Введение
<р> Галектин-9 (Гал-9) индуцирует адгезию и агрегацию определенных типов клеток и ингибирует метастазирование опухолевых клеток. Т-клеточный иммуноглобулин и муцина домен-3-содержащие молекулы, 3 (ТИМ-3) играет ключевую роль в иммунной регуляции. Целью данного исследования является изучение Гал-9 и TIM-3 изменения в раке желудка и их прогностическое значение.
Полученные результаты позволяют предположить, что экспрессия Gal-9 и Tim-3 в опухолевых клетках может быть потенциальным, независимым прогностическим фактором для больных раком желудка. Гал-9 и ТИМ-3 могут играть важную роль в канцерогенезе желудка
<р> Образец цитирования:. Цзян J, Jin M-S, F-Конг, Цао D, Ма H-X, Z Цзя и др. (2013) Снижение Galectin-9 и Увеличенный Tim-3 Expression связаны с плохим прогнозом рака желудка. PLoS ONE 8 (12): e81799. DOI: 10.1371 /journal.pone.0081799
<р> Редактор: Пьер Busson, Институт онкология Гюстава Русси, Франция
<р> Поступило: 6 января 2013 года; Принято: 26 октября 2013 года; Опубликовано: 10 декабря 2013
<р> Copyright: © 2013 Цзян и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
Финансирование:. Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (81072369 и 81273065). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> рак желудка остается четвертым наиболее часто диагностировали рак и является второй ведущей причиной смерти от рака во всем мире, связанных с [1]. Galectins представляют собой группу белков, которые связываются бета-галактозиды через эволюционно консервативными элементов последовательности домена распознавания углеводов (CRD) [2], [3]. Семейство галектин способствует малигнизации, выживаемости опухолевых клеток, тканевой инвазии и метастазирования нескольких типов рака, включая рак желудка [4]. Предыдущие исследования показали, что уровень экспрессии галектина-3 была значительно выше в желудочных карцином по сравнению с нормальной тканью. Галектин-3 и галектин-4 могут быть полезными опухолевые маркеры для рака желудка по отношению к опухолевой прогрессии и потенцией узла метастазировании лимфатического особенно в некоторых гистологических типов рака желудка [5], [6]. Galectin-9 (Гал-9) является новым членом семейства белков галектин [7]. В последние годы важная роль стала для Гал-9 в отношении здоровья и болезни [8]. В нормальной физиологии, Гал-9, как представляется, стержневую модулятор Т-клеточного звена иммунитета путем индукции апоптоза специфических субпопуляций Т-клеток. Поскольку эти популяции Т-клеток связаны с аутоиммунным воспалительным заболеванием, и отторжения трансплантата, было выдвинуто предположение, что применение экзогенного Гал-9 может ограничить патогенную активность Т-клеток [9], [10]. Кроме того, Гал-9 локализован в цитоплазме и на поверхности клеток клеток и, как представляется, высвобождается из опухолевых клеток [11]. В солидных опухолей, имеющиеся исследования позволяют предположить, что Gal-9 имеет функцию опухолевого супрессора, с потерей Гал-9 тесно связано с повышенной метастазирования и высокой повторяемостью [12], [13], [14], [15]. Кадоваки и др также показали, что Гал-9 передачи сигналов может продлить выживание путем индукции макрофаги дифференцироваться в плазмоцитов дендритных клеток типа макрофагов в мышиной модели рака легкого-[16]. Эти Данные представлены, что Гал-9 может быть возможным прогностическим фактором с анти-метастатическим потенциалом. Тем не менее, выражение Гал-9 еще не был исследован в рак желудка.
<Р> Т-клеток immunoglobulin- и муцина домен-3-содержащие молекулы, 3 (Tim-3) является Т-хелперов типа 1 (Th1) -специфический молекула клеточной поверхности, которая, кажется, регулируют Th1 ответы и индукции периферической толерантности [17], [18]. В последнее время аберрантное выражение Tim-3 было сообщено в клетках меланомы, что способствует низкой способности адгезии опухолевых клеток и способствуя выживанию опухоли [19]. Чжуан и др также продемонстрировали значительную роль экспрессии Tim-3 в опухолевых клетках как независимый прогностический фактор для пациентов с немелкоклеточного рака легкого [20]. Чжу C и др показали, что Gal-9 является Tim-3 лиганд, и предположил, что Тим-3-Гал-9 путь, возможно, развились, чтобы обеспечить эффективное прекращение эффекторных Th1 клеток [21]. Для того, чтобы исследовать отношения между Tim-3-Gal-9 пути и прогресс рака желудка, экспрессия белка Gal-9 и Тим-3 был исследован у 305 пациентов с раком желудка, из которых 84 случаев были парными соседних образцов нормальной ткани. Ассоциации экспрессии белка с клиническими характеристиками пациента и прогноза также были изучены в данном исследовании.
популяциями исследования
<р> Триста пять пациентов в том числе 231 мужчин и 74 женщин с раком желудка, который перенес операцию в период с августа 2000 года по декабрь 2010 года в первой больнице университета Цзилинь были включены в данное исследование. Пациенты не получали никакого лечения перед хирургической операцией. Диагноз рака желудка был сделан на основе морфологического и иммуногистохимического результатов оценивали с помощью двух независимых патологоанатомов (MSJ и YPW). Рака желудка были удалены хирургическим путем иссечения; соседние нормальные эпителиальные желудка образцы были собраны из 84 пациентов, для сравнения. возраст пациентов колебался от 32 до 87 лет, средний возраст 64 лет. Письменное информированное согласие было получено от всех пациентов и протокол исследования был одобрен этическим комитетом Первой больницы Цзилинь университета.
Для того, чтобы подтвердить достоверность полу-количественной оценки иммунологическими гистологии, Вестерн-блоттинга вводили в желудочном раковых клеточных линиях. Клетки лизируют с холодным буфером для лизиса и центрифугировали при 12000 г в течение 10 мин, загрузка буфера смешивают с клеточных лизатов и кипятят в течение 5 мин при температуре 95 ° C. 10 мкг общего белка загружали в 10% разрывной полиакриламидном геле SDS для электрофореза, а затем переносили на поливинилиденфторида мембраны. Мембраны блокировали в 5% бычьего сывороточного альбумина и инкубировали с первичными антителами (анти Гал-9 и анти Тим-3) в течение ночи при 4 ° C в Трис-буферном растворе с 0,1% Tween 20. После промывки мембраны инкубировали в конъюгированного с пероксидазой хрена антителами в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембраны затем инкубируют и вестерн-блоттинга изображения были взяты и проанализированы. β-актин был использован в качестве внутреннего контроля и все денситометрические значения были нормализованы по отношению к относительной бета-актина значение.
Определение H.pylor Статистика Выражение Gal-9 и Тим-3 при раке желудка и желудочных линий раковых клеток Сочетание Гал-9 и Тим-3 выражение было независимым прогностическим маркером в этом исследовании, более высокие выражения Гал-9 были обнаружены у пациентов без лимфатического-сосудистой инвазии, метастазов в лимфатических узлах и отдаленных метастазов. Кроме того, более высокие выражения Гал-9 тесно связана с лучшей выживаемостью. Эти данные согласуются с результатами предыдущего отчета при раке молочной железы, гепатоцеллюлярной карциномы, рака шейки матки и злокачественной меланомы [12], [13], [14], [15], [22]. Гал-9 выражение в желудочных поражений раком была значительно выше, чем в спаренных соседних нормальных желудочных эпителиальных тканей, этот результат привел нас к предположению, что активность Гал-9 демонстрируют противоопухолевое в несущих опухоль тканей через incresed агрегации опухолевых клеток [23] , Тем не менее, этот вывод отличается от замечаний Ляна. Они обнаружили, что Гал-9 экспрессии в раковых тканях 38 инвазивный рак шейки плоскоклеточный рак (SCC) пациентов был значительно ниже, чем в нормальной шейки матки эпителием из 23 здоровых людей. Но Гал-9 выражения в хорошо дифференцированный SCC были значительными выше по сравнению с теми, в высокой сквамозных intrapiehelial поражений [14]. К сожалению, они не сравнивали экспрессию Gal-9 в раковых тканях к парным соседних нормальных тканей. Расхождение различных исследований может быть из-за индивидуальных различий иммунного статуса, вызывает воспаления и тканевой специфичности экспрессии Гал-9. Кроме того, различные заболевания чувствительны к апоптотической уничножения рекомбинантного Gal-9. В соответствии с этим наблюдением, предполагая, что Gal-9 может быть привлекательным кандидатом для лечения рака. Лечение с помощью рекомбинантного Gal-9 может предотвратить метастатического распространения рака [16], [24], [25]. В заключение, данное исследование продемонстрировало экспрессию Gal-9 и Тим-3 при раке желудка. Важно отметить, что многомерные анализы показали существенную роль Gal-9 и Тим-3 в качестве независимого прогностического фактора для больных раком желудка. Таким образом, статус Гал-9 и Тим-3 может быть определено при клиническом обследовании и может иметь значение лечения в будущем [38], [39].
я инфекция
<р> Среди 305 желудка случаев рака, брали образцы крови из 104 пациентов для обследования H.pylor
я инфекции перед хирургической операцией. 4 мл натощак образцов крови оставляли при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем центрифугировали. Сыворотка была разработана и хранили при -80 ° С. Сывороточных иммуноглобулинов (Ig) G антитела к H.pylori
были обнаружены H.pylor
I-IgG иммуноферментного анализа (ELISA) комплект (Biohit, Helsink, Финляндия). Титры антител определяли по оптической плотности (OD) значения в соответствии с протоколом производителя и титрами выше, чем отрезанный значение 30EIU рассматривались как положительные для h.pylori
инфекции. Образцы контроля качества набора показал коэффициент вариации 4,5% для H
. пилори
инфекция исследование.
Анализ
<р> HSCORE из gal- выражение 9 и Тим-3 представлены как медиана (межквартильный). Уилкоксона совпадающая-пар испытаний подписали ранга и тест Манна-Уитни U или тест Крускала-Уоллиса H были использованы при сравнении парных групп и две независимые группы, соответственно. Метод Каплана-Мейера использовали для оценки общей выживаемости, а также различия выживаемости были проанализированы с помощью лог-рангового теста. Модели пропорциональных рисков Кокса использовался для расчета относительных рисков (РРП) и соответствующие 95% доверительные интервалы (95% ДИ) после корректировки по возрасту (масштаб переменной), пол (номинальная переменная), лимфы-сосудистая инвазия (номинальная переменная) и TNM постановка (переменная шкала). Все статистические тесты были двусторонними и P
-значения менее 0,05 считались статистически значимыми. Все анализы были выполнены с использованием программного пакета SPSS 18.0 (SPSS Inc. USA).
Результаты
<р> Иммуногистохимическое анализ показал, что Gal-9 и Тим-3 положительно окрашенных на опухолевых клетках в 86,2% (263/305), 60,0% (183/305) пациентов с раком желудка, соответственно. Большинство раковых клеток в ткани рака желудка показали мощный цитоплазматический Гал-9 иммунное окрашивание, но небольшое количество клеток рака желудка показали отрицательную иммуногистохимическое Гал-9 (рис. 1A, 1B, 1C). Желудочный опухолевые клетки показали четкую цитоплазматической и ядерной позитивности для Tim-3 иммуноокрашивания (рис. 1D, 1E, 1F, 1G).
<Р> Среди 84 парных образцов, Гал-9 положительное окрашивание было обнаружено в 68/84 ( 81,0%) и рак желудка в базальных клетках 51/84 (60,7%) нормальной слизистой оболочки, соответственно ( P
= 0,004). С другой стороны, Tim-3 положительное окрашивание было обнаружено 55/84 (65,5%) при раке желудка и 72/84 (82,7%) в нормальной слизистой оболочке, соответственно ( P
= 0,002). Кроме того, клеточные линии SGC-7901, КУП-823and MGC-803 и ГЭС-1 показал слабую цитоплазматический Gal-9 иммуноокрашивания (рис. 1H), но MKN45 показал отрицательную иммуногистохимическое Гал-9 (рис. 1I). Четыре желудка клеточные линии рака также показали сильную цитоплазматической и ядерной позитивности для Tim-3 окрашивания (рис. 1J). Тем не менее, ГЭС-1 клетки показали отрицательное окрашивание на Tim-3 (Figure.1K).
<Р> Обнаружение Gal-9 и активации Tim-3 была подтверждена из тех же клеток, с помощью Вестерн-блоттинга, который показан в Рисунок 2.
<р> Гал-9 выражение в раковых поражений была значительно выше, чем в нормальной слизистой оболочке (медиана HSCORE: 140 против 20; P
&л; 0,001 Рисунок 3A.). Tim-3 HSCORE в раковых поражений была значительно ниже, чем в нормальной слизистой оболочке (медиана HSCORE: 40 против 170; P
&л; 0,001 Рисунок 3B.)
Гал-9 и Tim-. 3 уровни экспрессии и H.pylor
я инфекция
<р> из 104 больных раком желудка, прошедших тестирование на H.pylor
я антитела, общий положительный темп H. pylor
я инфекция была 65,4%. При анализе возрастной подгруппе H.pylor
я зараженность была выше в группе 45-65 лет, по сравнению с моложе 45 лет групп или старше 65 лет групп. Результаты не показали никакой корреляции между H.pylor
Я заражением и Гал-9 и Тим-3 выражения ( P
= 0,102, P
= 0,565). (Рисунок 3C, 3D).
Корреляция экспрессии Gal-9 и Тим-3 с клиникопатологическими параметрами
<р> Как показано в таблице 1, HSCORE Тим-3 был значительно выше у пациентов мужского пола, чем пациентов женского пола ( P
= 0,010). Уровни экспрессии Tim-3 были положительно коррелирует с возрастом ( P
= 0,004), однако уровни экспрессии Gal-9 отрицательно коррелировали с возрастом ( P
= 0,049). Были существенные различия в уровнях экспрессии Gal-9 и Тим-3 среди подгрупп венозной инфильтрации, у больных с венозным инфильтрации, медиана HSCORE Гал-9 был значительным ниже ( P
= 0,034) и Tim- 3 было существенным выше ( P
&л; 0,001). В соответствии с этапами TNM, выше HSCORE наблюдалось у пациентов стадии I опухоли по сравнению с другими стадиями ( P
= 0,043). Значительно выше HSCORE Гал-9 была обнаружена у больных без метастазов в лимфатических узлах ( P
= 0,009), а также у пациентов без отдаленных метастазов ( P
= 0,022). Мы также проанализировали экспрессию Gal-9 и Тим-3 в соответствии с опухолевой дифференцировки (высокий, средний и низкий) и глубиной инвазии (T1-T4), не было обнаружено никаких существенных различий. Клинические характеристики испытуемых приведены в таблице 1 в деталях.
High Gal-9 Выражение и отрицательное выражение Tim-3 были значительно связаны с длительным общей выживаемости
<р> Последующая информация была доступна для все 305 пациентов, охватывающих период от 3 до 135 месяцев (в среднем 40 месяцев). Ни один пациент не умер от послеоперационных осложнений в течение 30 дней с момента начала периода исследования, и 120 (39,3%) пациентов умерли во время наблюдения. Кривые выживаемости Каплана-Мейера были построены в соответствии с HSCORE (отрицательный, HSCORE≤100, HSCORE≤200 и HSCORE &GТ; 200). Общая выживаемость была значительно выше в Гал-9 HSCORE > 200 группы по сравнению с другими группами (тест Log-Rank, P
= 0,011). Поскольку кривые выживаемости отрицательной группы, группы HSCORE≤100 и группы HSCORE≤200 были похожи, мы объединили их для дальнейшего анализа, а кривая выживаемости Каплана-Мейера были показаны в Figure.4A ( P
= 0,002). Пациенты с Tim-3-негативных опухолей имели более общую выживаемость. Те же результаты были получены при всех положительных пациентов экспрессии были объединены (Figure.4B, лог-ранговый тест, P
= 0,01). Кривые выживаемости Каплана-Мейера были также построены в соответствии с Гал-9 и Тим-3 коэкспрессией, общей выживаемости пациентов, которые были Gal-9 HSCORE &GТ; 200 и Тим-3 негативных был значительно выше, а также пациенты, которые были Gal -9 HSCORE≤200 и Тим-3 положительно был значительно ниже (Figure.4C, лог-ранговый тест, P
&л; 0,001).
<р> Таблица 2 показал многомерный анализ факторов, связанных с прогнозом пациента. Однофакторный анализ показал, что следующие факторы были значимо связаны с послеоперационной выживаемости: TNM стадии, венозного инфильтрации и комбинации Gal-9 и выражения Tim-3 ( P
&л; 0,001, P
= 0,001, P
&л; 0,001 соответственно). После того, как регулируется по возрасту и полу, многофакторный регрессионный анализ показал, что Gal-9 и коэкспрессией и TNM стадии 3-Тим были независимыми прогностическими факторами, но лимфа-сосудистой инвазии не был независимым прогностическим фактором.
Обсуждение
<Р> Tim-3 представляет собой молекулу поверхность, которая может специфически идентифицировать клетки Th1 от Тh2-клеток у мышей и люди [26]. Кроме того, было обнаружено на цитотоксических CD8 + Т-клеток, Th17, Трег, моноциты, дендритные клетки, тучные клетки, естественные клетки-киллеры (NK) клетки, меланома, SCC и клеток рака легких [19], [20], [27], [ ,,,0],28], [29], [30]. Здесь, в первый раз, мы продемонстрировали, выражение Тим-3 в желудочном раковых клеток и клеточных линий. Кроме того, мы обнаружили существенную корреляцию между экспрессией Tim-3 в раковых клетках и клинико-патологическая параметров лимфатического-сосудистой инвазии. Кроме того, мы обнаружили, что уровень выживаемости пациентов с положительными экспрессирующих опухолей Тим-3 был значительно ниже, чем те, с отрицательным выражением Tim-3. Одномерного и многомерного анализа также показали, что Тим-3 гиперэкспрессия в опухолевых клетках, связанных с плохим прогнозом развития рака желудка.
<Р> Tim-3 представляет собой мощный immunoinhibitory молекула участвует в иммунной толерантности и аутоиммунных реакций. Механизмы регуляции экспрессии Tim-3 в опухолевых клетках еще до конца не изучены. Винера и др сообщали, что TGF-β1 повышен Tim-3 выражение, которое привело к локальной иммуносупрессии [19]. В то же время, высокие уровни опухоли TGF- 1 были в значительной степени связано со снижением выживаемости больных раком желудка. Предыдущие исследования выявили Tim-3 в качестве отрицательного регулятора Т-хелперов 1-клеток ответов [26]. В последнее время, однако, новые исследования показывают, что Тим-3 может также способствовать про-воспалительный ответ, указывая, что Тим-3 имеет двойную роль в иммунитете [31], [32]. Таким образом, уровни экспрессии Tim-3 в раковых клетках, могут объединяться с цитокин производства в процессе канцерогенеза желудка. Кроме того, недавние исследования выявили, что Тим-3 избыточная экспрессия была связана с более короткой общей выживаемости эпителиального рака, включая рак легких и рак шейки матки [20], [30], наши данные согласуются с этими отчетами. Что еще более важно, чем все эти выводы, Цао и др подтвердили, что вниз регуляции экспрессии Tim-3 в клетках Hela значительно подавлял миграцию и инвазию клеток Hela [30]. Эти результаты свидетельствуют о том, что Тим-3 не только подавляет противоопухолевый иммунитет, но и непосредственно способствовать прогрессу рака.
<Р> Идентификация Gal-9 в качестве лиганда для Tim-3 в настоящее время твердо установлено Tim-3-Gal -9 путь в качестве важного регулятора Th1 иммунитета, что приводит к апоптозу Th1 клеток [21], [33]. В этом исследовании мы обнаружили, что оба выше Гал-9 выражение и отрицательное выражение Tim-3 были в значительной степени связано с улучшением общей выживаемости ( P
= 0,002, P
= 0,010, соответственно); сочетание экспрессии Gal-9 и Тим-3 был независимым прогностическим маркером при раке желудка. Эти результаты указывают на то, что Тим-3-Гал-9 путь может играть важную роль в желудочном канцерогенезе.
<Р> Кроме того, H.pylori
является группа 1 канцероген основана на Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) и Международного агентства по изучению рака (IARC) [34]. Было принято считать, что рак желудка является многоступенчатый процесс, включающий ряд мероприятий, таких как атрофический гастрит, кишечная метаплазия, дисплазии и карциномы. В предыдущих докладах отмечалось, что взаимодействие Тим-3-Гал-9 может иметь заметное влияние на воспалительный [26], [35], [36], [37]. Мы также исследовали, является ли <ЕМ> h.pylori
инфекция может влиять уровни экспрессии Gal-9 и Тим-3. Тем не менее, в данном исследовании, уровни Гал-9 и Тим-3 экспрессии статистически не отличались между h.pylori
(+) группы и h.pylori
(-) группы при раке желудка ( P
= 0,101, P
= 0,565). Дальнейшие исследования с additionalsamples необходимы для установления роли Гал-9 и Тим-3 в h.pylori
-infection.
Выражение признательности
<р> Авторы хотел бы поблагодарить доктора Дженнифер С. Дэвис, г-н Чанг-Го Сун и г-жу Ин Песня для их технической поддержки.
Исследователи нашли новый способ защиты от болезней в модели рассеянного склероза.
Нездоровый микробиом кишечника снижает синаптическую обрезку мозга,
Кормить домашних животных сырой пищей безопасно,
Инфликсимаб может снизить эффективность некоторых вакцин против COVID-19
Клещи теперь переносят множество болезней,
Ультрафиолетовый свет B полезен для кишечного микробиома
Вперед, продолжать,
Ешьте камеру - капсульная эндоскопия Всякий раз, когда ловят большую белую акулу и думают, что она стоит за нападением, у рыбы разрезают живот. Из желудка обычно выходит всякая ерунда, включая кучу ц
Новый метод компьютерного моделирования предсказывает, как микробы кишечника меняются с течением времени
Новый метод компьютерного моделирования использует снимки типов микробов, обнаруженных в кишечнике человека, чтобы предсказать, как сообщество микробов изменится с течением времени. Инструмент, разраб
Ученые извлекли полный геном человека из «жевательной резинки» возрастом тысячи лет.
Кажется, жевательная резинка - не новый тренд! Исследователи обнаружили, что у жевательной резинки 5, Ему 700 лет, и он дал ключи к разгадке древней ДНК. Результаты исследования опубликованы в журнале