau de diferenciação [18]. Curiosamente, os resultados mostraram uma taxa de expressão de 42% na fase de cancros I (n = 19), que está de acordo com os nossos dados (MUC4 /8G7: 42% e MUC4 /1G8: 48%) no presente estudo examinando a fase I cancros (n = 104). No entanto, nosso estudo revelou que as expressões tanto MUC4 /8G7 e MUC4 /1G8 foram diferentes entre os tipos histológicos, e foram significativamente maiores nos tipos bem diferenciados do que no tipo pouco diferenciados. expressão MUC-1 /DF3 também foi significativamente mais elevada nos tipos bem diferenciadas do que no tipo fracamente diferenciado. Nós relatamos que uma expressão MUC1 foi mais elevada no adenocarcinoma bem diferenciado em cancros gástricos, incluindo cancros avançados, ea alta expressão MUC1 pode afetar a sobrevivência de pacientes com adenocarcinoma bem diferenciado do estômago [6]. A alta expressão de MUC4 no adenocarcinoma bem diferenciado também pode afetar a sobrevivência de pacientes com câncer gástrico. No nosso estudo anterior [6], a taxa de expressão elevada da proteína MUC1 /DF3 foi significativamente mais elevada nos cancros gástricos avançada do que nos cancros gástricos precoces. A relação de expressão MUC4 com a invasão de câncer gástrico seria uma área interessante de estudo.

Há controvérsias sobre o significado prognóstico da MUC4 /8G7 e expressão MUC4 /1G8. Assim, revisamos 19 artigos de estudo MUC4 IHC aplicado para vários tecidos de câncer humanos (Tabela 3). A importância da MUC4 /8G7 e MUC4 /1G8 não pôde ser avaliado em 8 dos 19 estudos. Um estudo utilizando o anticorpo anti-MIUC4 policlonal relatado que a expressão MUC4 está relacionada com um resultado fovorabel [19], três estudos mostram nenhuma correlação entre a expressão MUC4 e prognóstico [20], [21], [22], os outros três estudos não fez tem algum comentário sobre a correlação entre a expressão MUC4 e prognóstico [18], [23], [24], e o restante ensaio de cancro da tiróide não relataram nenhuma expressão MUC4 no câncer [25]. Por outro lado, em outros artigos 11, havia uma diferença aparente do significado prognóstico entre a expressão MUC4 /8G7 e expressão MUC4 /1G8. A maioria dos estudos usando 8G7, que foi gerado contra MUC4 humana, expressão MUC4 /8G7 está relacionado ao comportamento do tumor agressivo ou um mau resultado em carcinomas humanos [9], [10], [11], [12], [13], [ ,,,0],26]. Em contraste, a maioria dos estudos que usam 1G8, que foi criado contra rato ASGP-2, descrito que a expressão MUC4 /1G8 é relativa a um resultado favorável [27], [28], [29], [30], embora um estudo de pâncreas adenocarcinoma descrito que a expressão MUC4 /1G8 está relacionado com a sobrevivência pobre [31]. Esta diferença clara levanta a questão de saber se 8G7 e 1G8 têm personagens essencialmente diferentes. O MAb 1G8 foi criado usando ratos MUC4 epitopo [15]. MUC4 humano e de rato mostra MUC4 mais de 60% de similaridade de sequência de péptido [32], mas não são idênticos. É digno de nota que IHC utilizando MAb 1G8 sempre mostra coloração positiva no endotélio vascular, o que é um pouco diferente, como a expressão de MUC4, que é um dos membros de mucinas.

Assim, avaliou-se a especificidade do MAb 8G7 e 1G8 MAb por Western blotting e IHC de duas linhas celulares de cancro gástrico. A nossa análise de transferência de Western mostrou que o MAb 8G7 reconheceram uma proteína muito elevado peso molecular (mais de 500 kDa, o qual foi o tamanho esperado para MUC4 nativa), enquanto que o MAb 1G8 não mostra quaisquer bandas imunorreactivas. A análise IHC também mostraram coloração positiva MAb 8G7 mas coloração negativa MAb 1G8 nas duas linhas celulares de cancro gástrico. ARNm MUC4 também foi expressa nas duas linhas celulares de cancro gástrico no presente estudo, como se mostra no estudo anterior analisando as linhas de células de cancro do pâncreas por análises Northen blot [33], [34] RT-PCR e. Ambos MAb 8G7 e 1G8 MAb reagir com tecidos de câncer gástrico humano, embora os locais de MUC4 /8G7 e expressão MUC4 /1G8 mostrou uma diferença marcante. Em tecidos de câncer gástrico, MUC4 /8G7 foi expresso principalmente no citoplasma das células neoplásicas do pap e banheira, enquanto MUC4 /1G8 foi expresso principalmente nos vértices celulares de pap e banheira ou substância mucina intracitoplasmática de sig. Uma vez que o padrão de expressão citoplasmática de MUC4 /8G7 é visto também no adenocarcinoma do pâncreas, colangiocarcinoma intra-hepática, carcinoma do ducto biliar extra de hepática, adenocarcinoma de pulmão e carcinoma de células escamosas oral [9], [10], [11], [12], [13 ], o padrão intracitoplasmática de expressão MUC4 /8G7 em tecidos com câncer gástrico pode ser razoável. Em contraste, o padrão de expressão linear de MUC4 /1G8, juntamente com os ápices de células de tecidos de cancro gástrico pode reflectir funções desconhecidas ou características da subunidade MUC4β detectados pelo MAb 1G8 criado contra epítopo de rato [15], como o presente estudo demonstrou que MUC4 /expressão 1G8 foram relacionados à invasão linfática e linfonodos metástases que são fatores de mau prognóstico, mesmo no câncer gástrico precoce. Particularmente em por2 e SIG, a taxa de MUC4 /1G8 expressão foi significativamente mais elevada do que a de MUC4 /8G7 ou que de MUC1 /DF3. Além disso, houve uma correlação entre a expressão siginificant MUC4 /8G7 e expressão MUC4 /1G8 nos pacientes examinados. Assim, o sinal de IHC MUC4 /1G8 detectada nas amostras gastrectomia pode mostrar um significado importante do epitopo detectada pelo mAb 1G8, embora não houvesse nenhuma reactividade de expressão MUC4 /1G8 em linhas celulares de cancro gástrico humano (SNU-16 e NCI- N87). O epitopo detectada pelo MAb 1G8 é uma área de interesse para o estudo futuro.

Em conclusão, no presente estudo de cancros gástricos precoces, expressões MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 e MUC1 /DF3 foram observadas principalmente no bem adenocarcinomas diferenciadas. A expressão MUC4 /8G7 estava relacionada com a invasão linfática. A expressão MUC4 /1G8 estava relacionada com a invasão linfática e metástases em linfonodos. A expressão MUC1 /DF3 estava relacionada com a invasão linfática e invasão venosa. O exame de expressão MUC4 e MUC1 nos cancros gástricos se tornaria um marcador útil para prever fatores de mau prognóstico relacionadas com a invasão de vasos, mesmo na fase inicial.

Informações de Apoio
Figura S1.
Na mucosa não-neoplásica dos casos com cancro gástrico, MUC4 /8G7 foi expressa, por vezes, no citoplasma do epitélio mucoso superfície, e frequentemente, mas fracamente no citoplasma das glândulas fúndicas e pilórica (A e D). MUC4 /1G8 foi expresso frequentemente no ápice célula e no citoplasma do epitélio mucoso superfície, e frequentemente, mas fracamente no citoplasma das glândulas fúndicas e pilórica (B e E), e foi visto constantemente no endotélio vascular. MUC1 /DF3 foi por vezes expressa no epitélio mucoso superfície, e sempre nas glândulas fúndicas (particularmente intensamente nos vértices das células), mas não nas glândulas pilórica (C e F). ampliação original × 100 (A, B, C), × 400 (D, E, F)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0049251.s001
(TIF)
Tabela S1.
número detalhada e percentual de células neoplásicas positivamente coradas utilizando o sistema de pontuação
doi:. 10.1371 /journal.pone.0049251.s002
(DOC)

Reconhecimentos

Agradecemos ao Sr. Y. Atsuchi, o Sr. K. Matsuo, Ms. C. Baba, Ms. Y. Nishimura, Ms. S. Yoshimura e Ms. I. Houjou por sua assistência técnica.

• PLOS ONE: altos níveis de aminoácidos aromáticos no suco gástrico durante os estágios iniciais de câncer gástrico Progression
• PLoS ONE: CYP2E1 RsaI /PstI polimorfismo e câncer gástrico de susceptibilidade: Meta-análises com base em 24 de Casos e Controles Studies