Введение Кроме того, как мы знаем, что каждая аминокислота имеет свою гидрофобность стоимость, оригинальный дикого типа остаток и недавно введенный мутантный остаток отличается в этом свойстве. Для оценки этого мы использовали g_sas инструмент, вычисляющий гидрофобные, гидрофильные и общее SASA белка с течением времени. Мутант структура имеет большую SASA, которая коррелирует с нами ранее нахождения повышенной Rg в мутантной структуре (рис S4). Для того, чтобы проверить влияние Му на структуру MGMT состыковался с ДНК PDB ID: 1T39 [38], мы использовали Discovery студию, чтобы цвет и вычислить гидрофобность согласно Kyte-Дулиттл шкале (S5 рис). Массовый гидрофобность и пять остаток скользящее среднее значение гидрофобность были -0.8 и 0,94 соответственно, в то время как соответствующие значения для Mu остатка были значительно выше в 4,5 и 2, таким образом показывая, что мю остаток является более гидрофобным, чем остаток мас. Индексированного отклонение значений мутантного белка гидрофобности по отношению к белку вес может серьезным образом влиять на stiochiochemistry образования водородных связей между ферментом и ДНК, как это видно из рис S5. Впоследствии неблагоприятная стыковочный энзим-ДНК может привести к не-отзывчивости фермента по отношению к его совместной функциональности. Для дальнейшего понимания мутации на динамику белков, мы разделили важные аминокислоты, участвующие в физическом взаимодействии с ДНК и Mg + ионов в кластеры (рис 4) в зависимости от их положения и взносов в стыковке ДНК, основание листать и репарации ДНК [36]. Cluster1 содержала пять аминокислот, связанных в ДНК стыковочному а именно. SER93, PHE94, THR95, ASN123 и LYS125. Кластер 2 содержит одну аминокислоту ARG 135 также участвует в стыковке ДНК. Кластер 3 содержит три готовых аминокислот TYR114, GLN115 и SER151 где TYR 114 участвует в базовой листать, необходимых для восстановления ДНК, а две другие играют свою роль в стыковке ДНК. Кластер 4, кроме того, содержащая группе 3 аминокислоты, содержащиеся CYS145, который является активным сайт MGMT, ответственный за ремонт ДНК. Кластер 5 состоит из трех аминокислот (CYS24, HIS29 и HIS85), все из которых взаимодействуют с Mg + иона. g_rama инструмент был использован для создания PHI /пси двугранные комбинации выбранных кластеров и использовали для вычисления углов, как функция времени. Их контурный график был сгенерирован с использованием энергии минимумами для понимания их соответствующей мобильности (S6) Рис. Все выбранные группы были затронуты мутацией от SER151 к ILE151. Для того, чтобы понять эффект, в частности, на кластере 3 и 4, ПСИ /PHI распределения, связанные с меченым минимумам энергии были нанесены (рис 5). Разница в пиковом области минимумов энергии можно наблюдать в соответствующих весу и мю кластеров, давая отличительные впечатление возможного ремонта в неравенство ДНК несообразностей репарации ДНК и этиологии рака являются синонимами таким образом, что она является возникновение мутации, которая получила широкое признание в качестве основы рака. Мутация в ремонтной белка ДНК, которые могли бы нанести ущерб его функции (S7) Рис может создать pretumorigenic среду и может помочь в прогрессии рака на любой стадии. MGMT является одним из важных белков репарации ДНК играет существенную роль в поддержании стабильности генома путем удаления O 6Methyleguanine аддукты. Таким образом, значительный генетический полиморфизм в этом белке будет иметь влияние на развитие рака и его прогрессирование. Поскольку ни одно из исследований до настоящего времени не сообщалось мутационный анализ MGMT с помощью МДС, он в первую очередь побудило нас изучить возможности MGMT будучи мутировал в секретном популяции, где потребление продуктов, содержащих более высокие уровни N-нитрозосоединений является общим и желудка рак распространен. Материалы и методы исследования Этические утверждение протоколы /эксперименты, связанные с использованием человеческих образцов были должным образом рассмотрены и одобрены университетом Комитет по этике человек (UHEC), ВИТ университет, Веллор (UHEC-ВИТ /2011). Пациенты и коллекция тканей Выражение признательности
<р> Несмотря на то снижается, болезнь рака желудка, в соответствии с GOLOBOCON 2012. по-прежнему является третьей ведущей причиной смерти от рака во всем мире [1, 2]. В патогенезе этого заболевания, различные генетические и молекулярные изменения происходят что приводит к злокачественному перерождению слизистой оболочки желудка [3]. Это преобразование является многоэтапным процессом, который влечет за собой отклонения в важных клеточных функций, таких как репарации ДНК, адгезии, сигнальной трансдукции, дифференциации клеток и других [4,5]. Алкилирование канцерогены, как N-нитрозодиметиламин, метил-нитрозомочевины (НМУ), N-метил-N'-нитро-N-нитрогуанидина и т.д. приводят к образованию O 6-метилгуанин, ДНК-аддукт, чье присутствие приводит к индукции мутаций ( G: с-а: Т-переход) и приводит к развитию рака [6-10]. MGMT
является ферментом, ответственным за починки O 6-метилгуанин аддукты [11-13]. УПР является самоубийственным фермент, который удаляет метильную группу из О 6-й позиции в гуанина и передает его на свой собственный остаток цистина в кодоне 145 в белке, таким образом, инактивирующих себя при ремонте гуанин [14]. Под воздействием НМУ, MGMT-дефектных мышей наблюдали развитие рака [15], в то время, как трансгенные мыши, несущие дополнительные копии гена иностранного MGMT были менее склонны к этому заболеванию [16] .The, генетический полиморфизм этого фермента имеет доказала, что является потенциальным фактором риска развития рака [17-22]. Это исследование, таким образом, фокусируется на мутационный профилирования к ошибкам области экзона 5 MGMT, который кодирует для активного сайта белка, а именно активный участок окружен доменов, ответственных за ДНК, держась [13]. Представитель популяции больных раком желудка, который был выбран для данного исследования представляет собой уникальную когорту существенно высокой степени под воздействием пищевых алкилирующих агентов [6, 23-28].
<Р> Использование Insilico
методов для понимания влияния полиморфизма на белковой структуры и динамики была на практике, и множество работ было сделано в связи с этим [29-32]. Методы прогнозирования с использованием системы автоматизированного эволюционного и предсказание структуры на основе дает представление о повреждающего способности полиморфизма [33]. Молекулярной динамики можно использовать для наблюдения за конформационных изменений полиморфизм может нанести в белке. Эти конформационные изменения в трехмерной структуре белка может влиять на физиологические аффинности и различные биохимические реакции взаимодействия. Для изучения влияния мутаций на эволюционные, а также атомном уровне, Insilico предсказания с использованием различных серверов, а также МДС от дикого типа (WT) и мутантного (мю) MGMT белка был проведен. Для получения белковых траекторий МДС и анализа взаимодействия атомов, Gromacs использовались встроенные инструменты. Принцип анализа компонентов (РСА) проводили для оценки гибкости обеих структур. Свободная энергия ландшафтов (FEL) нативного и Му MGMT также были изучены, чтобы понять эффект мутации.
Результаты и обсуждение
<р> Экзон 5 сегмент гена MGMT, успешно амплифицировали из всех образцов , Ампликоны после секвенирования показал мутации в кодоне трансверсия 151AGC, последовательности которых были представлены номерами доступа GeneBank подшипников KM000795 и KM000796. В силикомарганца инструментов для изучения возможного повреждающего действия мутации были выбраны тщательно, так как каждый фактор заглянул и перепроверили другим инструментом, который использует другой алгоритм. Детали серверов, которые используются в нашем исследовании, описаны в таблице S1, где алгоритм, работая и критерии прогнозирования дается. Выбранный сервер предсказывает мутация быть разрушительными. Симуляции траектории РМР для запуска 30 нс для масс и мутантного белка анализировали с использованием широко Gromacs встроенные инструменты. S1 Рис показывает nsSNP в кодоне 151, что приводит к миссенс мутации от Ser до Ile, в противном случае в его форме дикого типа помогает во взаимодействиях белок-ДНК [34-36]. Как показано на фиг.1, wtMGMT (PDBID: 1T39). SER 151, к тому же делает нормальный электростатическое взаимодействие с тимина также образуются две водородные связи с этим с помощью амидного азота
<р> 2 изображает снимки обеих масс и мю структур через разные промежутки времени, предусматривающим краткий обзор влияния мутации на структурной динамики MGMT. От привязки снимков, структура Mu, кроме показательны расширил конформацию, также образованную спиральную конформацию с аминокислотным номером от 87 до 90, что дает представление о том, что мутация не способствует структурной компактности белка, который INTURN приводит к его скомпрометированной и аберрированного конформации имеющий значительный структурный сдвиг, который играет важнейшую роль в возникновении несуществующей функции белка [37]. После визуального анализа g_rms инструмент был использован для расчета RMSD для атомов белка, с использованием исходной структуре в качестве эталона. Мутант структура показала крутой подъем в СКО на уровне около 17 нс. При наблюдении аномалию на уровне структуры, мы обнаружили, что спиральную и рамочную содержание мутантного структуры варьировалась (Фиг.3А). RMSD от среднего значения с течением времени называется, как RMSF, g_rmsf использовали для расчета атомного стандартное отклонение и на наблюдении, структура Му показал более высокую гибкость. RMSF обеих структур показал небольшое изменение в остатке 151, но значительно варьируя в области белковой петли 27 до 53 (фиг.3В), которая может быть равнодействующая межмолекулярной вариации третичного дальнодействие. В r_rmsf инструмент опция-OQ был использован для преобразования значения RMSF в значения фактора В и неявное их на средней структуры (синий, представляющий наиболее стабильный и красный наиболее флуктуирующей). Сравнительный фактор В проекции (S2A рис) на вес и Му MGMT главным образом указывает на то вариации флуктуации в пределах средней структуры, что дает нам представление об изменении колеблющейся узора между двумя структурами. Картина окраски по умолчанию в диапазоне от синего до красного. Существенное изменение флуктуации наблюдается в структуре Mu, кроме которых средняя вторичная структура макета (S2B рис) значительно различались что опять-таки означает, что Му может быть невыгодным для восстановления ДНК.
<Р> Для анализа формы белка в каждой заданное время, g_ свернутый спиралью инструмент был использован, которая вычисляет радиус закругления группы атомов вдоль осей X, Y и оси, в зависимости от времени. Наши результаты демонстрируют большую отклонение радиусов инерции в структуре Му, после того, как прошло 17 нс запуска (S3 Рис). В то время как известно, что структура УПР не изменяется в значительной степени по сравнению со структурой УПР гранично-ДНК, что свидетельствует о стабильной связанной структуры посредством тесной ассоциации остатков распознавания (Ala126, Ala127, Ala129, Gly131 и Gly132) и Ser93, Thr95, Gln115, Asn123 и Ser151, взаимодействуя с остовом ДНК [36] однако, так как Radi инерции был записан быть увеличена за счет мутации и, следовательно, предлагая расширенную перевернутую структуру белка, предположительно неловко сдвигает палец аргинин (intrahelical позиционируется Arg128) от своей позиции, которая отвечает за содействие листать нуклеотидных в активный сайт MGMT, таким образом, может ухудшить усердие, необходимое для удаления O 6-метилгуанин аддукта из ДНК
. <Р> Для более глубокого понимания структурных различий, наблюдаемых до сих пор, мы смотрели в образование водородной связи внутри выбранных кластеров с использованием g_hband инструмента, результаты которого были показаны на рис 6. Все кластеры, выбранные для этого анализа показывают снижение среднего числа водородных связей на кадр в мутантной структуре ожидают кластера 1. увеличение в ряде средних водородных связей в кадре в кластере 1 является тонким по сравнению с изменениями, которые мы наблюдаем. Общее снижение среднего формирования водородных связей на кадр совместно связи с увеличением RMSF и Rg в мутантной структуре. В результате генерируется этим анализом убедительно влекущие за собой аномалию наблюдается до сих пор с изменением внутри шаблона водородной связи.
<Р> Чтобы понять влияние этой мутации на глобальных коррелированных движений в атомных имитаций, PCA, математический метод, который эффективным при характеристике общего складывания и складным особенности белка, был использован. Методика определяет доминирующие движения в белке путем извлечения основных режима, участвующих в движении, участвующих в молекуле. Основными компонентами движения белка рассчитывали, как собственные векторы (ЭВ) средства массовой взвешенной ковариационной матрицы атомов белка. Расчет этих величин проводили с использованием метода существенной динамики (ЭД) в соответствии со стандартным протоколом [39] в пределах доступного программного пакета GROMACS. Два из первых восьми Ev о том, что приходится более, что 85% движения всей системы были выбраны для анализа, проекция с течением времени и RMSF флуктуации которого изображена на рис 7. Оба Ev были объединены в одну траекторию; комбинация произвела общий набор основного компонента (ПК) для собственных векторов вес и Му MGMT, что делает возможным прямое сравнение между различными системами. Траектории были получены с использованием G-COVAR и G-anaeig из Gromacs коммунальных услуг. На фиг.8 (А) проекциях, PC 1 против PC 2, обеих структур проецируются (черный вес /красный Му), кластер, полученный из масс структура устойчива, где в качестве проекции первых двух ПК из мутанта охватывает большая площадь. Для дальнейшего анализа прогнозов ПК, их свободные энергетические поверхности были нанесены (фиг.8В), который показал, что стабильность масс по ходу однородна с течением времени по сравнению с Му основаны на минимумам энергии бассейнах, образованных обоими. Структуры с минимальной энергией были получены из свободной энергии в ландшафт разные моменты времени. Структуры на правой стороне каждого выступа на фиг.8 (С) ПК являются от начала моделирования в левое от ближнего конца моделирования. Этот анализ имеет решающее значение в выяснении скомпрометировавшую свободной энергии ландшафт структуры Му, наблюдение, что помимо подтверждающей с нашими предыдущими результатами, убедительно предполагало резкое конформационные изменения в структуре Му.
Вывод
<р> использование молекулярной динамики для изучения влияния новой мутации в кодоне 151 дал нам понимание архитектуры обеих структур на атомном уровне в течение пробега период 30 нс , Эффект мутации не ограничивается только ее окрестности, но и нагружается на общую структуру в том числе в различных местах белка вторичных элементов. Структурные переходы, наблюдаемые во вторичных элементов, способствует коллапс структурной архитектуры Му MGMT белка. ЛСЭ полученный квазигармоническом анализа (РСА) также пришли к выводу, что мутация существенно влияет на стабильность MGMT с течением времени, фактор, который может помешать нормальному стехиометрическое моду репарации ДНК с помощью MGMT.
<Р> исследовали мутации в экзоне 5-видимому, связано с мутацией водителя, который, кажется, влияет на взаимодействие ДНК /белок, что является важным фактором, который может повлиять ДНК стыковку, основание листать и в конечном итоге восстановить механизм, который в случае обесценения, также может привести к геномного широкому увеличению O 6 метиловые гуанин аддукты, приводящие к увеличению нестабильности генома.
<р> в общей сложности 30 пациентов с диагнозом рака желудка допущен к Шери-Kashmir институт медицинских наук (скользит), Шринагар были рассмотрены для изучения. Пациентов, перенесших операцию в качестве первичного лечения на разных стадиях заболевания были набраны для исследования с их согласия. Характеристики исследуемых пациентов приведены в таблице S2.
<Р> Образцы Опухолевые 5мм 3 вырезали из хирургически удаленных образцов в массе опухоли, за исключением края. Прилегающие неопухолевых образцы аналогичной размерности были взяты из края резекции, приблизительно 10 мм от края макроскопического опухоли и впоследствии были подтверждены как доброкачественные рутинным гистопатологией на скользит. В общей сложности 30 опухолей и 30 образцов нормальной ткани собирали и хранили при -80 ° C до проведения анализа.
Выделение ДНК и полимеразной цепной реакции
<р> ДНК экстрагировали из 2 мм 3 образцов тканей с использованием набора для экстракции ДНК (Привет Pura млекопитающим геномную ДНК Изоляция Kit-HiMedia). Концентрация и качество ДНК измеряли с помощью рутинного spectrophotometeric анализа. Амплификацию экзона 5 областей MGMT экзон, был проведен в градиенте minicycler (Eppendorf) в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл (400ng /мкл) геномной ДНК, ДНК-полимераза {1X ПЦР-буфера (200 мМ Трис-HCl, 200мм KCl, 50 мМ, (NH 4) 2 SO 4) поставляется с 25 мМ MgCl2, Fermentas}, нуклеазы свободной воды и 1 мкл вперед (5'- GCCCGTGCAGGTACGGTCTT-3 ') и обратный (5'- AGCTCCCGCTCCCTTGAGCC-3') праймеров каждый. Температура отжига была оптимизирована при 65,5 ° С. Для облегчения полимеразной цепной реакции (ПЦР) анализ продукта для мутации, ПЦР секвенирование продукта осуществляли.
СНП Повреждение Предсказание.
<Р> Предсказание повреждение polymorphisim проводили с использованием SIFT [40] , Polyphen-2 [41], PhD-SNP [42], MutPred [43], SNAP [44], ОНП &Amp; Go [45] и PoPMuSiC [46].
Молекулярно-динамическое моделирование
<р> исследования МДС были выполнены Gromacs 4.5.3 пакета [47]. Для вес MGMT, структура ПДБ 1QNT [48] была использована в качестве исходной структуре МДС. Accelrys Открытие студии [49] был использован, чтобы сделать единственную мутацию точку на структуре дикого типа. И, вес и Му MGMT были применены с GROMOS96 43a1 силовое поле, а затем помещают в модель предварительно уравновешенную водяную баню и противоионов были добавлены для достижения нейтральной коробку с помощью "genion" инструмент, который поставляется вместе с пакетом Gromacs. Молекулы растворителя выдерживались в исходное положение с усилием ограничит от 100 ккал /моль на 5000 шагов, прежде чем быть подвергнутым минимизации энергии за 5000 итераций. Для регулирования температуры внутри корпуса, был использован метод Берендсен температуры муфты [50]. Электростатические взаимодействия были вычислены с использованием метода частиц сетки Эвальда [51]. Ионизирующее состояние остатков, давление и другие параметры были установлены в стандартном диапазоне. Несвязанные список пар был обновлен после того, как через каждые 10 шагов и конформации хранились каждые 2 пико секунды (PS). Позиция удерживающая моделирования для 500 пс был реализован, чтобы молекулы растворителя, чтобы войти в область полости структуры. И, наконец, система была подвергнута МДС в течение 30 наносекунд (нс). Среднеквадратичное отклонение (СКО), среднеквадратичная флуктуация (RMSF), доступных для растворителя Surface Area (SASA), Радиус вращения (Rg) и РСА были проведены с помощью встроенные Gromacs инструментов. g_hbond использовали для вычисления количества различных водородных связей, образованных конкретными остатками в другие аминокислоты в белке при моделировании (NH связь). g_sham широко используется для получения свободной энергии ландшафта. Графики были построены с использованием Грейс GUI Toolkit 5.1.22 версии в то время как свободные энергетические ландшафты были построены с использованием GNUPLOT 4.6.0 версии. Все визуализации проводились с использованием PyMOL, Ligplus, VMD [52] и графики были построены с использованием Грейс программе [53] и GNUPLOT. Траектории были проанализированы с помощью встроенного инструмента в распределении GROMACS.
Поддержка Информация
S1 Рис. а) представитель хроматограмма MGMT экзона 5, показывающий единственную пару оснований, G &Гт. Т в положении 151, как показано стрелкой на опухолевый хроматограмме
б) Выравнивание экзон 5 последовательности, амплифицировали из неопластических и неопухолевых ткань (смежный нормальная) с этим дикого типа (Референс-последовательность приобрела у NCBI) был переведен и SNP сопоставляются было показано, изменить серин в изолейцин
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0127741.s001
(TIF)
S2 рис. (А) Средние третичные структуры окрашены в соответствии со значениями Bfactor (б) Среднее Вторичная структура представления обеих структур
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0127741.s002
(TIF)
S3 Рис. (А) Радиусы инерции масс и Му MGMT показаны отдельно
. <Р> (б) Rg всех атомов и вес Му MGMT в зависимости от времени при 300К.
Вес является represted Черным и Му Грином.
DOI: 10.1371 /journal.pone.0127741.s003
(TIF)
S4 рис. Растворитель Доступная площадь поверхности вес (черный) и Му (зеленый) MGMT с течением времени при 300К
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0127741.s004
(TIF)
S5 Рис. Различия в цвете (Поверхность белка согласно Кайта-Дулиттл шкале) на мутировавшего области и графическое представление изменения в Kyte-Дулитл в масштабе одной аминокислоты и пять средней проточной гидрофобность как вес и Му MGMT
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0127741.s005
(TIF)
S6 рис. Время зависит Рамачандрану контурный график всех выбранных кластеров с течением времени, каждая строка, показывающая переход 1.
DOI: 10.1371 /journal.pone.0127741.s006
(TIF)
S7 Рис. Наглядного представления GC: при переходе по ослабленным MGMT
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0127741.s007
(TIF)
S1 Таблица. Полиморфизм Прогнозирование с использованием различных серверов
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0127741.s008
(DOCX)
S2 Таблица. Характеристики субъектов исследования
DOI: 10.1371. /Journal.pone.0127741.s009
(DOCX)
<р> Авторы хотели бы выразить благодарность доктору Даниеле Граната за его вид на входы свободных энергетических ландшафтов.
Алкоголь повреждает микробиом во рту
Ученые разрабатывают подход к вакцинации от воспаления кишечника
Создание физической и генетической карты Cannabis sativa
Общий генетический вариант объясняет, почему иммунотерапия часто не помогает при болезни Крона.
Люди с симптомами СРК могут иметь низкий уровень витамина D,
Фастфуд может быть главной причиной подростковой депрессии
Отметка потенциальных молекулярных предикторов ответа на биологическую терапию при язвенном колите
Некоторые люди, страдающие заболеваниями кишечника, такими как язвенный колит, не реагируют на традиционно используемые биологические методы лечения. В таких случаях, персонализированный прогноз терап
Распространение супербактерии E. coli из-за плохой гигиены туалета,
не через еду Новое исследование опубликовано в Ланцетные инфекционные болезни 22 октября, 2019, говорит, что одна распространенная супербактерия вызывает более 5, 000 случаев пищевого отравления в А
Исследования смотрят на аэробиомы,
деревья и последствия для общественного здравоохранения Микроорганизмы окружающей среды играют важную роль в здоровье человека - разнообразный консорциум, лучше. Разнообразие микроорганизмов помогает