PLoS ONE: MUC4 en MUC1 expressie in adenocarcinoom van de maag correleert met Vessel Invasion en lymfekliermetastasen: Een Immunohistochemische studie van Early Gastric Cancer

Abstract

We hebben eerder gemeld dat MUC4 uitdrukking is een slechte prognostische factor in verschillende carcinomen. Onze eerdere studie toonde ook aan dat MUC-1 expressie in maagkanker, waaronder de vroege en gevorderde stadia is een slechte prognostische factor. In de onderhavige studie werden de expressieprofielen van MUC4 en MUC1 onderzocht door immunohistochemie (IHC) met twee anti-MUC4 monoklonale antilichamen (MAbs), 8G7 en 1G8 en anti-MUC1 MAb DF3 in 104 gastrectomie specimens vroegtijdig maagdarmkanker met submucosale invasie (pT1b2), waaronder 197 histologische subtype laesies. Voordat de IHC studie van de menselijke specimens, evalueerden wij de specificiteit van de twee MAb's door Western blotting en IHC twee MUC4 mRNA expressie maagkanker cellijnen. Mab 8G7 reageerde duidelijk, terwijl MAb 1G8 geen reactiviteit niet vertoonden, in zowel Western blotting of IHC. In de IHC van de maagkanker, de expressie tarieven van MUC4 /8G7 gedetecteerd door MAb 8G7, MUC4 /1G8 gedetecteerd door MAb 1G8 en MUC1 /DF3 door MAb DF3 gedetecteerd in goed gedifferentieerd types (70%, 38/54, 67%, 36/54, 52%, 28/54) waren significant hoger dan die in slecht gedifferentieerde types (18%, 10/55, 36%, 20/55, 13%, 7/55) ( P
< 0,0001; P
= 0,0021; P Restaurant < 0,0001), respectievelijk. De MUC4 /8G7 expressie werd in verband met lymfatische invasie (r = 0,304, P
= 0,033). Anderzijds, werd de MUC4 /1G8 expressie verband met lymfatische invasie (r = 0,395, P
= 0,001) en lymfeknoop métastase (r = 0,296, P
= 0,045). De MUC1 /DF3 expressie werd in verband met lymfatische invasie (r = 0,357, P
= 0,032) en veneuze invasie (r = 0,377, P
= 0.024). Kortom, de uitdrukking van MUC4 evenals MUC1 in het begin van maagkanker is een nuttige marker om slechte prognostische factoren die verband houden met vat invasie voorspellen

Visum:. Tamura Y, Higashi M, Kitamoto S, S Yokoyama, Osako M, Horinouchi M, et al. (2012) MUC4 en MUC1 expressie in adenocarcinoom van de maag correleert met Vessel Invasion en lymfekliermetastasen: Een Immunohistochemische studie van Vroege maagkanker. PLoS ONE 7 (11): e49251. doi: 10.1371 /journal.pone.0049251

Editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 17 augustus 2012; Aanvaard: 5 oktober 2012; Gepubliceerd: 13 november 2012

Copyright: © 2012 Tamura et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Deze studie werd deels gesteund door Princes Takamatsu Cancer Research Fund S. Yonezawa; Grants-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek Wetenschappelijk Onderzoek (B) 23.390.085 S. Yonezawa; Wetenschappelijk Onderzoek (C) 21.590.399 M. Higashi; Young Scientists (B) 24.701.008 S. Yokoyama; Wetenschappelijk onderzoek op prioritaire gebieden die 239.349 naar S. Kitamoto (JSPS Fellowship) van het ministerie van Onderwijs, Wetenschap, Sport, Cultuur en Technologie, Japan; een Pancreas Research Foundation van Japan naar S. Yokoyama; en de Kodama Memorial Foundation, Japan M. Higashi. S. Batra wordt gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health subsidies (CA78590, CA163120, CA133944 en CA111294). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript. Geen extra externe financiering voor deze studie

Competing belangen:.. De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict ten aanzien van het werk in de studie

Introductie

Maagkanker is de vierde meest voorkomende kanker wereldwijd en meer dan 90% van maagkanker zijn adenocarcinomen [1]. Recent, in Japan, vroegtijdige opsporing door de routine endoscopisch onderzoek in de gastro klinieken heeft accurate diagnose en effectieve chirurgische of endoscopische behandelingen geleid, resulterend in een relatief betere prognose. In de analyse van 11.261 patiënten met maagkanker behandeld door maagresectie, de TNM 5-jaarsoverleving voor fase IA was 91,8% en voor fase IB de overleving was 84,6% [2]. Voor de vroege maagkanker, endoscopische submucosale dissectie (ESD) is de eerste keuze behandeling in Japan, maar aan de criteria van de nieuwe ingreep zoals lymfeklierdissectie na de ESD nog controversieel [3].

Onze series van immunohistochemie (IHC) studies mucine expressie in verschillende menselijke neoplasmen hebben aangetoond dat de expressie van het MUC1 mucine (pan-epitheliaal membraan geassocieerde mucine) houdt verband met invasieve groei van de tumoren en slechte uitkomst van de patiënten, terwijl de expressie van de MUC2 mucine (intestinaal soort mucine uitscheidende) houdt verband met de niet-invasieve proliferatie van tumoren en een gunstig resultaat voor de patiënten [4], [5]. Onze eerdere studie toonde aan dat MUC-1 expressie in maagkanker is een slechte prognostische factor [6].

MUC4 werd voor het eerst als tracheobronchiale mucine [7] en een membraan-geassocieerde mucine [8]. In onze studie serie, de expressie van MUC4 in intrahepatische cholangiocarcinoom, pancreas ductaal adenocarcinoom, extrahepatische galwegen carcinoom, long adenocarcinoom en orale plaveiselcelcarcinoom een ​​onafhankelijke factor voor slechte prognose en is een nuttige marker om de resultaten van de patiënten [voorspellen ,,,0],5], [9], [10], [11], [12], [13]. Helaas zijn er weinig studies van de MUC4 expressieprofiel in menselijke maagkanker. In het onderhavige onderzoek onderzochten we de expressieprofielen van MUC4 en MUC1 in vroege maagkanker weefsels, en vonden dat MUC4 en MUC-1 expressie in de vroege maagkanker slechte prognostische factoren van lymfekanaal invasie, bloedvat invasie en lymfeklieren zou worden metastase.

Al anti-MUC4 monoklonale antilichamen (MAbs), 8G7 en 1G8, is bekend dat verschillende gebieden van MUC4 molecuul te detecteren. De MAb 8G7 herkent een tandem repeat sequentie (STGDTTPLPVTDTSSV) van het menselijke MUC4α subunit [14]. De MAb 1G8 is opgewekt tegen de rattensequentie (rat ASGP-2), en herkent een epitoop op de rat ASGP-2 subunit, dat overeenkomt met de menselijke MUC4β subeenheid en vertoont een kruisreactiviteit met humaan monsters [15]. Aldus werd speciale aandacht besteed aan de vergelijking van twee anti-MUC4 MAbs door Western blotting en IHC twee maagkanker cellijnen, voor de IHC studie van menselijke maagkanker weefsels. Aangezien er controverse over de prognostische betekenis van deze anti-MUC4 MAbs, literatuuronderzoek van MUC4 expressie in diverse vormen van kanker werd ook uitgevoerd.

Materialen en methoden

Patiënten en weefselmonsters

Gastrectomie exemplaren van 104 vroege maagkanker, die submucosale invasie, pT1b2 tonen met of zonder lymfklier metastase, werden opgehaald uit het bestand tussen 1994 en 2008 van de Kagoshima-shi Medical Association Hospital. De gemiddelde leeftijd van de patiënten was 65,7 (S.D., 9.8; range, 39-92 jaar, gemiddelde leeftijd 66 jaar); 64 gevallen waren mannen, en 40 gevallen waren vrouwen. Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de leidende beginselen van de Verklaring van Helsinki, en goedgekeurd door de ethische commissie voor Kagoshima-shi Medical Association Hospital (KMAH 2011-02-02). Op de hoogte werd geschreven toestemming verkregen van alle patiënten. In het geval van meer dan twee histologische types gemengd in één laesie werd elke histologische patroon afzonderlijk geëvalueerd, volgens de Japanse Classificatie van maagcarcinoom (JCGC) [16].

Evaluatie van monoklonale antilichamen voor MUC4

cellen en kweekomstandigheden.

Human maagkanker cellijnen (SNU-16 en NCI-N87) en pancreaskanker cellijnen (PANC1 en CAPAN1) werden gekocht van de American Type Culture Collection (Manassas, VA). Beide maagkanker cellen werden in RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) gehandhaafd; PANC1 cellen werden in DMEM (Sigma-Aldrich) gehandhaafd; Capan1 cellen werden in DMEM /F-12 (Sigma-Aldrich) gehandhaafd. Alle media werden aangevuld met 10% foetaal runderserum (GIBCO, Breda, Nederland) en 100 U /ml penicilline /100 ug /ml streptomycine (Sigma-Aldrich). Alle cellen werden geïncubeerd in 5% CO2 bij 37 ° C en op sub-confluent niveau.

RNA-extractie en RT-PCR.

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit de cellen met behulp van de RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) en gekwantificeerd NanoDrop ND-1000 spectrofotometer. Het verkregen mRNA (2 ug) werd reverse getranscribeerd in cDNA met de hoge capaciteit RNA naar cDNA kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). De volgende primers werden ontworpen voor PCR de volgende: MUC4, 5'TGGGACGATGCTGACTTCTC-3 ', 5'-CCCCGTTGTTTGTCATCTTTC-3'; ACTB, 5'-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCTG-3 ', 5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'. PCR werd uitgevoerd met AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix (Applied Biosystems) volgens het protocol van de fabrikant.

Eiwitextractie en western blotting.

Totale cellysaten werden bereid met RIPA buffer die proteaseremmer cocktail (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). De eiwitconcentratie werd gemeten met de BCA assay (Thermo Scientific, Rockford, IL). Een gelijke hoeveelheid eiwit lysaat werd gescheiden op 2% agarosegel bevattende SDS en passief overgebracht op PVDF-membraan overnacht bij kamertemperatuur. Membranen werden geblokkeerd met 1% afgeroomde melk /PBST dan 2 uur en onderworpen aan de standaard procedure immunodetectie met specifieke primaire antilichamen. De primaire antilichamen zijn: anti-humane MUC4 MAb 8G7 (1:1000, gegenereerd door Dr. K. Surinder Batra, University of Nebraska Medical Center, Omaha, NE) en 1G8 (1:1000, gekocht van Invitrogen, Camarillo, CA) en anti-humaan a-tubuline MAb DM1A (1:2,000, Sigma-Aldrich).

immunocytochemie voor gekweekte cellen.

voor MUC4 kleuring in gekweekte cellen, cellen werden uitgezet in 8-chamber slides (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) en gedurende een nacht. Cellen werden gefixeerd met 3,7% formaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gekleurd met MAb 8G7 (1:24,000) en MAb 1G8 (1:4,000) overnacht bij 4 ° C. Signaaldetectie werd uitgevoerd door een immunoperoxidase toepassing van een Vectastain Elite ABC kit (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) volgens de instructies van de fabrikant.

Immunohistochemie voor menselijke weefsels

IHC voor menselijke maagcarcinomen werd uitgevoerd met de volgende antilichamen in de maximale snijvlakken in elke tumor. MUC4 werd gedetecteerd door twee MAb's, 8G7 en 1G8. Voor de vergelijkende studie werd MUC1 expressie eveneens bestudeerd door MAb DF3 (muis IgG, TFB, Tokyo, Japan). IHC werd uitgevoerd door immunoperoxidase werkwijze als volgt. Antigeenterugtrekking werd uitgevoerd met CC1 antigeenterugtrekking buffer (pH 8,5 EDTA, 10.037 ° C, 30 min., Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) voor alle secties. Na incubatie met de primaire antilichamen (MAb MUC4 /8G7 verdund 1:3000, 37 ° C, 32 min .; MAb MUC4 /1G8 verdund 1:500, 37 ° C, 24 min .; MAb MUC1 /DF3 verdund 1:50, 37 ° C, 32 min.) in met fosfaat gebufferde zoutoplossing pH 7,4 (PBS) met 1% runderserumalbumine, werden gekleurd op een Benchmark XT geautomatiseerde kleurmachine met een detectiekit diaminobenzidine (DAB Ultraview, Ventana Medical Systems). Eenvoudigheidshalve MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 en MUC1 /DF3 worden gebruikt om de antigenen mucine gedetecteerd door elk antilichaam geven.

Scoring van de resultaten en statistische analyse.

Vier verblind onderzoekers ( YT, MH, MG en SY) evalueerde de IHC kleuring gegevens onafhankelijk van elkaar. Wanneer de evaluatie van de vier verschilden, werd een definitieve beslissing genomen bij consensus. De resultaten werden beoordeeld op basis van het percentage van positief gekleurde carcinoomcellen en de procentuele gegevens werden onderverdeeld in zes klassen met de volgende scoresysteem: negatief, geen van de carcinoomcellen gekleurd; flauw, < 5% van carcinoma cellen gekleurd; 1+, ≥5% naar < 25%; 2+, ≥25% naar < 50%; 3+, ≥50% naar < 75%; en 4+: ≥75% lood. Gevallen met ≥5% van carcinoma cellen gekleurd werden als positief beschouwd. Statistische analyse werd uitgevoerd door niet-parametrische methoden met Excel-Statistieken ver.3 software gegenereerd door Hisae Yanai, Faculteit der Natuurwetenschappen, Saitama University (OMS Publishing, Japan).

De overleving van de patiënten werd vergeleken tussen de groep met positieve MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 of MUC1 /DF3 expressie en de groep met negatieve uitdrukking volgens de Kaplan-Meier-methode, en de verschillen tussen de survival curves werden getest met behulp van de log-rank test. Een kans van P < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant

Resultaten

Evaluatie van twee monoklonale antilichamen voor MUC4

Om het verschil in antilichaam specificiteit tussen 8G7 en 1G8, we onderzoeken. uitgevoerd RT-PCR, Western blotting en IHC analyse met twee maagkanker cellijnen SNU-16 en NCI-N87 cellen. De MUC4 mRNA werd gedetecteerd in de twee maagkanker cellijnen (Fig. 1A). In overeenstemming met het vorige verslag [14], onze gegevens bleek dat 8G7 herkende een zeer hoog gewicht eiwit moleculair (meer dan 500 kD, waarvan de verwachte grootte voor inheemse MUC4 was). Daarentegen heeft 1G8 geen immuunreactieve banden (Fig. 1B) tonen. Hetzelfde resultaat werd waargenomen in de IHC analyse (Fig. 1C).

immunohistochemische kleuring van Gastrectomie Specimens

Immunohistochemische kleuring van niet-neoplastische maagslijmvlies.

In de non -neoplastic slijmvlies van de gevallen maagkanker, werd MUC4 /8G7 soms uitgedrukt in het cytoplasma van oppervlakte slijm epitheel, en vaak maar zwak in het cytoplasma van fundic en pylorische klieren (Figuur S1 A en D). MUC4 /1G8 werd vaak uitgedrukt in de cel cytoplasma en apex van het oppervlak slijmvlies epitheel, en vaak maar zwak in het cytoplasma van fundic en pylorische klieren (Figuur S1 B en E), en was constant gezien op het vasculaire endotheel. MUC1 /DF3 werd soms uitgedrukt in het oppervlak slijmvlies epitheel, en altijd in de fundus-klieren (met name intensief op de mobiele toppen), maar niet in de pylorus klieren (Figuur S1 C en F).

Immunohistochemische kleuring van maagdarmkanker.

we onderzochten gastrectomie specimens van 104 vroege maagkanker (pT1b2), omdat we wilden de grote degeneratieve veranderingen die vaak gezien bij gevorderde kanker weefsels voorkomen, en de fase passen voor de juiste vergelijking van IHC bevindingen en clinicopathologic factoren.

Wanneer meer dan twee histologische soorten van een laesie in de gastrectomie specimens van 104 vroege maagkanker werden gemengd, werd elke histologische patroon afzonderlijk geëvalueerd volgens de JCGC [16]. Daarom is in de 104 gastrectomie specimens, konden 197 carcinoom foci van diverse histologische types in totaal evalueren.

Onder de 197 laesies waren er 15 laesies papillair adenocarcinoom (PAP) (fig. 2A-D), 39 goed gedifferentieerd buisvormige adenocarcinoom (tub1) (fig. 2E-H), 52 matig gedifferentieerde buisvormige adenocarcinoom (tub2) (fig. 2I-L), 6 van mucineuze carcinomen (MUC) (Fig. 2M-P), 8 massief soort slecht gedifferentieerde adenocarcinoom (por1) (Fig. 2T-T), 47 van niet-vaste soort slecht gedifferentieerde adenocarcinoom (por2) (Fig. 2U-X) en 30 van de zegelring cell carcinoma (sig) (Fig. 2Y-b), op basis van de context van gemeenschappelijke histologische classificatie van maagkanker in JCGC [16]. Volgens de context van de WHO-classificatie van tumoren van de maag [17] evenals die in JCGC [16], pap en tub1 werden ingedeeld in 'goed gedifferentieerd adenocarcinoom ", en por1 en por2 werden ingedeeld in' slecht-gedifferentieerde adenocarcinoom ". De gegevens van de expressiesnelheid van MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 en MUC1 /DF3 samengevat in figuur 3. De gedetailleerde aantal en percentage positief gekleurd neoplastische cellen met het scoresysteem zijn samengevat in Tabel S1.

expressieprofiel van MUC4 /8G7.

Onder de 197 adenocarcinoom lesies werd MUC4 /8G7 uitgedrukt in 83 laesies (42%). MUC4 /8G7 toonden een significant hoger percentage van de positieve uitdrukking (≥5% van carcinoom cellen gekleurd) in goed gedifferentieerd types (pap + tub1: 70%, 38/54) dan die in slecht gedifferentieerde types (por1 + por2: 18% , 10/55) ( P Restaurant < 0,0001) (Fig 3A, pijlen).. MUC4 /8G7 werd voornamelijk in het cytoplasma van de neoplastische cellen van pap (fig. 2B), tub1 (fig. 2F) en tub2 (Fig. 2J), in de gevallen met positieve expressie.

expressieprofiel van MUC4 /1G8.

Onder de 197 adenocarcinoom lesies werd MUC4 /1G8 uitgedrukt in 95 laesies (48%). MUC4 /1G8 toonden beduidend hogere tarieven van de positieve uitdrukking in goed gedifferentieerd types (pap + tub1: 67%, 36/54) dan die in slecht gedifferentieerde types (por1 + por2: 36%, 20/55) ( P
= 0,0021) (Fig. 3B, pijl). MUC4 /1G8 werd voornamelijk tot expressie in de cel hoekpunten van pap (fig. 2C), tub1 (fig. 2G) en tub2 (Fig. 2K), of in de intracytoplasmatische mucine inhoud van sig (fig. 2a), in de gevallen positieve expressie.

expressieprofiel van MUC1 /DF3.

Onder de 197 adenocarcinoom laesies, MUC1 /DF3 werd uitgedrukt in 62 laesies (31%). MUC1 /DF3 toonden beduidend hogere tarieven van de positieve uitdrukking in goed gedifferentieerd types (pap + tub1: 52%, 28/54) dan die in slecht gedifferentieerde types (por1 + por2: 13%, 7/55) ( P Restaurant < 0,0001) (Fig 3C, pijlen).. MUC1 /DF3 werd vooral tot uitdrukking in de cel toppen van pap, tub1 en tub2 (Fig. 2L), in de gevallen met positieve uitdrukking.

Vergelijking van mucine expressie in elk histologisch type.

in tub1 expressie snelheden van MUC4 /8G7 en MUC4 /1G8 waren significant hoger dan die van MUC1 /DF3 ( P
= 0,0106 en P
= 0,039, respectievelijk) (fig. 3, * 1). In por2 de expressiesnelheid van MUC4 /1G8 was significant hoger dan die van MUC4 /8G7 ( P
= 0,0286) of van MUC1 /DF3 ( P
= 0,0005) (Fig. 3, * 2). In sig, expressiesnelheid van MUC4 /1G8 was significant hoger dan die van MUC4 /8G7 ( P
= 0,0158) of van MUC1 /DF3 (sig, P
= 0,0019) (Fig . 3, * 3). In de andere histolgical types (pap, tub2, en muc por1), was er geen significant verschil in de expressie tarieven onder MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 en MUC1 /DF3 (fig. 3).

Verbindingen tussen MUC4 of MUC1 expressie en lymfe vat invasie, bloedvat invasie en lymfeklieren metastase.

Semikwantitatieve evaluatie van lymfatische invasie (ly), veneuze invasie (v) en de lymfeklieren metastase-status (N) is gedefinieerd in de JCGC [16]. Lymfatische invasie (ly) werd als volgt beoordeeld; ly0, geen lymfatische invasie; LY1, minimal lymfatische invasie; LY2, matige lymfatische invasie; en LY3, gemarkeerd lymfatische invasie. Voor de veneuze invasie (v), soortgelijke evaluatie (v0 v3) werd uitgevoerd met elastische kleuring (Victoria-Blue) die voor hematoxyline-eosine kleuring werd toegevoegd. Het totale aantal lymfeklieren en het aantal betrokken lymfeknopen bij elk station knooppunten (N) waren als volgt geregistreerd; N0, geen regionale lymfekliermetastasen; N1, metastase in 1-2 regionale lymfklieren; en N2, metastase in 3-6 regionale lymfeknopen. Regionale lymfeklieren metastase werd waargenomen bij 55 patiënten (N1, 41 gevallen, N2, 14 gevallen). Er was geen significante correlatie tussen de histologische types en lymfatische invasie, veneuze invasie of lymfeklieren metastase-status.

In elk geval is de hoogste score van de zes IHC graden (negatief, zwak, 1+, 2+, 3+ of 4+) in de verschillende histologische types werd geteld als de IHC score in elk individu, bv "IHC score 4+" voor een geval met [tub1 score, 3+; tub2 score, 4+]. We evalueerden de correlatie tussen de IHC score en de ly, V en N-factoren in elke patiënt. Zoals getoond in Tabel 1, werd de MUC4 /8G7 expressie verband met lymfatische invasie (r = 0,304, P
= 0,033). De MUC4 /1G8 expressie werd in verband met lymfatische invasie (r = 0,395, P
= 0,001) en de lymfeklieren metastase (r = 0,296, P
= 0,045). De MUC1 /DF3 expressie werd in verband met lymfatische invasie (r = 0,357, P
= 0,032) en veneuze invasie (r = 0,377, P
= 0.024).

Verder hebben we gekeken naar de correlatie tussen de scores van IHC MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 en MUC1 /DF3. Zoals weergegeven in tabel 2, was er een correlatie tussen MUC4 /8G7 score en MUC4 /1G8 score (r = 0,486, P Restaurant < 0,0001). In tegenstelling, was er geen correlatie tussen MUC4 /8G7 score en MUC1 /DF3 score (r = 0,267, P
= 0,202), en er was geen correlatie tussen MUC4 /1G8 score en MUC1 /DF3 score (r = 0,245, P
= 0,269).

Relatie tussen MUC4 of MUC1 expressie en overleving.

van de 104 patiënten, de follow-up gegevens werden verkregen voor 87 patiënten. De mediane follow-up periode was 47,5 maanden (range, 0-193 maanden). Bij de 87 patiënten, één patiënt stierf aan het maagcarcinoom 39 maanden na de operatie, vertoonde één patiënt levermetastasen maar overleefde 78 maanden, en twee patiënten overleden aan andere ziekten. Bij 85 patiënten met uitzondering van overleden twee patiënten van andere ziekten, Kaplan-Meier schatting werd getest met behulp van de log-rank test. Tussen de positieve groep en negatieve groep (MUC4 /8G7 + vs -, MUC4 /1G8 + vs - of MUC1 /DF3 + versus -), log-rank test van de totale overleving (MUC4 /8G7, P = 0,27; MUC4 /1G8, P = 0,37; MUC1 /DF3, P = 0,22) en progressievrije overleving (MUC4 /8G7, P = 0,85; MUC4 /1G8, P = 0,23; MUC1 /DF3, P = 0,83) toonden geen significante verschillen. Verdere analyse van 42 patiënten overleefden meer dan 5 jaar bleek ook geen significante verschillen.

Discussie

Onlangs hebben we gemeld dat de expressie van MUC4 een onafhankelijke slechte prognostische factor pancreatobiliary adenocarcinomen [ ,,,0],10], [11], [12] en long adenocarcinoom [13] en orale plaveiselcelcarcinoom [9]. MUC1 is ook vermeld een slechte prognostische factor in verschillende menselijke neoplasmen [4], [5]. Onze eerdere studie in maagkanker, zowel vroege kankers en gevorderde kankers aangetoond dat MUC1 is een nuttige prognostische factor voor slechte uitkomst bij patiënten [6]. In deze studie, kan de relatie tussen mucine expressie en de resultaten van de patiënt niet worden geëvalueerd, omdat de maagkanker in een vroeg stadium bij pT1b2 en de meeste patiënten een gunstige afloop. Toch werden de volgende resultaten verkregen: (1) De MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 en MUC1 /DF3 uitdrukkingen hielden verband met lymfatische invasie. (2) De MUC4 /1G8 expressie is geassocieerd met lymfeklier. (3) De MU1 /DF3 expressie werd geassocieerd met veneuze invasie. In Japan, ESD is de eerste keuze behandeling van vroege maagkanker [3]. Onderzoek van MUC4 en MUC1 in de ESD dieren kan aangeven of de nieuwe ingreep, zoals lymfeklierdissectie of frequente follow-up van de metastase noodzakelijk.

Onze eerdere studies aangetoond dat er geen correlatie tussen siginificant MUC4 expressie en MUC1 expressie [10], [11], [12], [13]. Ook in deze studie van maagkanker in een vroeg stadium, was er geen siginificant correlatie tussen expressie van MUC4 en MUC1. Zowel MUC4 en MUC-1 expressie in de maagkanker kan worden gerelateerd aan de slechte prognostische factoren, zoals lymfatische invasie, veneuze invasie en lymfekliermetastase middels ander mechanisme.

De eerdere studie van maagkanker gebruik MAb 8G7, Senapati et al. aangetoond dat MUC4 /8G7 expressie niet werd geassocieerd met type tumor, graad of de mate van differentiatie [18]. Interessant is dat de resultaten toonden een 42% expressiesnelheid in de fase I kanker (n = 19), die in overeenstemming is met onze data (MUC4 /8G7: 42% en MUC4 /1G8: 48%) in de onderhavige studie naar fase I kanker (n = 104). Echter, ons onderzoek is gebleken dat beide MUC4 /8G7 en MUC4 /1G8 uitdrukkingen waren verschillend tussen de histologische types, en waren significant hoger in de put gedifferentieerde vormen dan in de slecht gedifferentieerde type. MUC1 /DF3 expressie was significant hoger in de put gedifferentieerde vormen dan in de slecht gedifferentieerde type. We meldden dat MUC1 expressie was hoog in de goed gedifferentieerd adenocarcinoom in maagkanker waaronder geavanceerde vormen van kanker, en de hoge MUC1 expressie kan de overleving van patiënten van invloed met een goed gedifferentieerd adenocarcinoom van de maag [6]. De hoge expressie van MUC4 in de goed gedifferentieerd adenocarcinoom mag de overleving van patiënten met maagkanker beïnvloeden. In onze vorige studie [6], de snelheid van de hoge expressie van MUC-1 /DF3 was significant hoger in de gevorderde maagkanker dan in de vroege maagkanker. De relatie van MUC4 expressie met de invasie van maagkanker zou een interessant gebied van studie

te zijn. Er is controverse over de prognostische betekenis van MUC4 /8G7 en MUC4 /1G8 expressie. Zo hebben we 19 werken van MUC4 IHC studie aangevraagde verschillende humane kanker weefsels (Tabel 3) beoordeeld. De betekenis van MUC4 /8G7 en MUC4 /1G8 kon niet worden geëvalueerd in 8 van de 19 studies. Een studie met behulp van polyklonale anti-MIUC4 antilichaam gemeld dat MUC4 expressie gerelateerd is aan een fovorabel uitkomst [19], drie studies tonen geen correlatie tussen MUC4 expressie en prognose [20], [21], [22], de andere drie studies niet opmerkingen over het verband tussen MUC4 expressie en prognose [18], [23], [24], en de resterende één studie van schildklierkanker gemeld geen MUC4 expressie in de kanker [25]. Anderzijds, in de andere 11 artikelen, was er een duidelijk verschil tussen de prognostische betekenis MUC4 /8G7 expressie en MUC4 /1G8 expressie. De meeste studies met 8G7, dat werd gegenereerd tegen humane MUC4 wordt MUC4 /8G7 uitdrukking betreffende agressief gedrag van de tumor of een slechte prognose in humane carcinomen [9], [10], [11], [12], [13], [ ,,,0],26]. Daarentegen zijn de meeste onderzoeken met 1G8, die tegen rat ASGP-2 is gerezen, beschreven dat MUC4 /1G8 expressie heeft betrekking op een gunstig resultaat [27], [28], [29], [30], maar een studie van pancreatische adenocarcinoom beschreven dat MUC4 /1G8 expressie gerelateerd aan slechte overleving [31]. Dit duidelijk verschil roept de vraag op of 8G7 en 1G8 in wezen verschillende karakters. Het Mab 1G8 werd verhoogd met behulp van de rat MUC4 epitoop [15]. MUC4 menselijke en rat MUC4 toont meer dan 60% sequentiegelijkheid peptide [32], maar zij zijn niet identiek. Het is opmerkelijk dat IHC met MAb 1G8 laat altijd positieve kleuring in het vasculaire endothelium, wat vrij ongebruikelijk als uitdrukking van MUC4 dat een van de leden van mucinen.

Zo evalueerden wij de specificiteit van de MAb 8G7 en Mab 1G8 door Western blotting en IHC van twee maagkanker cellijnen. Onze Western blotting analyse toonde aan dat MAb 8G7 herkende een zeer hoog gewicht eiwit moleculair (meer dan 500 kD, waarvan de verwachte grootte voor inheemse MUC4 was), terwijl MAb 1G8 geen immunoreactieve bands laten zien. De IHC-analyse toonde ook aan Mab 8G7 positieve kleuring maar Mab 1G8 negatieve kleuring in de twee maagkanker cellijnen. MUC4 mRNA werd eveneens tot expressie gebracht in de twee maagkanker cellijnen in deze studie, zoals in de eerdere studie over de pancreaskankercellijnen door RT-PCR en noordelijke blot analyse [33], [34]. Zowel MAb 8G7 en MAb 1G8 reageren met menselijke maagkanker weefsel, hoewel de locaties van MUC4 /8G7 en MUC4 /1G8 expressie vertoonde een duidelijk verschil. In maagkanker weefsels, werd MUC4 /8G7 vooral uitgedrukt in het cytoplasma van de neoplastische cellen van pap en bad, terwijl MUC4 /1G8 vooral werd uitgedrukt in de cel toppen van pap en bad of intracytoplasmatische mucine substantie van sig. Omdat de cytoplasmatische expressiepatroon van MUC4 /8G7 wordt ook in pancreas adenocarcinoom, intrahepatische cholangiocarcinoom, extra hepatische galwegen carcinoom, long adenocarcinoom en orale plaveiselcelcarcinoom [9], [10], [11], [12], [13 ], kan de intracytoplasmatische MUC4 /8G7 expressie patroon in maagkanker weefsels redelijk zijn. Daarentegen kan de lineaire expressiepatroon van MUC4 /1G8 met de cel toppen van maagkanker weefsels onbekende functies of eigenschappen van de MUC4β subeenheid gedetecteerd met MAb 1G8 tijdens opgewekt tegen rat epitoop [15], als het onderhavige onderzoek toonde aan dat MUC4 /1G8 expressie waren gerelateerd aan lymfatische invasie en lymfeklier dat slechte prognostische factoren zelfs in de vroege maagkanker. Name por2 en sig, de expressiesnelheid van MUC4 /1G8 was significant hoger dan die van MUC4 /8G7 of van MUC1 /DF3. Bovendien was er een correlatie tussen siginificant MUC4 /8G7 expressie en MUC4 /1G8 expressie in de onderzochte patiënten. Zo is de IHC signaal MUC4 /1G8 gedetecteerd in de monsters gastrectomie een significante betekenis van het gedetecteerd door MAb 1G8 epitoop vertonen, hoewel er geen reactiviteit van MUC4 /1G8 expressie in menselijke maagkanker cellijnen (SNU-16 en NCI- N87). De gedetecteerd door MAb 1G8 epitoop is een gebied van belang voor toekomstige studie.

Tot slot, in de huidige studie van de vroege maagkanker, MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 en MUC1 /DF3 uitdrukkingen werden voornamelijk in goed nageleefd gedifferentieerde adenocarcinomen. De MUC4 /8G7 expressie werd in verband met lymfatische invasie. De MUC4 /1G8 expressie werd in verband met lymfatische invasie en lymfeklieren metastase. De MUC1 /DF3 expressie was gerelateerd met lymfatische invasie en veneuze invasie. Het onderzoek van MUC4 en MUC1 expressie in de maag kankers zou een nuttige marker om slechte prognostische factoren die verband houden met schip invasie te voorspellen geworden, zelfs in de vroege fase.

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
in de niet-neoplastische slijmvlies van de gevallen maagkanker, werd MUC4 /8G7 soms uitgedrukt in het cytoplasma van oppervlakte slijm epitheel, en vaak maar zwak in het cytoplasma van fundic en pylorische klieren (A en D). MUC4 /1G8 werd vaak uitgedrukt in de cel cytoplasma en apex van het oppervlak slijmvlies epitheel, en vaak maar zwak in het cytoplasma van fundic en pylorische klieren (B en E), en was constant gezien op het vasculaire endotheel. MUC1 /DF3 werd soms uitgedrukt in het oppervlak slijmvlies epitheel, en altijd in de fundus-klieren (met name intensief op de mobiele toppen), maar niet in de pylorus klieren (C en F). Oorspronkelijke vergroting x 100 (A, B, C) × 400 (D, E, F)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0049251.s001
(TIF)
Tabel S1.
Gedetailleerde aantal en percentage positief lood neoplastische cellen met behulp van het scoresysteem
doi:. 10.1371 /journal.pone.0049251.s002
(DOC)

Dankwoord

we danken de heer Y. Atsuchi, de heer K. Matsuo, mevrouw C. Baba, mevrouw Y. Nishimura, mevrouw S. Yoshimura en mevrouw I. Houjou voor hun technische bijstand.

• PLoS ONE: hoge niveaus van aromatische aminozuren in maagsap tijdens de vroege stadia van maagkanker Progression
• PLoS ONE: CYP2E1 RsaI /PstI polymorfisme en maagkanker Gevoeligheid: Meta-analyses op basis van 24 case-control studies