PLoS ONE: High-Mobility Group Box 1 Ингибирует Язва желудка Исцеление через Toll-подобный рецептор 4 и приемное гнездо для продвинутых Гликация конечных продуктов

Абстрактный
<р> группы с высокой подвижностью 1 (HMGB1) первоначально был обнаружен как ядерный белок, который взаимодействует с ДНК в качестве ассоциированных с хроматином НЕГИСТОНОВЫХ белка для стабилизации нуклеосом и регулировать транскрипцию многих генов в ядре. После того, как утечка или активно секретируется во внеклеточную среду, HMGB1 активирует воспалительные процессы, стимулируя несколько рецепторов, включая Toll-подобный рецептор (TLR) 2, TLR4, и рецептор для передовых конечных продуктов гликирования (RAGE), что приводит к повреждению ткани. Хотя способность HMGB1, чтобы вызвать воспаление были хорошо документированы, никакие исследования не исследовали роль HMGB1 в заживлении ран в желудочно-кишечном поле. Цель данного исследования состояла в том, чтобы оценить роль HMGB1 и его рецепторов в заживлении язв желудка. Мы также исследовали, какой рецептор среди TLR2, TLR4, или RAGE опосредует эффекты HMGB1 о заживлении язвы. Язвы желудка индуцировали серозный применением уксусной кислоты у мышей, и желудочному ткани были обработаны для дальнейшей оценки. Индукция язвы увеличили иммуногистохимическое окрашивание цитоплазмы HMGB1 и повышенные уровни сывороточного HMGB1. размер Язва, активность миелопероксидазы (МРО), и экспрессию фактора некроза опухоли альфа (ФНО) мРНК достигло максимума на 4 день внутрибрюшинного введения HMGB1 с задержкой заживления язвы и повышенной активности MPO и экспрессию ФНО. В противоположность этому, введение анти-HMGB1 антител способствует заживлению язвы и снижение активности MPO и экспрессию ФНО. TLR4 и дефицит RAGE усиливается заживление язвы и снижает уровень ФНО, в то время как заживление язвы в TLR2 нокаута (KO) мышей был таким же, у мышей дикого типа. У мышей TLR4 КО и RAGE KO, экзогенный HMGB1 не влияет на заживление язв и экспрессию ФНО. Таким образом, мы показали, что HMGB1 является осложняющим фактором в желудочном процессе заживления язвы, которая действует через TLR4 и RAGE, чтобы вызвать чрезмерные воспалительные реакции.
<р> Цитирование: Nadatani Y, Ватанабе T, Tanigawa T, Ohkawa F, Такеда S, Higashimori A, и др. (2013) High-Mobility Group Box 1 Ингибирует Язва желудка исцеление через Toll-подобный рецептор 4 и приемное гнездо для Advanced Гликация конечных продуктов. PLoS ONE 8 (11): e80130. DOI: 10.1371 /journal.pone.0080130
<р> Редактор: Mathias Chamaillard, INSERM, Франция
<р> Поступило: 29 мая 2013 года; Принято: 30 сентября, 2013 года; Опубликовано: 11 ноября 2013
<р> Copyright: © 2013 Nadatani и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Авторы не имеют никакой поддержки или финансирования сообщать
<р> Конкурирующие интересы:. Кэндзи Ватанабэ - /поддержка исследовательских грантов от Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation, Abbott Japan Co., LTD .; Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation; Говоря и обучение: Abbott Japan Co., LTD. Ясухиро Фудзивара - разговорной речи и обучения: Eisai Co. Ltd Тэцуо Аракава - консультативных комитетов или Обзор панели: Eisai Co. Ltd, Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd. Другие авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов. Это не меняет приверженность авторов на всех политик PLoS ONE на данных и материалов общего доступа.

Введение
<р> Высокая подвижность группы коробка белок 1 (HMGB1), членом высоко- группа мобильности белка надсемейство, является ядерный белок [1]. HMGB1 взаимодействует с ДНК в качестве ассоциированных с хроматином негистоновых белка для стабилизации нуклеосом и регулировать транскрипцию многих генов в ядре [2]. Когда утечка из клетки во время некротической смерти клетки [3] или активно секретируется во внеклеточную среду моноцитами и макрофагами [3,4], HMGB1 действует как alarmin с мощными провоспалительными свойствами [5].
<р> Наиболее изучены HMGB1 рецепторы Toll-подобный рецептор (TLR) 2 [6,7], TLR 4 [6-9], и рецептор для продвинутых конечных продуктов гликолиза (RAGE) [6,8]. TLR2 и TLR4 являются членами семьи TLR, и они играют решающую роль в врожденного иммунного ответа на патоген-ассоциированных молекулярных моделей и молекул повреждения ассоциированных молекул модели [10]. TLR2 прежде всего распознает компоненты грамположительной стенки бактериальной клетки, в первую очередь и TLR4 распознает липополисахарида, который является основным компонентом клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Срабатывание TLR2 и TLR4 сигнальных путей ведет к активации ядерного фактора кВ (NF-кВ), через аксессуар белка MyD88, и последующее регулирование иммунных и воспалительных генов, в том числе воспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли альфа (ФНО), с активация митоген-активируемой протеинкиназы [11-13]. Рецептор для продвинутых конечных продуктов гликозилирования (RAGE) является мульти-лиганд рецептора, который относится к надсемейства иммуноглобулинов [14]. Другие известные RAGE лиганды включают амилоида [15] и S100 [16]. Многочисленные эксперименты показали, что взаимодействие лиганд-RAGE также активирует NF-kB и митоген-активированной протеинкиназы [17-20].
<р> Многие патологические состояния связаны с провоспалительных свойствами HMGB1. Предыдущие отчеты показали, что HMGB1 играет критическую роль в эндотоксемии [21], острый панкреатит [22], острый респираторный дистресс-синдром [23], некоторые аутоиммунные заболевания [24], церебральная ишемия [25], а также ишемия-реперфузия (ИК) повреждения печени [26], сердца [27] и почек [28]. Что касается желудочно-кишечного тракта, HMGB1 является осложняющим фактором при экспериментальном колите [29,30], а также нестероидные противовоспалительные препараты индуцированных небольшой травмы кишечного тракта [31].
<р> В настоящее время роль HMGB1 в заживлении ран остается неясным, хотя его способность вызывать воспаление была хорошо документирована, как описано выше. В желудочно-кишечном поле, ни одно исследование не рассматривалась роль HMGB1 в заживлении ран. Целью данного исследования было изучение роли HMGB1 при язвенной болезни желудка исцеления. Мы исследовали роль HMGB1 в процессе заживления с помощью установленной экспериментальной модели хронической язвенной болезни желудка, созданной в грызуна путем местного применения уксусной кислоты из желудка стороны серозной. Модель точно имитирует пептической язвы желудка человека в гистологии и морфологии [32]. Мы также исследовали, влияет ли HMGB1 заживления язвы через TLR2, TLR4, или RAGE.

Материалы и методы

Животные
<р> TLR2- и TLR4-Нокаут (KO) мышей, которые были первоначально сгенерированные доктором С. Акира (Университет Осаки, Осака, Япония ) и возвратное скрещивание 8 раз на в C57BL /6 фоне, были получены из восточных Bioservice, Inc. (Киото, Япония). RAGE-KO мышей, которые были возвратное скрещивание на в C57BL /6 фоне, были первоначально порождена и подарок от доктора Ямамото (Канадзава медицинский университет, Канадзава, Япония). 6 мышей дикого типа C57BL /были приобретены у фирмы Charles River Japan, Inc. (Atsugi, Япония) в качестве контрольного штамма для TLR2 KO, TLR4 КО и дерзость мышей KO. были использованы конкретного патогена 12-недельных самцов животных. Все животные были размещены в поликарбонатных клетках с бумажной стружки постельных принадлежностей. Клетки были расположены в кондиционируемом помещении с биологической 12-ч свет-темнота цикла. Все экспериментальные процедуры были одобрены Animal Care комитета города Осака университета Высшей школы медицины (разрешение номер: 11006) путем. Все операции проводились под изофлуран, и все усилия были сделаны, чтобы свести к минимуму страдания.

Экспериментальная Индукционная язвенного
<р> Язва желудка индуцировали методом, описанным подробно в другом месте [33], с незначительными изменениями , Если коротко, то под эфирным наркозом животы животных были врезаны и желудок подвергалось. Полипропиленовую трубку (4 мм в диаметре) помещали против серозной стороны желудка. 80-мкл аликвоты 60% -ной уксусной кислоты добавляли в пробирку, которую выдерживали в контакте с поверхностью серозной в течение 30 с. После немедленного удаления уксусной кислоты из трубки путем аспирации желудок был возвращен в исходное положение, а живот был закрыт. Предыдущие отчеты показали, что размер язвы желудка достигает максимума на 3-й день или 4 после индукции язв, а после этого, она постепенно уменьшается [32,34]. Заживление фаза экспериментальной язвы желудка начинается на 4-й день после индукции язвы

Экспериментальные группы
<р> Для того, чтобы исследовать влияние экзогенного HMGB1, мыши получали внутрибрюшинные инъекции рекомбинантного HMGB1 человека (rHMGB1;. 100 -1000 мкг /кг; Sigma-Aldrich Co., Сент-Луис, Миссури) или носитель (фосфатно-солевого буферного раствора) два раза в день, начиная с 4-х суток после язвенного индукции (с 4-й день в 9-й день).
<р> Далее, эффект иммунонейтрализации из HMGB1 на желудочную заживление язвы оценивали. Мышам внутрибрюшинно вводили нейтрализующих анти-куриные HMGB1 поликлональные антитела (5 мг /кг; Шино испытаний корпорации, Токио, Япония) или нормальная курица IgY (5 мг /кг; Sigma-Aldrich Co.), начиная с 4-х дней после индукции язв ( с 4-го дня до 9-й день). Более того, чтобы подтвердить эффект высвобождения ингибитора HMGB1, этилпируват или носитель вводили два раза в день, начиная с 4-й день после индукции болезни.
<Р> Кроме того, чтобы определить, рецептор, ответственный за HMGB1 связанных с язвенной болезни желудка целительских, язвы желудка были вызваны в TLR2 KO, TLR4 КО и RAGE мышей KO с или без внутрибрюшинного введения 1000 мкг /кг rHMGB1 два раза в день начала на 4-й день после индукции язвы.
<р> удаляли желудок и размер язву измеряли на 6-й день или 9 после индукции болезни. выражалась размер Язва как индекс язвенного, произведение максимальной длины и минимальной длины (т.е. максимальная длина умножали на минимальную длину). Исследования проводились с использованием 4-8 проб. Образцы ткани желудка были обработаны для дальнейшей оценки.

мРНК экспрессии медиаторов воспаления в желудочном ткани, определяемом в реальном времени с обратной транскрипцией Количественное-полимеразной цепной реакции (RT-PCR)
<р> Реального количественный ОТ-ПЦР проводили, как описано ранее [35]. Короче говоря, общая РНК выделяли из ткани кишечника с использованием набора ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd., Токио, Япония) в соответствии с протоколом производителя. Комплементарной ДНК была приобретена с использованием высокой емкости РНК-к-кДНК Kit (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA) в соответствии с протоколом производителя. В режиме реального времени количественный анализ ОТ-ПЦР проводили с использованием Applied Biosystems 7500 быстродействующая система ПЦР в реальном времени и программное обеспечение (Life Technologies Corporation). Реакционную смесь получали в соответствии с протоколом производителя при помощи функции TaqMan быстрого мастер-смеси Универсальный PCR (Life Technologies Corporation). Термические условия езда на велосипеде были следующими: 45 циклов амплификации при 95 ° С в течение 15 с и 60 ° С в течение 1 мин. Суммарную РНК подвергали реальном времени количественного RT-PCR для измерения генов-мишеней с использованием TaqMan, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы контрольные реагенты (Life Technologies Corporation), которые использовались в качестве внутреннего стандарта. Экспрессия мРНК, кодирующей HMGB1, TLR4, RAGE, сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), интерлейкина-1-бета (ИЛ-1β), и TNF-alpha в изъязвлённую и нормальной желудочной ткани количественно оценивали с использованием в режиме реального времени RT-PCR и стандартизирован для глицеринового -3-фосфатдегидрогеназы уровни мРНК. Экспрессия мРНК каждого обозначается как отношение, по отношению к среднему значению в нормальной желудочной ткани. Праймеры и зонды, используемые для ОТ-ПЦР, приведены в таблице 1.
Gene

праймеров и зондов
TNF-αPrimer (вперед) 5'-TCATGCACCACCATCAAGGA-3'Primer (reverse)5’-GAGGCAACCTGACCACTCTCC-3’Probe5’-FAM-AATGGGCTTTCCGAATTCACTGGAGC-TAMRA-3’IL-1βPrimer (Вперед) 5'-ACAGGCTCCGAGATGAACAAC-3'Primer (reverse)5’-CCATTGAGGTGGAGAGCTTTC-3’Probe5’-FAM-GAAAAAGCCTCGTGCTGTCGGACCCATAT-TAMRA-3’RAGEPrimer (Вперед) 5'-CCACTGGATAAAGGATGGTGCA-3'Primer (reverse)5’-CAGCTATAGGTGCCCTCATCCTC-3’Probe5’-FAM-AGCCCTGTGCTGCTCCTCCCTGAG-TAMRA-3’TLR2Primer (Вперед) 5'-CTCTGGAGCATCCGAATTGC-3'Primer (обратный) 5'-GCTGAAGAGGACTGTTATGGC-3'Probe5'-CCTCAGACAAAGCGTCAAATCTCAGAGGA-TAMRA-3'TLR4Primer (вперед) 5'-GGCTGGATTTATCCAGGTGTGA-3'Primer (reverse)5’-CTGTCAGTATCAAGTTTGAGAGGTG-3’Probe5’-AGCCATGCCATGCCTTGTCTTCAATTGT-TAMRA-3’HMGB1Primer (Вперед) 5'-CAGCCATTGCAGTACATTGAGC-3'Primer (обратный) 5'-TCTCCTTTGCCCATGTTTAGTTG-3'Probe5'-GACAGAGTCGCCCAGTGCCCGTCC-TAMRA-3'VEGFPrimer (вперед) 5'-TCCGCAGACGTGTAAATGTTC-3'Primer (обратный) 5'-TTAACTCAAGCTGCCTCGCCT- 3'Probe5'-FAM-TGCAAAAACACACAGACTCGCGTTGC-TAMRA-3'Table 1. праймеры и зонды.
CSV Загрузить CSV

иммуногистохимических и иммунофлюоресценции окрашиванием
<р> образцы тканей фиксировали с помощью 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4), содержащий 4% параформальдегида. Образцы были помещены в парафин, и последовательные 5-мкм срезы толщиной были установлены на силанизированы слайдах (Dako, Токио, Япония). Образцы были погружены в раствор 3% Н <к югу> 2О <югу> 2 в абсолютном метаноле в течение 5 мин для того, чтобы ингибировать эндогенную активность пероксидазы, а затем инкубировали в 5% обезжиренном молоке в течение 10 мин. Гематоксилином и эозином проводили окрашивание для морфологических наблюдений. Кроличий анти-моноклональное антитело HMGB1 (разведенным 1: 250, Abcam, Кембридж, Массачусетс) был применен в качестве первичного антитела и инкубировали в течение ночи при 4 ° С с образцами. Вторичное антитело (Histofine Simple Stain MAX пероксидазы комплект; Nichirei Biosciences Inc., Токио, Япония) инкубировали с образцами в течение 1 ч в соответствии с инструкциями изготовителя. Иммунореактивности визуализировали путем обработки участков с Histofine Simple Stain и диаминобензидина раствора (Nichirei Biosciences Inc.). Образцы были затем контрастному окрашиванию гематоксилином. Далее, выражение TLR2, TLR4 и RAGE определяли с помощью метода иммунофлюоресценции. Первичные антитела, используемые в иммунофлюоресценции окрашиванием включали мышиное моноклональное антитело против рецептора TLR2 (разбавленного 1: 200; Abcam), мышиное моноклональное антитело против рецептора TLR4 (разбавленного 1: 200; Abcam) и крысиного моноклонального антитела к RAGE (разведенного 1: 250; Abcam). Образцы тканей, которые были получены, как описано выше, инкубировали в течение ночи при 4 ° С с первичными антителами, а затем подвергают взаимодействию с соответствующим флуоресцентным красителем-конъюгированные вторичные антитела (Abcam) в течение 2 ч. Образцы исследовали с помощью конфокальной микроскопии, оборудованного аргоном и аргон-криптон лазерных источников.

Измерение Сыворотка HMGB1 уровней
<р> Blood (1000 мкл) образцов были получены в пробирки для отделения сыворотки с помощью пункции сердца. После центрифугирования при 3000 оборотах в минуту в течение 10 мин, сыворотку собирали и хранили при -80 ° С. Сывороточные уровни HMGB1 измеряли с использованием сэндвич-ELISA HMGB1 набора (Сино-Test Corporation) в соответствии с протоколом производителя.

Измерение миелопероксидазы (МРО)
Методы

используется для измерения активности MPO подробно описаны в работах [36]. Вкратце, образцы гомогенизировали в 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 6,0), содержащем 0,5% гексадецилтриметиламмония бромидом (Sigma Chemical Co.). Суспензии центрифугируют, и МРО активность в полученной надосадочной жидкости анализируют с помощью спектрофотометра. Одна единица активности МРО была определена как количество фермента, который деградирует 1 мкмоль перекиси /мин при 25 ° C. Результаты выражены в единицах на грамм желудочной ткани.

Статистический анализ
<р> Значения выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM). Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) был использован для проверки значимости различий между группой лечения означает, и результаты были проанализированы с помощью защищенного младшее-разностного критерия Фишера. Р-значения менее 0,05 считались статистически значимыми.

Результаты

Время Курс Язва желудка Исцеление
<р> Для того, чтобы оценить процесс заживления язв желудка, экспериментальная язва желудка индуцировали путем местного применения уксусной кислоты из желудка стороны серозной , Язвы оценивали микроскопически (Фигура 1А, 1В) и макроскопически. Размер язвы достигала максимума на 4-й день и уменьшается с течением времени после включения (фиг.1С). Активность МРО (рис 1D) и экспрессии TNF α (рис 1E) и IL-1 (рис 1E) мРНК в изъязвленной желудочной ткани также достигло максимума на 4-й день, и их уровни были в язвенные ткани выше, чем в нормальной желудочной ткани на протяжении всего экспертиза период. Язвы также повышали экспрессию мРНК VEGF (рис 1F).

HMGB1 Expression изъязвления следующие
<р> Затем мы оценивали, был ли HMGB1 участвует в желудочном заживления язвы. Уровни мРНК HMGB1 в желудочном ткани (фиг.2А) и сывороточные уровни HMGB1 (Фигура 2В) достигли своего максимума на 4 день уровни мРНК HMGB1 были практически постоянными в течение срока испытаний, в то время как сывороточные уровни HMGB1 упал до нормального уровня через 6 дней после индукция язвы. Иммуногистохимически, изъязвление индуцированное заметное окрашивание цитоплазмы в HMGB1 в эпителиальных клетках, особенно в районах, пострадавших (рис 2C, 2D). В противоположность этому, в неповрежденной слизистой оболочке желудка, локализация HMGB1 была ограничена внутри ядер эпителиальных клеток (рис 2E).

Эффекты экзогенного HMGB1, HMGB1 иммунонейтрализации и ингибирование HMGB1 Release на Язва желудка Healing
<р> экспрессия мРНК и активность МРО были оценены на 6-й день, а индекс язвы оценивали на 9-й день, согласно результатам исследования курса времени. Мышам вводили rHMGB1 или анти-HMGB1 антитела внутрибрюшинно после индукции болезни. Администрация rHMGB1 в дозе либо 100 мкг /кг или 1000 мкг кг значительно подавлена ​​желудка заживление язвы /(рис 3А), что было связано с повышенной активностью MPO (рис 3B) и экспрессии TNF-alpha мРНК в Изъязвлённая тканях (рис 3C). В противоположность этому, HMGB1 нейтрализующих антител продвигаемых заживление язвы (рис 4а) с пониженной активностью MPO (рис 4В) и экспрессии мРНК TNF-alpha (Рисунок 4C). Усложняющим эффект экзогенного rHMGB1 на желудочную заживления язвы был отменен совместным введением анти-HMGB1 антитела (рис 4F). Экспрессия мРНК VEGF не зависела от обработки либо rHMGB1 (рис 3D, 3E) или анти-HMGB1 антителом (рис 4D, 4E). В нормальном желудочном ткани, введение rHMGB1 или анти-HMGB1 также не имеют каких-либо влияния на экспрессию цитокинов или активности МРО (данные не показаны). Кроме того, введение этилпирувата, ингибитор высвобождения HMGB1, заметно способствует заживлению язвы, по сравнению с лечением автомобиля. Исцеление сопровождалось подавлением экспрессии мРНК TNF-alpha (данные не показаны).

Роль TLR2, TLR4 и RAGE при язвенной болезни желудка исцеления

Для того, чтобы исследовать вопрос о том внести свой вклад TLR2, TLR4, и RAGE к HMGB1 опосредованной желудка заживление язвы, экспериментальные язвы желудка вызывали у TLR2 KO, TLR4 КО, RAGE KO, и контрольных мышей дикого типа. TLR4 и дефицит RAGE, способствовало образованию язвенной болезни желудка и предотвратить увеличение экспрессии мРНК ФНО после изъязвлений, в то время как дефицит TLR2 влияет ни индекс язву, ни экспрессию мРНК ФНО (рис 5А, 5В). Введение экзогенного HMGB1 влияет ни индекс, ни язву экспрессию мРНК ФНО в любом TLR4 КО или RAGE мышей KO (5С-5е). Администрация экзогенных HMGB1, однако, задержка заживления язвы у мышей дикого типа и снижение экспрессии мРНК TNF-alpha (рисунок 3).

Экспрессия TLR2, TLR4 и RAGE во время Язва желудка исцеления
<р> Далее мы исследовали экспрессию мРНК и иммунореактивности TLR2, TLR4 и RAGE у мышей дикого типа. Наблюдалось значительное повышающая регуляция мРНК TLR2 после индукции язвы (рис 6А). TLR2 иммунореактивности наблюдалось в основном в воспалительных клетках (рис 6б). Экспрессия мРНК TLR4 не зависела от индукции язвы (рис 6в). TLR4 иммунореактивности наблюдалось в апикальной части эпителиальной выстилки на язвенного края, а в некоторых воспалительных клеток в слое язвы (рис 6D).
<Р> Наблюдалось значительное повышающая регуляция мРНК RAGE на 9-й день после того, как индукция язвы (рис 6E). RAGE иммунореактивности наблюдалось в основном в воспалительных клетках у края язвы кровати и в сосудистой мембране клетки эндотелия (рис 6F).
<Р> Окрашивание язвенные ткани из TLR4 КО или RAGE мышей KO с анти-TLR4 антител или анти-RAGE антитела, соответственно, не было обнаружено никаких положительных сигналов, подтверждающих специфичность этих антител (данные не показаны).

Обсуждение
<р> В этом исследовании мы показали, что экзогенный задержки HMGB1 желудка заживление язв, в то время индукции экспрессии ФНО и активность MPO. С другой стороны, иммунонейтрализации из HMGB1 или ингибирования высвобождения HMGB1 способствует заживлению язвы при одновременном снижении экспрессии ФНО и активность MPO. Кроме того, TLR4 и дефицит RAGE способствует заживлению язвы, и экзогенные HMGB1 не удается задержать заживление язв в TLR4 КО и RAGE мышей KO. Эти результаты свидетельствуют о том, что HMGB1 является осложняющим фактором для язвы желудка исцеления, которое действует через TLR4- и RAGE-зависимых путей. Насколько нам известно, это первый отчет, чтобы разъяснить роль HMGB1 в заживлении ран в пределах желудочно-кишечного тракта.

Несколько исследований было посвящено роли HMGB1 в заживлении ран и в других, чем желудочно-кишечного тракта органов, но результаты этих исследований противоречивы [37-40]. В соответствии с нашими результатами, некоторые исследования показали, что HMGB1 оказывает угнетающее действие на заживление ран [37,38]. Чжан и др. Показано, что HMGB1 ухудшает Разрез заживление ран за счет снижения репаративной отложение коллагена с помощью RAGE [37]. Goova и др. показали, что блокирование RAGE лигандов, таких как возраст и HMGB1, используя растворимую форму рецептора AGE (sRAGE), ускоряет заживление язв и подавляет уровни воспалительных цитокинов [38]. Предыдущие исследования показали, что чрезмерное воспаление нарушение заживления ран. Например, наше предыдущее исследование показало, что TNF-alpha избыточная экспрессия и чрезмерная нейтрофильной инфильтрации усложняют факторы в формировании и заживлению язвы желудка [41]. Кроме того, в другой модели восстановления тканей, Горен и др. показали, что чрезмерное нейтрофилов и макрофагов инфильтрация TNF α избыточная экспрессия ингибирует заживление повреждений кожи мыши [42]. Таким образом, вполне возможно, что HMGB1 задерживает желудка заживление язв через TNF-альфа вызвали воспалительные реакции.
<р> В отличие от этого, некоторые лабораторные исследования предположили, что HMGB1 и его рецепторы имеют важное значение для заживления ран [39,40]. Staraino и др. Показано, что HMGB1 ускоряет процесс заживления ран и регенерации путем усиления миграции фибробластов кожи и кератиноцитов [39]. HMGB1 также способствует заживлению ран от 3Т3 фибробластов путем индуцирования пролиферации и миграции клеток через активацию RAGE /внеклеточной регулируемой киназы [40]. Поскольку эти исследования в пробирке проводились при отсутствии воспалительных клеток, различия в экспериментальных методов может привести к непоследовательным выводам о роли HMGB1 в заживлении ран.
<Р> VEGF, мощный ангиогенный фактор роста, играет важную роль при язвенной болезни желудка заживления [43,44]. Ранее сообщалось, что продемонстрировано HMGB1 может индуцировать экспрессию VEGF в некоторых тканях и моделях на животных [45-47]. Тем не менее, в данном исследовании, ни rHMGB1, ни анти-HMGB1 антитела влияют экспрессию VEGF в язвенного ткани. Причина несоответствия между нашими выводами и результатами более ранних исследователей не ясно, но это может быть связано с использованием различных органов и экспериментальных моделей.
<р> Есть 2 возможные источники внеклеточного HMGB1: пассивное освобождение от некротических клеток [48] и активной секреции из воспалительных клеток [5]. В этом исследовании HMGB1 иммунореактивность наблюдали в цитоплазме, а также ядра, предполагая, что некротические клетки являются источником HMGB1. Желудочный уровни мРНК HMGB1 увеличена во время заживления язв, предполагая, что воспалительные клетки производят и выпускают HMGB1. В совокупности высота сыворотке HMGB1 приводило было обусловлено пассивного освобождения из поврежденных клеток при язвенной болезни желудка и активной секреции из воспалительных клеток.
<р> Сывороточные уровни HMGB1 увеличилась после индукции язвенной болезни желудка, но снизилась на поздней стадии заживления, хотя экспрессия HMGB1 и TNF α оставался высоким. Эти данные повышают вероятность системной системы HMGB1 отлова. С этой целью, было сообщено о существовании связывающего белка HMGB1. Тромбомодулин, клеточной поверхности гликопротеин, является одним из примеров связывающего белка HMGB1. Рекомбинантный человеческий растворимый тромбомодулин ингибирует увеличение плазмы HMGB1, вызванной липополисахаридом в крысиной модели [49] и связанного с HMGB1 через лектин области [50], чтобы предотвратить HMGB1 от взаимодействия с другими рецепторами [51]. В клинической практике, тромбомодулин также полезен в HMGB1 связанных с заболеваниями и состояниями, такими как сепсис из-за его анти-HMGB1 свойствами [52]. sRAGE, находится в обращении, является еще одним примером связывающего белка HMGB1. sRAGE является растворимая форма RAGE; он действует как приманка, чтобы предотвратить взаимодействие между клеточной поверхности RAGE и его лигандами, такие HMGB1 [53]. В настоящем исследовании, такие системы отлова могут также играть защитную роль в предотвращении распространения воспаления, тем самым способствуя заживлению язвы.
<р> Известно, что многие пациенты, пептические язвы заражают хеликобактерной
. Хотя в данном исследовании мы не исследовали роль HMGB1 при язвенной болезни желудка заживление у мышей, инфицированных H. пилори
, клинические и экспериментальные исследования показывают, что вредное влияние HMGB1 на язвы желудка заживление будет более выраженным у пациентов с H. пилори
инфекции, чем у пациентов без него. Ранее мы показали, что H. Pylori
инфекция увеличивает нейтрофильной инфильтрации в Изъязвлённая тканей в монгольских песчанок [54]. Shimizu и др. также показали, что нейтрофилы и макрофаги инфильтрата язва края до более высокой степени у больных с H. пилори
инфекции, чем у пациентов без инфекции [55]. Большое количество HMGB1, поэтому, вероятно, присутствует в язвенные ткани, инфицированной H. пилори
, так как она будет секретируемых этими воспалительными клетками. Кроме того, Рэдин и др. сообщил, что Вака, одним из основных факторов вирулентности этого организма, вызывает запрограммированную некроз эпителиальных клеток желудка и последующего высвобождения HMGB1 [56]. Таким образом, мы ожидаем, что пагубное из HMGB1 на заживление язвы будет более заметным в H. пилори
-infected пациентов.
<р> TLR2, TLR4 и RAGE, который опосредует провоспалительные реакции, которые обычно известны HMGB1 рецепторы. Наши результаты ясно показали, что TLR4 и RAGE играют решающую роль при язвенной болезни желудка исцеления. Этот результат согласуется с предыдущими данными о воспалительных реакций, вызванных HMGB1. Одной из самых известных моделей, включающих взаимодействие между HMGB1 и этими рецепторами является травма I-R. При печеночной травмы I-R, TLR4-дефицитных мышей выставлены меньше печени I-R повреждение; повреждение в TLR4-дефицитных мышей не была затронута rHMGB1 или анти-HMGB1 антитела [26]. Кроме того, блокирование RAGE, защиту от гепатоцеллюлярной смерти и некроза в печени модели повреждения I-R [57]. В качестве модели сердечной травмы I-R, Андраши и др. показали, что RAGE-дефицитных мышей отображается только небольшое воспаление возникающих в результате сердечной травмы I-R; воспаление не зависит от индукции rHMGB1 [27]. Эти данные свидетельствуют о том, что TLR4-HMGB1 и RAGE-HMGB1 взаимодействия играют решающую роль в травмы I-R, хотя необходимо учитывать различия в каждом органе. Другой установленная модель является системное воспаление, такие как сепсис [5,8,58]. В экспериментальной модели внутрибрюшного сепсиса, Сузы и др. Показано, что взаимодействие HMGB1-RAGE был тесно связан с сепсис-индуцированной диафрагмальной дисфункции [58]. В системной модели воспаления в естественных условиях, порожденного инъекции экзогенного HMGB1, Zoelen и др. Показано, что HMGB1 индуцирует высвобождение цитокинов, активация коагуляции, а также набора нейтрофилов через TLR4 и RAGE [8]. Таким образом, TLR4 и RAGE играют важную роль в патогенезе опосредуется HMGB1 ассоциированного пути, в том числе пути в нашей модели заживления язвы.
<р> Наши результаты указывают на то, что TLR2 не имеет никакого отношения к желудочной заживления язвы: заживление язв в TLR2 KO мышей напоминающее, что у мышей дикого типа. Хотя исследования в пробирке с использованием макрофагов клеточных линий показали, что TLR2-HMGB1 путь вызывает воспалительные реакции [6,9], не сообщалось в естественных условиях эффекты TLR2 в HMGB1 опосредованной патологий. Таким образом, на основе предыдущих результатов [8] и наши результаты, путь HMGB1-TLR2 может играть незначительную роль в ремонте и патогенезе повреждения тканей и воспаления.
<р> В заключение, мы показали, что HMGB1 является осложняющим фактором в процессе заживления язвы желудка, а также в других патологических состояниях. Более того, мы показали, что HMGB1 ингибирует заживление язв через механизм, который включает в себя TLR4, злоба и чрезмерное воспалительные реакции. Хотя ингибиторы протонной помпы обычно назначают при язвенной болезни желудка, неразрешимых язвы до сих пор представляют собой клиническую проблему. Наше нынешнее исследование поддерживает новую концепцию для лечения трудноизлечимых язв желудка, кроме ингибиторов протонной помпы терапии.

Выражение признательности
<р> Мы благодарим Emi Сузуки-Йошиока за техническую помощь. Я хотел бы также выразить свою искреннюю благодарность сотрудникам Осаки городского университета, который поддерживал нас.

• PLoS ONE: Mangiferin смягчающего Язва желудка в Ишемия /реперфузированной Rats: Вовлечение PPAR-gamma, NF-kB и Nrf2 /HO-1 Signaling Pathways
• PLoS ONE: Нет Ассоциация потребления кофе с язвенной болезнью желудка, язва двенадцатиперстной кишки, рефлюкс-эз…