Бактерицидные активности катионных стероид CSA-13 и кателицидина пептида LL-37 против Helicobacter Pylori в имитированной желудочной деятельности juice

Бактерицидные катионного стероид CSA-13 и кателицидина пептида LL-37 против Helicobacter Pylori
в искусственном желудочном соке
абстрактный
фон
всемирно появление устойчивых к лекарственным препаратам штаммов H. Pylori
мотивирует поиск новых агентов с терапевтическим потенциалом против этого семейства бактерий, колонизирует желудок, и связано с развитием аденокарциномы , Данное исследование было разработано для оценки в пробирке
анти-H. Pylori
потенциал кателицидина LL-37 пептида, который естественным образом присутствует в желудочном соке, оптимизированной синтетический аналог WLBU2 и непептидная антибактериальный агент ceragenin CSA-13.

Результаты В соответствии с предыдущими исследованиями , наблюдалась повышенная экспрессия HCAP-18 /LL-37 в слизистой оболочке желудка, полученной из H. Pylori
инфицированных субъектов. MBC (минимальная бактерицидная концентрация) значения определяется в питательном содержащих диапазоне медиа от 100-800 мкг /мл для LL-37, 17.8-142 мкг /мл для WLBU2 и 0.275-8.9 мкг /мл для ceragenin CSA-13. Эти данные указывают на существенные, но сильно отличающиеся антибактериальной активностью в отношении клинических изолятов H. Pylori
. После инкубации в искусственном желудочном соке (низком рН с присутствии пепсина) CSA-13, но не LL-37 или WLBU2, нераспределенную антибактериальной активностью. По сравнению с МР-37 и WLBU2 пептидов, CSA-13 активность была также более устойчивой к ингибированию изолированным хозяевах желудочного муцина.
Заключение
Эти данные указывают на то, что желчные кислоты на основе антимикробные агенты, такие как CSA-13 противостоять протеолитический распад и ингибирование муцин и имеют потенциал для лечения H. Pylori
инфекций, в том числе вызванные кларитромицин и /или метронидазол-резистентных штаммов.
Предпосылки
хеликобактер пилори
осуществляется более чем наполовину мирового взрослого населения [1]. Он может хронически колонизировать слизистую оболочку желудка человека, где она находится в слизистого слоя и приклеен к эпителиальным клеткам [2]. Несмотря на то, что большинство инфицированных субъектов остаются бессимптомными, инфекция с хеликобактерной
может способствовать тяжелой гастрит [3] и значительно увеличивает риск опухолей желудка [4, 5]. В некоторых эпидемиологических исследованиях, H. Pylori
Искоренение было показано, чтобы быть эффективным в профилактике рака желудка [6, 7]. Кроме того, H. Pylori
ликвидации было обнаружено, чтобы уменьшить частоту и тяжесть поражений с канцерогенного потенциала в животных моделях [8, 9]. Природные механизмы, которые защищают хозяина от H. Pylori
инфекции зависит от функции врожденной системы защиты, в которых антибактериальные пептиды, такие как кателицидина LL-37 [10, 11] и O-гликаны в желудочном муцина [12] играют Ключевую роль.
LL-37 представляет собой протеолитическому процессингу пептид, полученный из с-концевого домена человеческого кателицидина (HCAP-18 /МР-37), которые конститутивно выпущен во внеклеточное пространство с помощью фагоцитарных гранулоцитов и эпителиальных клеток [13] , Функции, приписываемые LL-37 включают предотвращение роста бактерий [14], нейтрализации бактериальной молекулы стенки биоактивности [15], и активации клеток-хозяев путем связывания специфических рецепторов клеточных мембран [16-18]. H. пилори
активирует производство LL-37 /hCAP18 эпителием желудка, предполагая, что кателицидина или его производные LL-37 помогает установить баланс между хост через слизистую оболочку обороны и H. Pylori
механизмов выживания, которые регулируют хронические инфекция с этим патогеном желудка [10, 11].
Катионные антибактериальные пептиды (CAPS), включая LL-37 были широко исследованы в качестве потенциального источника новых антибактериальных молекул. Инженерии WLBU2 пептид, остатки расположены так, чтобы образовать амфипатическую спиральную структуру с оптимальным зарядом и гидрофобным плотности, преодолевает некоторые ограничения естественного LL-37, такие как чувствительность к Mg 2 + или Ca 2 + и инактивацией крови в сыворотке крови [19]. Поэтому WLBU2 может лечить инфекции, где LL-37 является неэффективным. Для того, чтобы генерировать молекулы, способные имитировать способность колпачками к компромиссу целостности бактериальной мембраны, непептидные ceragenins с катионными, были разработаны вестибулярной амфифильные структуры, характерные для большинства антимикробных пептидов. Ceragenins, такие как CSA-13 воспроизводят требуемую морфологию CAP с использованием желчи-кислотных строительных лесов и приложенных аминные группы [20]. Они обладают бактерицидным действием против грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, в том числе резистентных бактерий, таких как клинически значимых метициллин-устойчивый золотистый стафилококк
(MRSA) и предыдущее исследование показало, что восприимчивость CSA-13 имеет MIC <суб> 50 /MBC <суб> 50 соотношение 1 [21, 22]. В данном исследовании мы сравним бактерицидное потенции LL-37, WLBU2 и CSA-13 против клинических изолятов H. Pylori
. Полученные результаты свидетельствуют о том, что желчные кислоты подражает на основе антимикробного пептида, такие как CSA-13 имеют потенциал для лечения H. Pylori
инфекции, в том числе вызванные кларитромицин и /или метронидазол-резистентных штаммов.
Результаты <бр> Иммуногистохимическое зондирование желудка участков слизистой оболочки человека с анти-HCAP-18 /LL-37 антитела
Микроскопические изображения слизистых оболочек биопсий после иммуногистохимического оценки с анти-HCAP-18 /LL-37 антитела, показаны на рисунке 1. DAB- положительное окрашивание указывает на присутствие LL-37 пептида и /или его родительского белка HCAP-18. DAB окрашивание высокой интенсивности (обозначенный коричневым цветом) в слизи производящих эпителиальных клеток и фундального желез указывает на высокую накопление HCAP-18 /LL-37 пептида, скорее всего, обусловлен LL-37 специфического взаимодействия с муцина, о котором сообщалось в предыдущих исследованиях [23, 24]. Распределение HCAP-18 /МР-37 в более дифференцированных эпителиальных клеток популяции слизистой оболочки желудка отличается от таковой для человеческого бета-дефенсина 2 [10] или лизоцима [25], но аналогичен тому, что наблюдается в толстой кишке [26 ]. Желудочную среду биопсии от пациентов, инфицированных H. Pylori
показать более высокую интенсивность окрашивания DAB по сравнению с результатами, полученными от неинфицированных предметов. Согласно предыдущим сообщениям, этот результат указывает на хост-защитную реакцию на H. Pylori
[11], который частично основан на повышенной экспрессии HCAP-18 /LL-37 с помощью эпителиальных клеток желудка. Рисунок 1 Наличие HCAP-18 /МР-37 пептида в слизистой оболочке биопсий из желудка человека обнаружены с помощью иммуногистохимического анализа с использованием моноклональных антител к человеческим CAP-18 /LL-37. Образцы A /B и C /D представляют собой образцы, полученные из неинфицированных и H. Pylori
инфицированных субъектов соответственно. Приведенные данные являются репрезентативными из пяти экспериментов.
Бактерицидную активность LL-37, WLBU-2 пептиды и ceragenin CSA-13 против различных штаммов H. пилори

для выявления устойчивых штаммов, клинических изолятов H. пилори
были подвергнуты оценке MIC (таблица 1) с несколькими антибиотиками в настоящее время используются в клинической терапии антихеликобактерной
инфекции. Среди семи протестированных изолятов, полученных из разных предметов, штамм 4 был устойчив к метронидазолу штаммов 5, 6, 7, были устойчивыми к метронидазолу и кларитромицину. Все выделенные штаммы были чувствительны к амоксициллину и тетрациклину. В соответствии с предыдущими сообщениями о влиянии кч-1, Н-BD-2 и LL-37 пептиды против H. Pylori
[10, 11] все выделенные штаммы H. Pylori
были убиты после 6 часов инкубации с LL-37, WLBU2 и CSA-13 со средним MBC (мкг /мл) значения 8,9 ± 4,03; 5,23 ± 2,7 и 0,31 ± 0,25 при МВС оценивали в буфере HEPES, или 300 ± 232, 53 ± 41 и 2,98 ± 3,11 при МВС оценивали в Brucella бульоне драгоценных металлов, соответственно (рисунок 2). Оценка значений MBC в HEPES буфере с добавлением 2 мМ MgCl <суб> 2 для H. Pylori
ATCC 43504 показал восемь кратное увеличение для LL-37, и четыре раза больше, как для WLBU2 и CSA-13 (данные не показывать). Рисунок 2 бактерицидной активностью в отношении H.pylori. Минимальная бактерицидная концентрация (МБК) из LL-37 (белый столбец), WLBU2 (серый столбец) и CSA-13 (черный столбик) против H. Pylori
(АТСС 43504 штамм и семь клинических изолятов, полученных из слизистых оболочек образцов из различных предметов ) оценивали в HEPES (панель А) или Brucella бульоне Bulion (панель B). MBC показывает концентрации, при которых соединения полностью уничтожить затравтку H. Pylori
.
Таблица 1 Оценка чувствительности клинических штаммов H. Pylori
к антибиотикам.
H. штаммы пилори на
Антибиотики

AMX
CLR
Tet
Метронидазол
ATCC 43504
0,016
0,094
0,25 <бр> 64,0 ®
1
0.094
0.125
0.75
0.19
2
<0.016
0.19
0.125
0.094
3
0.016
0.25
3.0
0.5
4
0.032
0.047
2.0
32.0 ® страница 5 0.25
64,0 ®
1,0
96,0 ®
6
0,032
1,5 ®
1,5
32,0 ®
7
0,047
1,5 ®
2,0
48,0 ®
значения МИК (мкг /мл) (АМХ-амоксициллин, CLR-кларитромицин, TET-тетрациклин)
Антибактериальная активность LL-37, WLBU2 и CSA-13 после предварительной инкубации при низком рН с пепсина или муцина
в дополнение к известным ингибирования колпачков антибактериальной активности двухвалентных катионов, таких как Mg 2+ и Ca 2+, протеолитическую активность пепсина также может поставить под угрозу функцию колпачками в желудочной среде сока с наличием муцинов и низкого рН. Для решения этой возможности мы оценили антибактериальную активность против кишечной палочки
1655 после 3-х часов предварительной инкубации в LL-37, WLBU2 и CSA-13 в искусственном желудочном соке, по сравнению с активностью после их предварительной инкубации в PBS при рН 7,4 , Перед проведением анализа убийства, рН образцов с низким рН и низким рН /пепсин доводили до 7,4. Антибактериальная активность LL-37 и пептиды WLBU2 против кишечной палочки
MG1655 существенно не изменилась после предварительной инкубации при рН ~ 1,5, но была утрачена после предварительной инкубации при рН ~ 1,5 в присутствии пепсина (Фигура 3А и 3B). В отличие от этого, антибактериальная активность CSA-13 не изменилась по предварительной инкубации при рН ~ 1,5 с или без пепсина (рис 3C). С другой стороны, бактерицидное активность всех компонентов были скомпрометированы в той или иной степени при тестировании с использованием бактериального анализа убийства в присутствии очищенной муцина желудка. В тесном согласии с результатами, полученными от этой кишечной палочки
исследования MG1655, ценности МВС LL-37 пептида оценивали после 1H предварительной инкубации с буфером при низком рН, содержащего пепсин или муцина был увеличен, но те CSA-13 были почти без изменений (Рисунок 3D). Все оцениваемые агенты потеряли антибактериальную активность в PBS с добавлением 10% желчи человека (в концентрации, которая не препятствует кишечной палочки
1655 рост - данные не показаны). Этот результат позволяет предположить, что физико-химические свойства антибактериальных молекул способствуют их включение в желчном липопротеинов, тем самым ограничивая их взаимодействие с бактериальной стенки. Там не было ни в одном исследовании для оценки антибактериальной активности шапок в двенадцатиперстной сок, но эти результаты указывают на то, что рефлюкс желчи в желудок может вмешиваться в деятельность колпачками. Рисунок 3 Антибактериальная активность против штамма Е.coli MG1655 и хеликобактерной штамм АТСС 43504. антибактериальную активность LL-37 (панель А), WLBU2 (группа В) и CSA-13 (панель C) против Е. coli MG1655 после
предварительная инкубация (3 ч при 37 ° с) в PBS (открытые кружки), имитированный желудочный сок при рН ~ 1,5 (квадраты), имитированный желудочный сок с пепсином (ромбы), имитированный желудочный сок с муцин (треугольники) и PBS, с человеком желчь (10%), полученные из желчного пузыря (закрашенные кружки). Приведенные данные являются средние значения ± SD от трех до четырех экспериментов. МВС LL-37 (белый столбец) и CSA-13 (черный столбик) (Панель D) против H. Pylori
(ATCC 43504) после предварительной инкубации (1 час при 37 ° С) в искусственном желудочном соке при рН ~ 1,5 (а), имитированный желудочный сок с пепсином (в) и в присутствии муцина (с)
Аналитическую характеристику LL-37 и CSA-13 после инкубации с пепсина
масс-спектрометрического анализа (рис 4) показывает, что три часа инкубации с результатами пепсина в обширной деградации LL-37. Тем не менее, при низком рН, пепсином высоко специфична и LL-37 расщепление пептида ограничена к участку с гидрофобными аминокислотами. Потенциальные сайты расщепления предсказывается PeptideCutter характеристика программного обеспечения HTTP:.. //Кр expasy орг /инструменты /peptidecutter /, позволяют предположить, что LL-37 с переваривания пепсина в наших экспериментальных условиях должны выпустить 11 продуктов, в том числе 3 коротких пептидов (RKSKEKIGKE, FKRIVQRIKD и LVPRTES). Эти предсказания согласуются с масс-спектральным анализом, который не показывает наличие любого интактного LL-37 остающегося после инкубации с пепсином при низком рН, но демонстрируют появление нескольких новых пиков с различными временами удерживания. Оставшийся Антибактериальная активность LL-37 после обработки пепсином (Фиг.3А и 3D) в умерщвлении анализах, вероятно, представляет собой остаточную активность этих LL-37 фрагментов. В отличие от наблюдаемой деградации LL-37, КСА-13 аналитическая характеристика не была изменена после инкубации с пепсином при низком рН. Рисунок 4 Масс-спектрометрический анализ. Масс-спектрометрический анализ LL-37 (панель A) и CSA-13 (панель B) в PBS (кривая 1), буфер с низким рН (кривая 2) и низким рН буфер с присутствии пепсина (кривая 3). Общая ионная хроматограмма (TIC) представлен для каждого состояния образца с врезке массы к заряду (м /г) спектры показаны интенсивности для штучной ТЭП пиков. Молекулярная масса интактного LL-37 является 4494, которое можно наблюдать с несколькими зарядами (m /z = 4 MW = 1124, м /Z = 5 МВт = 900, и т.д.) в режиме положительных ионов. Молекулярная масса CSA13 составляет 678, которое можно наблюдать непосредственно и с несколькими зарядами. Данные из одного эксперимента показаны.
Токсичность LL-37, WLBU2 и CSA-13 против РБК и клеток аденокарциномы человека
неспецифическое введение антибактериальных пептидов и их имитаторов в клеточные мембраны хозяев могут вызвать токсичность. Хост клеточной мембраны пермеабилизации может быть измерена с помощью высвобождения белков, таких как гемоглобин и ЛДГ из цитоплазмы во внеклеточное пространство. По оценке гемоглобина и высвобождения ЛДГ (рис 5А и 5В), мы не показывают значительного мембраны пермеабилизации любыми тестируемых молекул в диапазоне, в котором они имеют бактерицидную активность в засоленных буферов (Рисунок 2А, рисунок 3). Этот вывод был подтвержден микроскопическим оценки аденокарциномы морфологии клеток не будет видимой разницы между контрольными клетками и у пациентов, получавших 10 мкг /мл LL-37, WLBU2 или CSA-13 (5С). Однако увеличение гемоглобина и ЛДГ выпуска наблюдалось при увеличении концентрации. Среди трех молекул тестируемых, WLBU2 был самым сильным гемолитическим агентом, но все они показали одинаковую способность к компромиссам целостности клеток аденокарциномы мембраны (фиг 5В и 5С). CSA-13 бактерицидные концентрации против H. Pylori
и кишечной палочки
MG1655 (фигуры 2А, 2В и 3В), проанализировав в физиологическом растворе, а также питательных веществ, содержащих буфер, были ниже его минимальной гемолитической концентрации и ниже концентраций, вызывающих дисфункцию аденокарциномы клеточные мембраны. Рисунок 5 Оценка токсичности клеток. Гемоглобин и ЛДГ высвобождение из человеческих красных кровяных клеток и желудочных клеток аденокарциномы человека (панель А и В, соответственно) после добавления LL-37 (кружки), WLBU2 (ромбы) и CSA-13 (треугольники), с последующей инкубацией в течение 1 ч при 37 ° С. Приведенные данные являются средние значения ± SD из трех экспериментов. Морфология клеток человека аденокарциномы желудка до (контроль) и после того, как LL-37, WLBU2 и CSA-13 лечение оценивали с помощью фазово-контрастной микроскопии (панель C). Данные из одного репрезентативного эксперимента показаны. Два других экспериментов показали аналогичные результаты.
Обсуждение
Скорость успешного лечения H. Pylori
инфекции желудка, достигается при комбинированной терапии двух антибиотиков и ингибитора протонной помпы сократилось с более чем 90% до примерно 80 % в течение последнего десятилетия [27]. Кроме того, стоимость этой терапии является значительным, и, следовательно, потребность в более широко доступных средств для лечения или профилактики H. Pylori
инфекции все еще существует [28]. Новые агенты для лечения H. Pylori
инфекции необходимы также в связи с увеличением проблем лекарственной устойчивости, вызванных широким применением антибиотиков [29] и адаптивных механизмов выживания патогенных бактерий противодействуют используемых в настоящее время противомикробные препараты. Например, штаммы H. Pylori
устойчивые к амоксициллин, метронидазол и кларитромицин сообщалось [30, 31]. Методы улучшения методов лечения хеликобактерной
может руководствоваться пониманием в природные механизмы, с помощью которых инфицированные пациенты реагируют на этой бактерии, и причины, почему нормальные механизмы принимающей обороны не удастся.
Это исследование подтверждает предыдущий доклад увеличение экспрессии HCAP-18 /МР-37 в слизистой оболочке желудка субъектов, инфецированных Г. пилори
[11]. Этот факт позволяет предположить, что увеличение производства бактерицидной пептида LL-37 может играть ключевую роль в защите хозяина против H. Pylori
[11]. Тем не менее, эта бактерицидная реакция у некоторых субъектов является недостаточным и H. Pylori
инфекция по-прежнему может достигнуть хронической стадии. Отсутствие бактерицидной функции LL-37 в этой установке предположил, что повышенная экспрессия HCAP-18 /МР-37 пептида в желудочной слизи инфицированных субъектов, могут иметь дополнительные функции, в качестве противовоспалительного и роста стимулирующего агента. Действительно, недавно было показано, что язва желудка исцеления у крыс способствует кателицидина-опосредованной трансактивации рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR) через трансформирующий фактор роста альфа (TGFα) сигнального пути [32]. В качестве альтернативы, потеря защиты против H.pylori,
может быть из-за потери антибактериальной функции LL-37 в среде слизистой оболочки желудка. Следовательно, конструкция антимикробных агентов, которые являются более эффективными в этой ситуации может быть полезным.
Движимые иммуногистологических результатами, активность LL-37 против клинических изолятов H. Pylori
и Е. coli MG1655
под биологически соответствующие условия сравнивали с синтетического пептида WLBU2 и ceragenin CSA-13. Это исследование показывает, что CSA-13, в отличие от LL-37 и WLBU2 пептидов, поддерживает сильную бактерицидную активность в присутствии муцина и после предварительной инкубации с пепсином при низком рН. Эти условия представляют собой уникальные проблемы, связанные с H. Pylori
лечения, так как эти бактерии в желудке защищены от кислой среды толстым слоем слизи и эффективность многих антибактериальных препаратов значительно уменьшается при низких значениях рН [31]. Соответственно, первая эффективная терапия для H.pylori,
инфекция представляет собой сочетание относительно рН-нечувствительным антимикробных препаратов, таких как висмут, тетрациклин и метронидазол [33]. Кроме того, как желудок периодически опустошает его содержание (местное лечение, как правило, разбавленный и размытые) вывод, что CSA-13 обладает бактерицидной активностью при значительно более низкой концентрации, то LL-37, после того, как то же самое время инкубации (3-6 часов) [11], предполагает, что CSA-13 может иметь терапевтический потенциал для лечения H. Pylori
инфекции. Антибактериальная активность CSA-13, которая имеет меньший чистый заряд и уникальное распределение этого заряда по стероидного помост по сравнению с МР-37 и WLBU2 пептидов, также было установлено, менее ингибируется муцин, выделенный из слизистой оболочки желудка. Терапевтический потенциал основан на способности CSA-13 для ликвидации H. Pylori
также поддерживается ранее сообщалось, антибактериальной активностью в отношении других штаммов бактерий, в том числе клинических изолятов синегнойной
[21] и золотистого стафилококка
[22]. Уникальная способность CSA-13, чтобы поставить под угрозу целостность бактериальной мембраны и химической природы этой низкой молекулярной массы соединения, которое транслирует снизить стоимость синтеза по сравнению с катионными антибактериальных пептидов предполагают, что CSA-13 или, возможно, другие ceragenins имеют потенциал для лечения H. пилори
инфекции, в том числе вызванных ее резистентных штаммов.
Заключение
бактерицидную активность ceragenin CSA-13 поддерживается после того, как Преинкубационной в искусственном желудочном соке и в присутствии муцина. Эта оценка в пробирке
указывает на значительный потенциал этой молекулы в лечении желудка через слизистую оболочку инфекции.
Методы
Антибактериальные средства
LL-37 (NH <суб> 2-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-COOH) и WLBU2 ( NH <суб> 2-RRWVRRVRRWVRRVVRVVRRWVRR-COOH) пептиды были приобретены у Bachem (Король Пруссии, PA). CSA-13 получают, как описано ранее [34]. Амоксициллин (АМХ), кларитромицин (CLR), тетрациклин (ТЕТ) и метронидазол были приобретены у компании Sigma.
Коллекция слизистой оболочки желудка и желчных образцов
Во время гастроскопии, осуществляется с применением GIF V2 или Q145 (Olympus) гастроскоп, несколько ломтиков слизистой оболочки желудка были взяты из prepyloric и корпусная областей желудка. H. Pylori
инфекция была установлена ​​в образцах биопсии с использованием уреазный тест (CLO-тест). Человеческой желчи был получен из желчного пузыря у больных, перенесших холецистэктомию. Образцы стерилизовали с помощью фильтра через мембрану 0,45 мкм перед тем, как разбавленный в PBS (1: 1) и смешивают с антибактериальными агентами, используемых в бактериях умерщвления анализах. Исследования были одобрены Медицинским университетом Комитета по этике Белосток по изучению человека и животных, и все пациенты дали письменное информированное согласие на участие в исследовании.
Иммуногистохимического исследования
были выполнены иммуногистохимические исследования на формалин фиксированной, paraffin- внедренные слизистой оболочки желудка человека участки с помощью кроличьей анти-LL-37 антитела (H-075-06, использовали в разведении 1: 100, Phoenix Pharamceuticals Inc.). Парафиновые материалы рассекают толщиной до 5 мкм и плавал по дистиллированной воде при температуре 45 ° C. Затем срезы смонтированы на салазках и помещают в 57 ° C в печи в течение ночи. Срезы депарафинизировали в соответствии со стандартными процедурами и гасили 0,9% пероксида водорода в метаноле в течение 30 минут. Срезы инкубировали с первичным антителом при 37 ° С в течение 60 мин, затем промывали 1% -ным PBSA (1% BSA в PBS), и подвергали связывания с вторичным антителом (биотинилированным козьим антителом против кроличьего IgG, разведение 1: 400). Амплификацию проводили с помощью набора Vectastain ABC, и система обнаружения HRP, использовалась для колокализуются пероксидазной активности с ДАБ. Срезы подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином. Образцы были просмотрены с помощью Nikon Eclipse 80 микроскопа при 40-кратном увеличении.
Оценка MIC и МВС
минимальной ингибирующей концентрации (MIC) обычных антибиотиков против семи различных клинических изолятов H. Pylori
(9 × 10 8 КОЕ /мл) определяли с использованием Мюллер-Хинтон агар (MH), содержащий 5% овечьей крови. Инкубирование продолжают в течение 4 дней при 35 ° С в условиях микроаэрофилии поддерживается с использованием газового пакета-Campylobacter газогенерирующей комплект BR60. Клинические изоляты антихеликобактерной
считались устойчивыми к соответствующим антибиотикам, когда значения МИК были выше 4 мкг /мл для AMX, 1 мкг /мл для CLR и 16 мкг /мл для ТЕТ и метронидазол. Минимальная бактерицидная концентрация (МБК) антибактериальных агентов оценивали с использованием посевного материала при 10 8 КОЕ /мл. После 6-часовой инкубации при 37 ° С, 10 мкл аликвоты суспензии были замечены на Колумбийский агар с добавлением овечьей кровью (5%).
Бактерии, убивающие анализ
Бактерицидные деятельности LL-37, WLBU2 пептиды и ceragenin CSA-13 против Е. coli MG1655
в присутствии муцина или пепсин из свиных слизи (Sigma) и желчи человека измеряли, как описано ранее [35]. Бактерии выращивали до середины логарифмического при 37 ° С (контролируется при оценке оптической плотности при длине волны 600 нм) и ресуспендировали в PBS-буфере (рН = 7,4). Бактерии суспензии затем разбавляют в 10 раз в 100 мкл растворов, содержащих антибактериальные агенты сами по себе или с муцина (1000 мкг /мл), или желчи (конечные 1:10 желчи разведение имитирует окружающую среду верхних отделах тонкой кишки, в которую желчь секретируемый [36] (рН = 7,4)). В другой серии экспериментов Антибактериальное действие этих компонентов определяли после их предварительной инкубации в искусственном желудочном соке [36, 37] при рН ~ 1,5 с и без пепсина (0,5 мг /мл). После инкубации бактерии с антибактериальными молекулами в течение одного часа при 37 ° С, бактериальные суспензии помещали на лед и разбавленный 10 до 1000- раза. Порции каждого разведения (10 мкл) наносили на LB-Агар пластин для культивирования в течение ночи при 37 ° С. Число колоний при каждом разбавлении подсчитывали на следующее утро. В колониеобразующих единиц (КОЕ /мл) отдельных образцов определялись из коэффициента разбавления.
Масс-спектрометрия
Аналитическую характеристику проводили на CSA-13 и МР-37 суспензий после 3H инкубации с пепсином (0,5 мг /мл) при низком значении рН (~ 1,5) при 37 ° с, используя Shimadzu (Columbia, MD), инструмент (система ЖХ-МС состоит из системы доставки растворителя LC-20ab и СИЛ-20А автоматической пипетки в сочетании с двойной длины волны УФ-Вид детектор и один квадрупольный масс-спектрометр ЖХ 2010EV), в сочетании с колонки Шимадзу Premier С18 (150 мм × 4,6 мм внутренний диаметр, 5 мкм размер частиц). Подвижная фаза Скорость потока 1 мл /мин с начальным отношением 90% подвижной фазы А (воды) и 10% подвижной фазы B (ацетонитрил) и 0,1% (об /об) муравьиной кислоты. Аналитический метод состоит из следующих этапов: (I) ввода пробы и выдерживания при 10% B в течение 5 мин, (II) линейный градиент от 10% до 90% B в течение 15 мин, (III), проведение на 90% В в течение 5 мин, (IV) изократическая шагом на пути к 10% B и удерживание в течение 5 минут до следующей инъекции образца. Масс-спектрометрия проводилась на элюента с использованием ионизации электрораспылением (ESI) в положительном режиме ионов с отсканированной диапазоне m /z от 160-2000.
Лизис клеток красных кровяных
гемолитической активности LL-37, WLBU-2 и CSA-13 (0-200 μ
г /мл), против человека красных кровяных телец (эритроцитов) была протестирована с использованием эритроцитов, взвешенных в PBS. РБК получали из свежей крови (гематокрит ~ 5%) инкубировали в течение 1 ч при 37 ° С после добавления молекул испытаний. Относительная концентрация гемоглобина в супернатантах после центрифугирования при 2000 х г контролировали путем измерения оптической плотности при 540 нм. 100% гемолиз был взят из образцов, в которых 2% -ного Тритона Х-100
для культивирования клеток
желудка человека клетки аденокарциномы. (ATCC, CRL-1739) поддерживали в DMEM (Biowhittaker) культуры, дополненной 10% тепла -inactivated фетальной бычьей сыворотки (Hyclone) при температуре 37 ° С и 5% СО <суб> 2. Для анализа высвобождения ЛДГ и клетки оценки микроскопа высевали в 24-луночные планшеты и выращивали до слияния. Во всех экспериментах, среду заменяли на не содержащей сыворотки среды ~ 12 ч до обработки клеток с LL-37, WLBU2 и CSA-13 (0-200 мкг /мл) в отдельных лунках, в течение 1 часа. Среда для культивирования клеток затем собирали, центрифугировали (10 минут, 5000 оборотов в минуту, RT) и подвергали оценке ЛДГ (ЛДГ-цитотоксичности Kit; BioVision Inc.)
декларациях
Выражение признательности
Эта работа была поддержана NIH грант HL067286 и Медицинский университет Белостока предоставляет 3-22458F и 3-18714L
Авторы 'оригинальные представлены файлы для изображений изображения Ниже приведены ссылки на авторов оригинала, представленных файлов для изображений. 'Исходный файл для фигурного 1 12866_2009_858_MOESM2_ESM.pdf Авторского 12866_2009_858_MOESM1_ESM.pdf авторов исходного файла для фигурного 2 12866_2009_858_MOESM3_ESM.pdf Авторского исходного файла для фигурного 3 12866_2009_858_MOESM4_ESM.pdf авторов исходного файла для фигурного 4 исходного файла 12866_2009_858_MOESM5_ESM.pdf Авторского на рисунке 5 Конкурирующие интересы
Д-р P. Savage является платным консультантом Ceragenix Pharmaceuticals, Inc. врожденного иммунитета, и WittyCell. Ни в одном из исследований сообщалось в данной работе, не была поддержана Ceragenix Pharmaceuticals или любым другим юридическим лицом. Другие авторы: никто не объявлять
.

• Оценка прохождения Lactobacillus gasseri K7 и бифидобактерий из желудка в кишечник с использованием модели единственны…
• Шар-окклюзированы ретроградной трансвенозная облитерации для желудка варикоза: взаимосвязь между клиническ…