Протеом анализ человеческого желудка кардии аденокарциномы с помощью лазерного захвата микродиссекции

Протеом анализ человеческого желудка кардии аденокарциномы с помощью лазерного захвата микродиссекции
Аннотация
Справочная информация
Заболеваемость желудка сердца аденокарциномы (GCA) растет в последние два десятилетия в Китае, но молекулярные изменения, связанные с канцерогенеза не были хорошо охарактеризованы.
Методы
в этом исследовании мы использовали сравнительный Протеомические подход к анализу злокачественная и доброкачественная кардиального отдела желудка эпителиальные клетки, выделенные с помощью лазерного захвата навигация микродиссекции (LCM) из спаренных хирургических образцов человеческого ВКА.

Результаты Двадцать семь пятен, соответствующих 23 белков были последовательно дифференцированно регулируется. Было показано, что повышающей регуляции пятнадцать белков, в то время как восемь белков было показано, понижающей регуляции в злокачественных клетках по сравнению с доброкачественными столбчатых эпителиальных клеток. Выявленные белки, как представляется, участвуют в обмене веществ, компаньонки, антиокислительные, трансдукции сигнала, апоптоза, пролиферации клеток и дифференцировки. Кроме того, выражение HSP27, 60 и Prx-2 в образцах GCA были дополнительно подтверждены с помощью иммуногистохимических и вестерн-блот анализ.
Заключение
Эти данные указывают на то, что сочетание МДК с навигацией 2-DE обеспечивает эффективную стратегию для обнаружения белков, которые дифференцированно выражены в ВКА. Такие белки могут внести свой вклад в выяснении молекулярных механизмов канцерогенеза GCA. Кроме того, комбинация обеспечивает потенциальные клинические биомаркеров, которые помогают в ранней диагностике и обеспечить потенциальные терапевтические цели.
Справочная информация
Различные анализа данных о заболеваемости раком, взятые из западных стран, показали, быстро растущие темпы аденокарциномы пищевода и кардиального отдела желудка в за последние несколько десятилетий, по сравнению со стабильными и снижением ставок по пищеводу плоскоклеточного рака (SCC) и дистальной аденокарциномы желудка (DGA) [1-3]. Это явление также проявляется в Китае, за исключением того, что увеличение числа случаев кардии аденокарциномы (GCA) появляется заметно выше, чем заболеваемость раком пищевода. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что GCA является идеальной отправной точкой клиническое юридическое лицо, как его патогенез и факторы риска сильно отличаются от DGA. Поэтому, GCA является гораздо более распространенным, с более высокой частотой метастазирования узла лимфы и неблагоприятным прогнозом, чем DGA [4]. Ежегодная заболеваемость GCA составляет 50/100000 и может быть даже выше, чем 190/100000 в ряде регионов Китая [5]. Относительно бессимптомный характер на ранних стадиях заболевания и отсутствием адекватных скрининговых тестов привели к большинству пациентов с диагнозом ОКС быть в уже запущенной стадии заболевания. Таким образом, необходимо понять молекулярный механизм канцерогенеза и выявления биомаркеров для ранней диагностики и эффективного лечения человека ВКА.
Недавно протеом стала комплемент компонента генома. Предположение о том, что это может существенно помочь в разгадке биохимические и физиологические механизмы сложных многофакторных заболеваний на функциональном молекулярном уровне. Хотя генетические мутации и /или экспрессии гена странствующих может лежать в основе заболевания, биохимические основы для большинства заболеваний вызваны дефектами белка. Таким образом, анализ глобального изобилия белка в опухолях человека, называется рак протеомика, может предложить много возможностей и проблем в выявлении новых опухолевых маркеров и терапевтических целей, а также в понимании патогенеза опухолей. В настоящее время двумерным гель-электрофорез (2-DE) и масс-спектрометрии (МС) являются наиболее широко применяются инструменты для выделения и идентификации белков. Однако гетерогенность всегда беспокойство в исследованиях ткани опухоли человека. Хотя клеточная культура является одним из подходов, чтобы преодолеть эту проблему, она не может точно отражать молекулярные события, происходящие в реальной ткани, из которой они были получены [6]. Сравнение между линиями клеток простаты человека и опухолевых клеток из тех же пациентов, показали, что 20% из профилей белка были изменены [7]. Лазерный захват микродиссекция (МДК) является недавнее развитие, которое может быть использовано для приобретения весьма представительную субпопуляции клеток из сложных образцов гетерогенных тканей [8]. Эта технология была успешно использована в разнообразных исследованиях с использованием нисходящего анализа на уровне ДНК и РНК, включая экспрессию глобального гена профилированию [9] и анализ протеома простаты [7], толстой кишки [10], гепатоцеллюлярный [11 ], молочной железы [12], а также опухоли поджелудочной железы [13]. Тем не менее, сочетание 2-DE и MS никогда не был применен к изучению человеческого ВКА.
Это исследование направлено очертить канцерогенез ВКА и выявления GCA-специфических заболеваний ассоциированных белков в качестве потенциальных клинических биомаркеров для раннего выявления и новые терапевтические цели. Мы выполнили переключение между которыми осуществляется LCM, чтобы обогатить как злокачественные и доброкачественные эпителиальные желудка сердечные клетки из спаренных хирургических образцов человеческого ВКА. Белки, выделенные из этих клеток были разделены на 2-DE. Дифференциальная белковые пятна были идентифицированы с помощью пептидной массового отпечатка пальца (ИМП) на основе матричной лазерной десорбцией /ионизацией времени пролета масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) и поиска в базе данных. Справедливость этих выводов была подтверждена иммуногистохимических и Западно-блоттинга.
Методов
Материалы
IPG полосы (рН 3-10) и нелинейное буферных растворов IPG (рН 3-10) нелинейное были приобретены у Amersham Pharmacia Biotech (АПБ, Швеция). ДТТ, мочевины, тиомочевины, Трис-основание, ТХ-100, CHAPS, глицин, акриламид, метиленбисакриламид, ДСН, TEMED, персульфат аммония, нитрат серебра, трипсина (секвенирование сорта), ACN, и ТФК были приобретены у Sigma (Сент-Луис, MO, USA). И, наконец, полный ингибитор протеазы коктейль из Roche (Lewes, UK). класс воды Milli-Q использовали для всех решений.
GCA образцов
Девять пар человеческого желудка кардии аденокарциномы и прилегающие к ним ткани nontumourous кардии были получены в течение 30 минут после хирургической резекции на второй филиал больницы Си " университете Цзяотун в 2005 году (Таблица 1). Для того чтобы избежать очевидных областей язвы или некроза, образцы были закуплены у краев опухоли. Они были немедленно заморожены в жидком азоте и хранили при -80 ° С до использования. Информированное добровольное согласие было получено от всех пациентов. В то же время, два опытных патологи оценивали градация опухоли с помощью микроскопического исследования samples.Table 1 клинических и гистологических данных образцов опухолей пациентов
Case

Age

Gender

Locationa)

Size(cm)

Grade

1
58
M
Within 2 см GEJ
1,5 × 2
Умеренно дифференцированный страница 2 63
M
В 2 см GEJ
5 × 6
Умеренно дифференцированный
3
46
M
в 2 см GEJ
4 × 5
умереннодифференцированная 4
60
M
в течение 2 см GEJ
2 × 2.5
хорошо дифференцированы страница 5 из 73
M
В 2 см GEJ
3 × 1
хорошо дифференцированы
6
70
M
в пределах 2 см GEJ
2 × 1
хорошо дифференцированы
7
55
M
в 2 см GEJ
2 × 3
Плохо дифференцированный
8
51
M
в 2 см GEJ
4 × 6
малодифференцированных
9
63
M
в пределах 2 см из GEJ
3 × 2,5
малодифференцированных
а) Расположение: эпицентр опухолевой ткани
подготовка образца для LCM
секций (8 мкм толщиной) были вырезаны на слайдах (предварительно очищенные с помощью моющего средства, промывают деионизованной водой, и погружают в этаноле) с использованием Leica CM 1900 криостата (температура в камере -28 ° C). Срезы либо хранили при -80 ° C или храниться в криостат камере до LCM. Гематоксилином окрашивание проводилось только для мониторинга срезов ткани и не был использован в сочетании с LCM. Срезы фиксированных (70% этанола в течение 1 мин), гематоксилином окрашивали и обезвоженная (70% этанола в течение 45 с, 95% этаноле в течение 45 секунд, 2 × 100% этаноле в течение 30-х годов, и с последующим ксилола 2 × в течение 5 мин). В то же время, неокрашенные участки были использованы для LCM. Они фиксировали (70% этанола в течение 30-х годов), промывают в деионизированной воде в течение 10 секунд, и обезвоженный (70% этаноле в течение 15 секунд, 95% этаноле в течение 15 секунд, 2 × 100% этаноле в течение 15 секунд, а затем в ксилоле, 2 × в течение 1 мин ). Полное коктейль ингибиторов протеаз таблетки

LCM, переме- После фиксации и обезвоживания, неокрашенные срезы сушили на воздухе и микродиссекции с использованием системы Арктур ​​PixCellα (Арктур, Mountain View, CA, USA). LCM микроскопа удалось запечатлеть гематоксилином окрашивали секцию, примыкающий к одной из интереса. Это изображение было отображено на экране компьютера с помощью LCM LCM анализа изображений программное обеспечение (Арктур, США) и был использован в качестве карты, чтобы разграничить область для рассечения на соседней неокрашенной секции. Срезы затем получены с помощью 15 мкм лазерного луча диаметром обычно при 50-80 мВ мощности с длительностью импульса 3-10 мс в режиме автомата и с частотой лазерного обжига 1 выстрела на 500 мс. В среднем, между 10000-12000 выстрелы были взяты в кепке, и приблизительно 25000-30000 клетки были получены на колпачке. Каждый колпачок был взят в плен в течение одного часа. На основании тщательного анализа гистологических участков, каждый из рассечение, по оценкам, содержит ≥ 95% требуемых клеток.
Микродиссекция колпачки были вставлены в 0,5 мл микроцентрифужных пробирках, содержащих 50 мкл лизирующего буфера (7 М мочевина, 2 М тиомочевины, 4% вес /об CHAPS, 65 мМ ДТТ, 0,5% об /VTX-100, 40 mMTris-Base, и полный ингибитор протеазы коктейль). Затем клетки солюбилизировали путем инверсии труб с последующим вихре-смесительной в течение 1 мин и короткого импульса-центрифугирования при 12 000 × г. Затем ткани из нескольких крышек (около 800000 ~ 1000000 клеток) экстрагировали в том же буфере для лизиса до тех пор, пока достаточное количество материала было собрано. Образцы центрифугировали при 40000 х г в течение 1 ч при 4 ° С. Там, где это необходимо, супернатанты хранили при -80 ° С до дальнейшего использования. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорда.
2-DE
Первая одномерная изоэлектрического фокусировки (ИЭФ) проводилась по системе Pharmacia Immobiline IPG DryStrip (Упсала, Швеция). Для первого измерения электрофореза образцы, содержащие 60 мкг белка для гелей анализа разводили до 250 мкл с помощью раствора регидратации (7 М мочевины, 2% вес /об CHAPS, 50 мМ ДТТ, 0,5% об /об буфера ИПГ (рН 3-10 нелинейный), и проследить бромфеноловый синий) перед загрузкой на 13 см IPG полос (pH3-10 нелинейных). ИЭФ Затем проводили с помощью электрофореза блок IPGphor в соответствии с инструкциями изготовителя. После этого полоски уравновешивали раствором (6 М мочевины, 30% об /об глицерина, 2% вес /объем SDS, и 50 мМ Трис-HCl, рН 8,8), уменьшается с 1% вес /объем ДТТ в течение 15 мин и алкилируют 2,5% вес /об иодацетамидом в течение 15 мин. Полоски затем промывали в буфер для электрофореза (25 мМ Трис-основание, 192 мМ глицина и 0,1% вес /об SDS), фиксируемого в 11% акриламидных гелей и скреплено расплавленную агарозу (0,5% вес /об агарозы в электрофорез буфере, содержащем след бромофенолового синего). SDS-PAGE проводили с использованием Hoefer SE 600 вертикальных камер и Трис-глицин буфер (25 мМ Трис и 192 мМ глицина), содержащего 0,1% вес /об SDS, с начальным разделением при постоянной 10 мА /гель в течение 30 мин с последующим 20 мА /гель. Второй одномерная SDS-PAGE был разработан, пока маркер синий краситель бромфениловый не достигли дна геля. Общее время работы обычно составлял от 4 до 4,5 часов. Гели фиксировали в 10% об /об уксусной кислоты, 40% об /об этанол до того сенсибилизации в течение 30 мин в буфере, содержащем 30% об /об этанол, 0,2% вес /об тиосульфат натрия и 0,83 М ацетата натрия. За этим последовало три 15 мин промываний в деионизированной воде. Белки затем окрашивали 0,1% вес /объем нитрата серебра в течение 20 мин, дважды промывали в деионизованной воде в течение 1 мин, и разработаны в 2,5% вес /объем карбоната натрия, содержащего 0,04% об /об формальдегида (37% раствор). Развитие останавливали с помощью 1% об /об уксусной кислоты и гели промывали три раза в воду.
Анализ изображений и статистический анализ
Umax ImageScanner (Amersham Biosciences) использовали для сканирования гелей, в то время как изображения Master ™ 2D Платиновый версии программного обеспечения 5.0 (Amersham Biosciences) использовали для обнаружения пятна, количественной оценки и согласования. Интенсивность каждого пятна количественно оценивали по объему%. Затем данные были проанализированы с помощью SPSS для Windows, 11.5 и Excel. Стьюдента
-test была использована для анализа различий в уровнях белка между ОКС и неопухолевых образцах, с уровнем достоверности 95%.
MALDI-TOF-MS и поиск в базе данных
Последовательно и существенно отличается точек, выбранных для анализа методом MALDI-TOF MS. Белковые пятна, представляющие интерес, вырезают и измельчали ​​на мелкие кусочки, после чего Обесцвечивание и промывки деионизированной водой несколько раз до тех пор, пока желтый цвет исчез. Кусочки геля затем промывали 25 мМ бикарбоната аммония, обезвоживается с ACN, и сушили в вакуумной центрифуге. Затем белки в геле, расщепляли 0,02 мкг /мкл трипсина в течение ночи при 37 ° С. Трипсинизированном пептиды затем повторно растворяли в растворе, содержащем 50% об /об ACN и 0,2% об /об трифторуксусной кислоты. А 2 мкл аликвоты наносили на образец пластины с 4 мкл матричного раствора СГТА (а-циано-4-hydroxcinnamic кислоты, 10 мг /мл в 50% об /об ACN, 0,2% об /об TFA) и оставляли на воздухе сухой. Высушенные пятна затем анализировали в Voyager DE MALDI-TOF MS (Framingham, MA, USA). За этим последовали работы спектрометра в режиме положительных ионов, а также в режиме отражателя со следующими параметрами: ускоряющее напряжение 20 кВ; Грайд напряжения, 94%; Проволочный направитель напряжение, 0,01%; и задержка 200 нс. Спектры были получены вручную с помощью интенсивности лазерного излучения, установленной на 3200 с 80 кадров в спектре. Тогда диапазон масс был установлен между м /г

500 и м /г

5000. Внутренняя калибровка была применена с использованием ангиотензина II и инсулина B пиков цепи на 912.08 Da и Da 3495.95 соответственно.
Белки были идентифицированы с помощью пептидной массовой дактилоскопии с помощью поисковой программы Aldente [14] с применяются следующие параметры поиска: Swiss-Prot и TrEMBL были использованы в качестве базы данных последовательностей белков; массовый допуск 100 частей на миллион и один неполный расщепление было разрешено; carboxyamidomethylation, окисленный метионин и фосфорилирования рассматривались в качестве возможных модификаций; минимальное количество совпавших пептидов было 4; и пептид был ион [M + H] +.
Иммуногистохимическая и вестерн-блот анализ
Чтобы проверить паттерны экспрессии трех белков в тканях GCA, иммуногистохимия проводили с использованием фиксированных формалином и парафин ткани образцы, которые были совпадающая с 2-DE образцов. Депарафинизации 5 мкм срезы толщиной обрабатывали 0,3% пероксидазой водородом в течение 3 мин и с блокирующим антителом в течение 30 мин. После извлечения антигена тепла опосредованную срезы инкубировали с первичным антителом при 4 ° С в течение ночи следующим образом: Hsp27 (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1: 500; HSP60 (Santa Cruz, Америка), 1: 300; и Prx-2 (Santa Cruz, Америка), 1: 150. Затем срезы инкубировали с пероксидазой меченого антитела (1: 500)., Разработанный с diaminobenzine и контрастному окрашиванию гематоксилином
Для Вестерн-блот-анализа, образцы белка (30 мкг), используемые в 2-DE запускались на 12% SDS-PAGE, переносили на ПВДФ-мембраны, а затем блокировали PBS /5% обезжиренного молока /0,01% твина в течение 2-4 часов при комнатной температуре. Первичные антитела разводили в блокирующем буфере и был добавлен следующим образом: HSP27, 1: 200; HSP60, 1: 300; и Prx-2, 1: 200. Затем смесь инкубируют с пероксидазой хрена (HRP) вторичное антитело и конъюгированным с пероксидазой хрена анти-GAPDH /бета-актин антитела для подтверждения равной нагрузки белка в каждой дорожке в течение 1-2 часов при температуре 37 ° С или при комнатной температуре. Образцы были промыты и обнаруженные с усиленной хемилюминесценции в течение 30-60 с (Minipore).
Результаты
Профиль различия между образцами LCM можно перемещаться и целые undissected тканей криостата
Чтобы оценить эффекты LCM на управление судном профилей белок ткани, мы провели 2-DE белковые профили целых undissected тканей криостата и LCM-образцов ВКА. На рисунке 1 показан пример процесса LCM навигацией. Большинство пятен, обнаруженных в рассеченных неопухолевых и опухолевых тканей может наблюдаться в целом undissected тканей криостата, в течение нескольких пятен, за исключением. Тем не менее, есть еще некоторые пятна, обнаруженные в целом undissected криостата ткани, которая не может наблюдаться в обоих образцах LCM. Таким образом, эта технология может не только обогатить неопухолевые и опухолевые эпителиальные клетки, но может также уменьшить загрязнение в тканях, таких как гемоглобин [10, 11]. Кроме того, процесс LCM навигация может устранить эффекты окрашивания на разделения белков от 2-DE [15]. Таким образом, наши данные подтверждают необходимость выполнения LCM переключение между которыми осуществляется в протеомных исследованиях тканей GCA. Рисунок 1 лазерного захвата, переме- микродиссекции опухолевой ткани. (A) гематоксилином-окрашивали кардии аденокарциномы; (B) Необработанный GCA ткани; (C) опухолевая ткань после микродиссекции; (D) Захваченные опухолевых клеток на LCM пленки.
Профиля различия в экспрессии белка между тканями GCA и окружающими тканями неопухолевыми
Мы провели навигацию LCM и 2-DE для согласованных пар опухолевых тканей и прилегающих к нему не- различных гистологических GCA. Приблизительно 800-1000 белковые пятна были обнаружены путем окрашивания серебром. Для измерения воспроизводимости, каждый образец прошел эксперимента три раза. Были 905 ± 74 и 867 ± 51 белковых пятен на карте ВКА и неопухолевой желудка сердечной ткани, соответственно. Согласованные пятна были 799 ± 29 и 727 ± 34 отдельно, и соответствующая средняя скорость согласования была 88,2% и 83,8%. Кроме того, среднее отклонение позиции совпавших точек была 1,031 ± 0,205 мм и 1,44 ± 0,11 мм в направлении ИНП и SDS-PAGE, соответственно. Хотя анализ изображений показал, что эти 2-DE карты воспроизводились, были небольшие различия в интенсивности и количества пятен. Тем не менее, анализ гелей показал 27 белковых пятен, интенсивность существенно различались и последовательно между неопухолевых и опухолевых тканей (рис. 2). были вычислены отношения нормированных интенсивностей точечных рака paraneoplasis тканей для каждого из белков, представляющих интерес. были выбраны; Пятна, показывающие разницу в два раза и со статистической значимости (0,05 р &л). Три из результатов 2-DE были подтверждены анализы иммуногистохимическое и вестерн-блот. Рисунок 2 2-DE карта злокачественной и незлокачественной кардии ткани. Все карты, показанные получают из того же самого пациента. (А) 2-DE карта целых undissected тканей криостата; (В) 2-ДЕ карта неопухолевой ткани после LCM; (C) 2-DE карта GCA ткани после LCM. Идентификация
Протеин
Оба целых undissected образцов криостата и LCM-образцов были использованы для идентификации белков. Двадцать семь различных белковых пятен между тканями GCA и окружающими тканями неопухолевыми вырезают. Тем не менее, только 23 белки идентифицировали с помощью MALDI-TOF-MS (таблица 2). Это явление, вероятно, связано с пост-трансляционных модификаций, таких как пероксиредоксин 1 (Prx-1), которая присутствовала в двух соседних точках (рис. 2, 11) спот. Эти белки были классифицированы ни в одну из следующих функций: пролиферации и дифференцировки клеток (ANXA2, ANXA4, hnRNPA2 /B1), апоптозе (Prx-1, PRX-2, ГСТП, VDAC, ETFB), метаболизм (ADH1C, akr1c3, CA2, GATM ), протеазы, связанные (КПУР, PACSIN1), cystoskeleton (актин 1, кератина 8), наставники (Hsp27, 60, 70, PDIA3) и связывания РНК и транскрипции (hnRNPH3, PCBP1, ENO1). На рисунке 3 показаны карты PMF из HSP60.Table 2 белков с дифференциальной экспрессии между GCA опухолевых тканей и прилегающих к ним тканей спаренных неопухолевыми были идентифицированы с помощью MALDI-TOF MS
Up-регулирование белки

Пятно No.
Protein
Присоединение No.A)
Mr /ПИБ)
матча
COV (%) с)
T-тест
Рацион (опухоль /неопухолевой) Средства ± SD
1
белка теплового шока бета-1 (Hsp27) *
P04792
23 /6,0
9
54
0,0040
3,4279 ± 2,0727 страница 2 из теплового шока 70 кДа белка 5 (HSP70)
P11021
70 /5,0
22
42
0,0030
3,2597 ± 1,5314 страница 3 из 60 кДа белок теплового шока (HSP60) *
P10809
58 /5,2
12
37
0,0001
2,8308 ± 1,1426 4
Белок дисульфид изомеразы A3 (PDIA3) *
P30101
54 /5,6
13
41
0,0280 4,2105
± 2.7294 страница 5 аннексина A4 (ANXA4)
P09525
36 /5,8
10
34
0,0140
4,7153 ± 7,3434
6
аннексина A2 (ANXA2)
P07335
38 /7,5
7
26
0,0150
6,0722 ± 5,5431
7
Гетерогенные ядерные рибонуклеопротеиды A2 /B1 (hnRNP A2 /B1 ) *
P22626
37 /9,0
16
43
0,0050
10,7775 ± 9,5547
8
катепсина D тяжелой цепи (КПУР)
P07339 <бр> 27 /5,6
12
61
0,0012
4,3552 ± 3,7703
9
протеинкиназы с и казеин киназы субстрата в нейронах белок 1 (PACSIN1)
Q9BY11
51 /5.1 страница 5 из 24
0,0028
2,6026 ± 1,2147
10
глутатион S-трансферазы P (ГСТП) *
P09211
23 /5,4
5
44
0,0026
3,8757 ± 2,2198
11
пероксиредоксин-1 (Prx-1) *
Q06830
22 /8,3
8
59
0,0140
4,2744 ± 4,1568
12
поли (РЦ) -связывающим protein1 (PCBP1) *
Q15360
37 /6.7
12
63
0,0070
2,7401 ± 0,5321
13
Альдо-кето-редуктазы семьи 1member C3 (akr1c3)
P42330
37 /8,1
7
25
0,0040
2,7762 ± 1,1820
14
Glycineamidinotransferase (GATM)
P50440
44 /6,4
8
23
0,0390
2,7839 ± 0,4680
15
кератина, тип II цитоскелета 8 (кератина 8) *
P05787
54 /5,5
9
25
0,0020
3,5063 ± 0,6423
понижающую регуляцию белки
16
актиновых , цитоплазматические 1 (актин 1) *
P60709
42 /5.3
6
30
0,0160
0,2603 ± 0,1539
17
гетерогенные ядерные рибонуклеопротеиды H3 (hnRNPH3)
P31942
37 /6.4 страница 5 из 28
0,0015
0,6028 ± 0,6229
18
пероксиредоксин-2 (Prx-2) *
P32119 <бр> 22 /5,7
6
24
0,0250
0,2376 ± 0,1202
19
углекислый anhydrase2 (CA2) *
P00918
29 /6.8
6
33
0,0130
0,3675 ± 0,1270
20
Альфа-энолаза * (ENO1)
P06733
47 /7,0
16
42
0,0030
0,2898 ± 0,1340
21
Алкогольдегидрогеназа 1C (ADH1C)
P00326
40 /8,6
7
49
0,0280
0,2287 ± 0,1680
22
перенос электрона флавопротеид субъединица б (ETFB)
P38117
28 /8,3
6
26
0,0240
0,2655 ± 0,1415
23
зависящие от напряжения анион -селективной канал (VDAC) *
P21796
31 /8.6
7
39
0,0120
0,4474 ± ​​0,0297
а) Swiss-Prot, присоединение нет.
б ) Теоретическое значение
с) охват Последовательность%
* белки были обнаружены при раке желудка ранее.
Рисунок 3 идентификации MALDI-TOF MS спот 3 в ВКА.
Иммуногистохимическая и вестерн-блоттинга для HSP 27, 60 и Prx-2 в ВКА
для дальнейшего изучения ли HSP27, 60 и Prx-2 выражаются в тканях и определить, какие клетки экспрессируют эти белки, иммуногистохимический анализ проводили с использованием фиксированных формалином и paraffin- встроенные образцы ткани, которые были совпадающая с 2-DE образцов. Экспрессия HSP27 и 60 можно было увидеть во всех цитоплазм карциномы клеток, в то время как можно было увидеть в некоторых из цитоплазм столбчатого эпителия (рис. 4A-D) в неопухолевых тканях. В противоположность этому, PRX-2 было почти не обнаружено, экспрессируется в клетках карциномы, а в некоторых из цитоплазм столбчатых эпителиальных клеток (рис. 4E, F). Для того, чтобы исследовать эти уровни экспрессии белка, вестерн-блот-анализ проводили также с использованием тех же тканей (рис. 5). Как и ожидалось, было обнаружено, что последовательно высоким уровнем экспрессии в опухолевой ткани, HSP27 и 60, в то время как Prx-2 был подавлен. Рисунок 4 Анализ Иммуногистохимическое для HSP27, 60 и Prx-2 в нормальной человеческой кардии и GCA. Выражения HSP27 (А), 60 (С) и Prx-2 (Е) находились в цитоплазме опухолевых клеток; Выражения HSP27 (B), 60 (D), и Prx-2 (F) были обнаружены в цитоплазме нормальных столбчатых эпителиальных клеток; Увеличения: A-F × 40, контрастно гематоксилином
Рисунок 5 Вестерн-блот-анализ для подтверждения повышенную экспрессию HSP27, 60, а также снижение экспрессии Prx-2 в тканях GCA.. . GAPDH и β-актина были использованы в качестве ссылок
Обсуждение
Кардии является анатомическое пограничья между пищеводом и желудком; следовательно, существует постоянная полемика по поводу их отношений с точки зрения эпидемиологии, клинических признаков и классификации среди аденокарциномы пищевода (EA), GCA и DGA. Для того, чтобы сравнить их профили белков, мы искали литературу, чтобы найти эти белки. Тринадцать из 23 белков были найдены в DGA ранее (таблица 2). Среди них, HSP27, 60, 70, PDIA3 и CA2, имеют один и тот же паттерн экспрессии в ВКА и DGA. В отличие от этого, выражение низкого уровня HSP27 был найден в EA [16-20]. Поэтому tumourigenesis из ВКА отличается от EA и DGA, и, таким образом, GCA должен быть отдельным патологическая сущность.
Клеточная гетерогенность является существенным барьером для молекулярного анализа нормальных и пораженных тканей. Впервые описан Эммерт-Бака и др. в 1996 году, лазерный захват микродиссекции представляет собой мощный и точный метод, используемый для изучения изменений белка в определенное подмножество клеток в системе с низким уровнем обслуживания, который прост в эксплуатации [8]. Как обычно, различные гистохимические пятна секции ткани используются для управления процессом рассечение. Тем не менее, несколько случаев показали умеренное к драматическим эффектам окрашивания на разделения белков с помощью 2-DE [21, 22]. Для устранения окрашивания в качестве потенциального вредного воздействия, переключение между которыми осуществляется LCM был разработан в последнее время. Он использует окрашивали раздел для руководства рассечение неокрашенных смежных образца [23]. Этот метод был успешно применен при исследовании образцов мозга [15]. Кроме того, из-за характерных морфологических признаков желудочного сердца поверхностного столбчатой ​​клетки и сердечной железы, их легко идентифицировать на обезвоженном секции без окрашивания. Таким образом, навигация стала LCM оптической стратегией в нашем подходе протеомики. В этом исследовании, количество LCM полученных доброкачественных и злокачественных клеток существенно различались и часто были малы по сравнению с целыми undissected тканей криостата, несмотря на профили, которые были очень похожи между образцами LCM и undissected из них. Это указывает на то, что LCM может перемещаться быть возможным подходом для изучения желудочной ткани сердца и что она совместима с 2-DE и MALDI-TOF MS.
Мы получили профиль белка ВКА путем сравнения изменения в белке профили окружающих неопухолевые тканей. Чтобы уменьшить индивидуальные различия, образцы тканей были получены из того же самого пациента, что позволяет нам изучить дифференциальную экспрессию белка в подобной геномной фоне. Насколько нам известно, мы уже сообщали, первый Протеомические анализ ВКА. Из 27 отобранных белковых пятен, 23 белков в молекулярной массе от 15 до 75 кДа и с изоэлектрической точкой в ​​диапазоне от 3 до 10 были идентифицированы с помощью 2-DE и MALDI-TOF MS. Большинство из этих белков были описаны ранее, как дифференцированно выражены либо на уровне мРНК, либо на уровне белка в других типах рака человека.
HSPs представляют собой группу стрессовых белков, индуцированных различными типами окружающей среды и патофизиологических инсультов. В этом исследовании, совместно вверх-правила HSP27, 70 и 60 были обнаружены в желудочном сердечной ткани опухоли. Как наставниками, HSP27 и HSP70 может ингибировать апоптоз путем взаимодействия с апоптосома и каспазы активационного комплекса [24], лежащие в основе их роли в опухолевой прогрессии и резистентности к лечению [25]. Многочисленные исследования показывают, что HSP27 и HSP70 overexpressions сигнал плохой прогноз и предсказать слабый ответ на химиотерапию. HSP60, как представляется, ключевой эндогенный медиатор воспаления и предположительно выпущен поврежденными клетками. Кроме того, вместе с HSP70, HSP60 играет определенную роль в презентации антигена при злокачественных заболеваниях [26]. HSPs также избыточно экспрессируется при раке молочной железы, толстой и прямой кишки, желудка и рака предстательной железы [10, 25]. Таким образом, повышенная экспрессия HSP27, 70 и 60 может быть полезным биомаркеров для канцерогенеза в ВКА и могут быть связаны со степенью дифференцировки и прогноза GCA.
Среди идентифицированных белков, два белки участвуют в регуляции транскрипции и экспрессия опухолеассоциированными генов. PCBP1, повышающей регуляции в ВКА, является РНК-шаперона пост-транскрипционного регулятора. Было показано, что PCBP1 вместе с РТВ-1 и hnRNPK, управляет некоторыми прото-онкогенов генов и экспрессии генов связанных с апоптозом, такие как сумка-1, C-
Мус, Apaf-1, XIAP и DAP5, путем стимулирования активности внутреннего сегмента входа рибосомы (IRES). PCBP1 требуется, чтобы открыть РНК в области, содержащей окно ввода рибосом, в то время как РТВ-1 может потребоваться для рибосом набора [27, 28]. В последнее время, Пикеринг, B.M. и другие. описано, что гликановые части PCBP1 могут быть связаны с метастатической способности и может играть определенную роль в гепатоцеллюлярной карциноме метастазирования [27]. Тогда повышающая регуляция PCBP1 может регулировать кэп-независимый механизм инициации трансляции сердечных опухолеассоциированными генов в развитии ВКА. В качестве опухолевого супрессора, альфа-энолаза может регулировать активность промотора с-Мус в виде с-Мус связывающего белка (MBP-1). MBP-1 может затем привязать к элементу P2 в промоторе с-Мус и конкурировать с ТАТА-бокс-связывающего белка (ТВР) для подавления транскрипции с-Мус [29, 30]. С другой стороны, понижающую регуляцию Альфа-енолазы в соответствии с работой Чанг Ю.С. и др.

• Клиническая значимость паллиативной гастрэктомии на выживаемость больных с неизлечимым раком желудка: сист…
• МикроРНК-645, повышающей регуляции в человеческом adencarcinoma желудочного пищеводного перехода, ингибирует апопто…