Plos ONE: Deregulacija med miR-29b /c in DNMT3A je povezana z epigenetsko utišanje CDH1 gena, ki vplivajo mobilni migracije in invazijo v želodcu Cancer

Povzetek

de-regulacije družine miR-29 in DNK metiltransferazo 3A (DNMT3A) povezan z rakom želodca (GC). Hkrati pa povečuje dokazov kaže miR-29b /c mogel urediti DNA metilacije z usmerjanjem DNMT3A, da trenutno ni znano, če epigenetsko utišanje pokoj-29b /c je preko promotor hypermethylation v GC povzroča nenormalna izražanje DNMT3A. Tako smo želeli oceniti, ali obstaja predpis cross-talk med miR-29b /c in DNMT3A in ali je povezan z malignim fenotipa v PK. Prvič, celjenje ran in Transwell testi so pokazali, da miR-29b /c zatira tumorskih metastaz v GC. Luciferaza reporter testom dokazali, da je DNMT3A neposredna tarča miR-29b /c. Uporabili smo bisulfita genomsko zaporedje analizirati stanje DNA metilacijskega miR-29b /c. Odstotek metiliranih CpGs je bistveno zmanjšala, DNMT3A osiromašeni celic v primerjavi s kontrolno skupino. Poleg tega je bila udeležba DNMT3A v spodbujanje migracij GC celic, povezane z promotor metilacija posredovano zatiranja CDH1. V 50 parnih vzorcev kliničnih GC tkiva, zmanjšal miR-29b /c je pomembno povezana s stopnjo diferenciacije in invazijo celic in je v negativni korelaciji s DNMT3A izražanja. Skupaj naši predhodni rezultati kažejo, da se po postopku lahko sodelujejo v GC tumorigeneze. miR-29b /c zatira dolvodno gen DNMT3A je, in posledično se miR-29b /c zavirajo DNMT3A v metilacijskega odvisni način DNA. De-ureditev oba miR-29b /c in DNMT3A vodi do epigensko utišanje CDH1 in prispeva k metastaziranje fenotipa v GC. Ta ugotovitev kaže, da je DNA metilacija povezana utišanje miR-29b /c ključnega pomena za razvoj GC in tako je lahko terapevtska tarča

Navedba. Cui H, Wang L, Gong P, Zhao C, Zhang S Zhang K, et al. (2015) Deregulacija med miR-29b /c in DNMT3A je povezana z epigenetsko utišanje CDH1 gena, ki vplivajo mobilni migracije in Invasion želodčnega raka. PLoS ONE 10 (4): e0123926. doi: 10,1371 /journal.pone.0123926

Akademska Urednik: Rajeev Samant, University of Alabama v Birminghamu, UNITED STATES

Prejeto: 4. september 2014; Sprejeto: 9. mar 2015; Objavljeno: 15 april 2015

Copyright: © 2015 Cui et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v papir in njene dodatne informacije datotek

Financiranje:. To delo je podprl Nacionalni Natural Science Foundation Kitajske (Grant No. 81171915, št 91229107 in številka 81472548), http: //www .nsfc.gov.cn /. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca (GC) je druga najbolj usodna malignosti po vsem svetu. To skupaj znaša približno 1 milijon novih primerov in 0,7 milijona smrti letno, od tega več kot 70% zgodi v državah v razvoju, zlasti v vzhodnoevropskih državah Azije [1]. Čeprav je ozdravljiv, če odkrije zgodaj, so pri večini bolnikov GC diagnozo pozni fazi bolezni. Pri bolnikih z operabilnim boleznijo, so navedene običajne kirurgija in kombinirani kemoterapijami. Vendar pa je skupna 5-letna stopnja preživetja bolnikov GC je manj kot 30% [1, 2]. Predvsem je GC pogosto spremlja peritonealno razširjanje in metastaze v regionalnih bezgavkah in oddaljenih organih prek limfnih in venskih plovil [3]. Tako lahko prepoznavanje molekularnih aberacije v GC izboljšati naše razumevanje želodca rakotvornosti in nam pomagajo razdelijo bolnikom v biološko in klinično pomembnih podskupinah, kakor tudi razvoj novih terapevtskih strategij.

MicroRNAs (miRNAs) so skupina endogenih, majhna, nekodiran regulativne RNA za približno 20-25 nukleotidov, ki negativno uravnavajo izražanje genov z zaviranjem prevod ali inducira razgradnjo mRNA preko bazne pare z neprevedene regije 3 '(3'UTR) ciljnega messenger RNA (mRNA) [4]. Spremenjene vrednosti izraz za miRNAs so poročali o številnih oblik raka in povzroči odklonskega izražanja tarčnih genov, ki vplivajo na maligni vedenje, kot je širjenje, odpornost na apoptozo in metastaz [5-7]. Povečanje dokazi kažejo, da deregulirati miRNAs (npr miR-17, miR-129, miR-148a, in miR-378) prispeva k želodčne rakotvornost [8-10], ki kažejo, da bi se lahko miRNAs uporablja kot diagnostičnih in prognostičnih biomarkerjev v GC .

družina miR-29 (MIR-29s) je ohranjeni družina miRNAs ki vključuje miR-29a /b /c. Zmanjšano ekspresijo MIR-29s je opisana v več vrst raka, vključno z GC [11-14]. Prejšnje študije kažejo, da MIR-29s igrajo dominantno vlogo v GC celične proliferacije, napredovanju celičnega cikla, apoptoze in celične gibljivosti [14, 15]. Potencialne tarče MIR-29s, ki prispevajo k malignim GC fenotipa vključujejo CDC42, CCND2 in MMP2 [14, 15]. Poleg tega so nekatere študije identificirati pokoj-29s, kot prispevajo k urejanju metilacije DNA z usmerjanjem DNMT3s na pljučnega raka [13]. Poleg tega so poročali tudi več ciljnih genov, kot TCL-1, CDK6, laminin-1, in MCL-1, v drugem raka [16]. Predvsem, kljub dokazom, ki dokazuje, Mirna-29s lahko deluje kot tumor-zaviralnih genov, eno ključno vprašanje, ki se nanaša na Mirno-29s izražanja še vedno delno rešene. Kateri so mehanizmi nadzora Mirne-29s izražanja v GC celic? Ugotovljeno je bilo, da je c-myc vpleten v miR-29a /b represijo [17]. Prepoznavanje dodatne mehanizme blaženje je zanimiv.

Znano je, da je transkripcijski utišanje zaviralnih genov (ZTP), ki jih CpG otoku hypermethylation pogost znak rakotvornost. Zanimivo je, da podobno, ki kodirajo proteine ​​ZTP, precejšnje število miRNAs ureja promotor metilacije [18-20]. Dejansko je prišlo do večje število študij, ki kažejo, da se tumor supresorski miRNAs, kot so pokoj-34b, MIR-129, in pokoj-124, ki se pogosto zatrejo metilacije DNA GC [21-23]. Na podlagi analize programa CpG Island iskalca, naša napoved je pokazala, da miRNA-29b /c vsebuje CpG otokov v svojih domnevnih promoter regije. Vendar pa ni jasno, ali odklonski DNK hypermethylation obračunava disregulacijo miR-29b /c. Poleg tega je znano, ali obstaja predpis povratno med miR-29b /c in DNMT3s. Pravzaprav je ne Prejšnja študija preučila metilacijskega statusa pokoj-29b /c v GC celicah, in nihče, so raziskovali odnos med metitiranjem miR-29b /c in ravni izražanja DNMT3s. V tej študiji smo ugotovili, da miR-29b /c zatreti ekspresijo DNMT3A z usmerjanjem njeno 3'UTR, ki je prispevalo k inhibicije migracije GC celic in invazijo. Po drugi strani pa DNMT3A navzdol regulirano miR-29b /c preko odklonske hypermethylation promotorja. Tako obstaja potencialna povratna zanka med miR-29b /c in DNMT3A, pri kateri navzdol ureditev miR-29b /c odpravlja zatiranje DNMT3A. Medtem, up-regulacija DNMT3A vpliva na izražanje miR-29b /c promotor metilacije. Te ugotovitve kažejo na presluh med miR-29b /c in DNMT3A. Njihova neravnovesje in deregulacija je razlog, ki ga epigenetskega mehanizma, ki bi bil lahko vključen v migracijskih in invazijo značilnosti GC celic.

Materiali in metode

celične kulture

GC celičnih linij, vključno AGS in BGC-823, so bili pridobljeni iz celic banke kitajske akademije znanosti in vzdržujejo v RPMI-1640 medij z dodatkom 10% fetalnega govejega seruma (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 U /ml penicilina in 100 mg /ml streptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA), v vlažnem inkubatorju s 5% CO _{2 atmosferi pri 37 ° C.}

vzorce tkiva

50 parov GC tkiv in njihove sosednje osebki, ki niso rakasto tkivo so bili zbrani med letoma 2011 in 2013 iz bolnišnice Jiangning Nanjing. Klinični podatki bolnikov z GC je prikazan v tabeli S1. Študija je odobril odbor za etični pregled raziskav v bolnišnici Jiangning Nanjing na Kitajskem, in bolniki podpisali premišljene oblike soglasij. Vsi vzorci so tkiva so bili pridobljeni pri bolnikih z GC. Ti so bili zbrani med operacijo in takoj hitro zmrznili v tekočem dušiku, dokler RNA in beljakovin ekstrakcijo.

Povratne prepisu reakcijo in kvantitativno PCR v realnem času (qPCR)

Total RNA je bila vzeta iz celic in tkiva, pridobljene z uporabo TRIzola reagenta (Invitrogen, Carlsbad, CA), v skladu z navodili proizvajalca.

za odkrivanje Mirna izraz, steblo-zanka RT-PCR smo izvedli, kot je opisano prej [24], in U6 majhne RNA je bila uporabimo kot notranjo kontrolo. qPCR je bila izvedena s pomočjo SYBR premiks Ex Taq (Takara, Dalian, Kitajska), v skladu s protokolom proizvajalca. Relativna izraz je bila ocenjena z metodo primerjalne CT. V začetnih oligonukleotidov zaporedja vsakega gena so prikazane v S2 tabeli.

Western blot

Western blots smo izvedli s pomočjo anti-DNMT3A (Abcam, Cambridge, Velika Britanija), anti-CDH1 (Abcam, Cambridge, UK), anti-vimentina (santa Cruz Biotechnology, santa Cruz, CA, ZDA) in anti β
P-aktinski protitelesa (Sigma, Ronkonkoma, NY, ZDA), in odkrivanje je bilo izvedeno s Super signalov kemiluminiscentnim substrata (Pierce, Rockford, IL, ZDA).

Transfekcija

miR-29b /c posnema /inhibitorji in negativne molekule nadzor (nadzor scramble posnemajo in zaviralec) so bile sintetizirane in očistimo, ki jih GenePharma Company (Shanghai, Kitajska). Sekvence so prikazane v tabeli S2. So bili transfektiramo v celice s končno koncentracijo 50 nM ob uporabi Lipofectamine-2000 transfekcijske reagenta (Invitrogen, Carlsbad, ZDA) po protokolu proizvajalca. Gojišče smo spremenili po 6 urah. Celice kultiviramo 48 ur in nato pobrane za analizo. Učinkovitost odstotek transfekciji je bila določena z oceno ravni miR-29b /c izražanja ali rasklapanje po transfekcije (S1A in S1B Sl). Protokol za določitev DNMT3A stabilne rasklapanje celic je bila opisana v našem dosedanjem delu [25]. Izraz DNMT3A močno zmanjšala v celicah BGC-shDNTM3A in AGS-shDNTM3A (S1C sl) v primerjavi s kontrolnimi celicami.

celjenje ran, migracije in invazijo testi

mobilnost Cell je presojalo rana zdravilni analiza vsebnosti kot je opisano predhodno [26]. Praska rana je bila ustvarjena s pomočjo 200 ul vrh pipete na monosloje konfluentnih celic v šestih vdolbinami. Celice smo nato izprali s svežim medij za odstranjevanje plavajočih celic in po 48 urah opazili širjenje zapiranja rane in fotografirali pod mikroskopom. Potencial za migracije in invazije transficiranih celic je ocenjevala Transwell testom. Celice smo gojili do 70% sotočju in transfektirali 24 ur z miR-29b /c posnema ali nadzora posnema, in inhibitor miR-29b /c inhibitor ali nadzor. V migracijske testu so bile celice gojimo v 200 ml medija z 1% fetalnega govejega seruma v zgornji komori vložkom niso prevlečena transwell. V spodnji komori, smo 600 ml medija s 10% fetalnega govejega seruma uporabimo kot chemoattractant spodbuditi migracijo celic. V invazijo testu je bila zgornja komora med transwell vložkov prevlečena z 50 ml 1,0 mg /ml Matrigel, celice zasadimo v zgornji komori Študiie obložena transwell vložka (Millipore, ZDA) z. Po 24-urni inkubaciji brez prehajajo ali celice, ki niso iz preplavljajo previdno odstranimo z vato. Vse celice smo obarvali z uporabo 0,1% kristal vijolično obarvanje in prešteti v 5 poljih pod obrnjen mikroskopom. Neodvisne poskuse smo ponovili trikrat.

Bisulfite genomsko sekvenciranje (BGS)

Genomsko DNA smo ekstrahirali iz celic z uporabo metode fenol-kloroform. Bisulfit Zdravljenje je opravila CpGenome Universal DNK Sprememba Kit (Millipore, ZDA) po navodilih proizvajalca. PCR izdelki za bisulfita sekvenciranje so gel-očistimo in subkloniramo v vektorski sistem pMD19-T (Takara, Dalian, Kitajska). Vsaj deset kolonije zaporedje oceniti stopnjo metilacije na vsakem mestu CpG. Primerji so navedene v tabeli S2.

luciferaza reporterski vsebnosti

protokol za luciferaza reporterskega testa je je bilo prej opisano [14]. 3'UTR človeškega DNMT3A bil PCR pomnožili in kloniramo med straneh nisem in Xba I PGL-3 (Promega, ZDA). Celice BGC-823 smo nanesli pri gostoti 5 x 10 ^{5 na jamico v 12 vdolbinicami pred transfekcije. Celice smo transfektirali z PGL-3 kresničkina luciferaza poročevalce (1 pg na vdolbinico), PRL-TK (50 ng na jamico) in miR-29 posnema /inhibitor (50 nm) ali negativne kontrole posnema /inhibitorji (50 nm) z uporabo Lipofectamine- 2000 transfekciji reagent (Invitrogen, Carlsbad, ZDA) po protokolu proizvajalca. Luciferazno aktivnost smo testirali 48 ur po transfekciji z uporabo Dual-luciferazno aktivnost preskusnega sistema (Promega, ZDA). Vsi eksperimenti so bili izvedeni kot treh neodvisnih ponovitvah.}

Statistična analiza

Neodvisni Student je t
-test smo uporabili za primerjavo rezultatov, ki so izražene kot povprečje ± sd med katerima koli dvema vnaprej izbranimi skupinami. Za določitev korelacije med spremenljivkami, Pearson
je koeficient korelacije smo izračunali. A P
-vrednost manjša od 0.05 smo imeli statistično značilno.

Rezultati

miR-29b /c je potrebna in zadostna za migracije GC mobilni

Prejšnje študije kažejo, da je miR-29b /c ključnega pomena za GC celic invazijo. Naj nadalje oceni, ali je miR-29b /c odgovoren za migracije GC celica, in vitro
praske celjenje ran test in Transwell test smo opravili. Po prehodno transfekcijo MIR-29b /C posnema ali negativno kontrolo v celicah BGC-823 se je rana zdravilne testa so pokazali, da so celice s prisilnim ekspresije miR-29b /c pokazali predvsem počasnejše okrevanje v primerjavi s kontrolnimi celicami (sl 1A). Podobno Transwell migracije testa so pokazali, da je prekomerno miR-29b /c povezana z bistveno manj migracije kot kontrole ( P
< 0,05, slika 1B). Poleg tega je v skladu z drugimi podatki v HGC-207 in MGC-803 GC celic [14], MIR-29b /c Čezmerno celice pokazale tudi znatno zmanjšanje invazivno sposobnost v poskus vdora v Matrigel za ( P
<0,05, slika 1C). Ti rezultati kažejo, da je miR-29b /c ni pomembno le za GC celično invazijo, ampak tudi za migracijo celic. Nadalje potrjujejo omejevalno učinke miR-29b /c o migraciji GC celic in invazije, so bile celice BGC-823 začasno transfektiramo s inhibitorjev miR-29b /c ali negativno kontrolo. Črtanje pokoj-29b /c znatno povečal migracijskih in invazivne zmogljivosti GC celic, ki je bila ocenjena s celjenje ran (slika 1D) in Transwell testu ( P
< 0,05, slika 1E in slika 1F). Kolektivno, ti rezultati kažejo, da miR-29b /c dejansko odpravljena migracije in invazije GC celic, ki tako prispeval k zgodnjih fazah malignega napredovanja GC.

DNMT3A je neposreden cilj transkripcijski miR-29b /c v GC

Da bi razumeli mehanizem, ki je podlaga za posledico miR-29b /c na celični migraciji in invazije, smo raziskovali cilje miR-29b /c. DNMT3A 3'UTR dopolnjuje miR-29b /c in je neposredna ciljni gen miR-29b /c, s čimer smo izvedli reporterskega testa v BGC-823 celicah. DNMT3A mRNA 3'UTR je bil vstavljen v regiji nižji stopnji za luciferazni reporterski gen iz vektorja PGL-3 (sicer DNMT3A 3'UTR-Luc). Konstrukti so bili nato kotransfektiramo s PRL-TK in miR-29b /c posnema ali negativne kontrole posnema v celicah BGC-823. Kot je prikazano na sliki 2A, je relativna luciferazno aktivnost znatno zmanjšana v vektorjih PGL-3 z DNMT3A 3'UTR ( P
< 0,05). Vendar konstrukti kotransfektiramo z zaviralcem /c miR-29b ni vplivala na luciferazno aktivnost vektorjev PGL-3 z DNMT3A 3'UTR primerjavi s konstrukti kotransfektiramo z negativno kontrolo inhibitor (Slika 2B). Da bi še dodatno potrditev tega miRNA ciljno interakcije, smo izvedli kvantitativno RT-PCR (QRT-PCR) in zahodni blots potrditi ureditev DNMT3A z miR-29b /c. Smo začasno transfektirali MIR-29B /C posnema ali negativni kontrolni posnema v celicah BGC-823. Povečana miR-29b /c zmanjšala izražanje DNMT3A na mRNA (slika 2C) in koncentracije proteina (slika 2e, lane1-3). Nasprotno, MIR-29b /c navzdol uredbe z njeno zaviralec povečala izraz DNMT3A na mRNA (slika 2D) in koncentracije proteina (slika 2e, lane4-6). Kolektivno, te ugotovitve kažejo, da je DNMT3A neposredna transkripcijski cilj miR-29b /c in je negativno povezana z miR-29b /c izražanja v GC celicah.

miR-29b /c zavirajo DNMT3A je z DNA metilacija odvisna od načina

Glede na to, da je zmotno hypermethylation ključnega pomena za miRNA navzdol uredbo, smo predvidevali, da obstaja negativna povratna informacija med miR-29b /c in DNMT3A. Da bi preverila to hipotezo, je bila prisotnost CpG otoku metilacije v miR-29b /c promotorja regiji ocenili z analizo BGS v-DNMT3A rasklapanje celic. Kot je prikazano na sliki 3A, 7 posameznih mest CpG znotraj CpG otoške regije (5 kb gorvodno od pokoj-29b /c), je bilo razvrstiti, da prepoznajo metiliranih ostankov citozina. Pogostost miR-29b /c promotorja metilacije v DNMT3A-razgradljiv celicah je bila 34,2%, kar je znatno nižji od kontrolnih celicah (58,6%; slika 3B). Ta rezultat kaže, da je transkripcijski utišanje miR-29b /c v GC celicah povezano s prisotnostjo CpG otoka hypermethylation, ki je bila potrjena z merjenjem zrel MIR-29b /c ga QRT-PCR. Tam se je znatno povečal miR-29b /c izraz v celicah AGS-shDNMT3A in BGC-shDNMT3A v primerjavi z njihovimi kontrole (slika 3c). Te ugotovitve kažejo pomembno molekularno osnovo za miR29-b /c navzdol regulacija in podpirajo hipotezo, da je cross-talk med miR-29b /c in DNMT3A.

DNMT3A spodbuja migracijo GC celic

molekularna povezava med miR-29b /c in DNMT3A postavljeno vprašanje o vpletenosti DNMT3A migracijskih GC celic. nadalje smo uporabili in vitro
teste za določitev funkcionalnih sprememb v vedenju celic naslednje spremenjeno izražanje DNMT3A. Analizni Celjenje ran pokazala predvsem počasnejše okrevanje v BGC-shDNMT3A celic v primerjavi s kontrolnimi celicami (slika 4A, vrh), vendar samo skromno okrevanje v AGS-shDNMT3A celic v primerjavi s kontrolnimi celicami (slika 4A, spodaj). Ti rezultati kažejo, da je DNMT3A pomembna za mobilnost celic. Glede na to, da so celične adhezijske molekule pomembna za celično gibljivost, so izraz CDH1 in vimentina pregledal QRT-PCR in zahodni blot. Rasklapanje od DNMT3A izražanja znatno povečala ekspresijo CDH1 na obeh stopnjah mRNA in beljakovin, vendar ni imel izreden učinek na ekspresijo vimentina (slika 4B in 4C), kar kaže, da je lahko CDH1 tarča DNMT3A posredovano disregulacijo celice gibljivost. Poleg tega smo izvedli BGS test na gena CDH1 v-DNMT3A rasklapanje celic. Kot je prikazano na sliki 4D je odstotek metiliranih CpGs nahajajo znotraj CDH1 v-DNMT3A osiromašenega celic nižja kot pri kontrolnih celicah (35,8% v primerjavi z 94,1%). Ti rezultati kažejo, da je nenormalen izraz DNMT3A vodi epigenetsko utišanje CDH1.

miR-29b /c sodeluje pri zatiranju CDH1

Da bi še dodatno raziskati vpliv spremenjeni miR- 29b /c izraz na CDH1, smo začasno transfektirali miR-29b /c posnema ali negativno kontrolo posnemajo v BGC-823 celic. V primerjavi s kontrolami, prisilno izraz pokoj-29b /c znatno povečal izražanje CDH1 na ravni mRNA in koncentracije proteina (slika 4E in 4f). Kasneje se je preverila stanje metilacija promotorja regiji CDH1 uporabo BGS testa v pokoj-29b /c posnema ali negativne kontrole na posnemajo prehodno transfekcije BGC-823 celic. Rezultati so pokazali, da je bila frekvenca CDH1 promotor metilacije v /c čezmernim celic miR-29b 5,2% ali 12,9%, kar je znatno nižja od ravni, izmerjena v kontrolnih celicah (88,2%; slika 4G). Ti podatki so skladni s posledico, da DNMT3A rasklapanje jih posreduje up-ureditev CDH1 in dokazuje, da so de-ureditev miR-29b /c in DNMT3A vključeni v migraciji GC celic in invazije.

Zmanjšano izražanje miR-29b in miR-29c v GC tkivih

izraz miR-29b /c v 50 GC tumorjev in seznanjenih non-tumorskih tkivih je pregledal QRT-PCR. V primerjavi z paru brez tumorskih tkiv, pogostost miR-29b in miR-29c navzdol ureditev (definirano kot večji kot dvakratno znižanje) je bila 66% (33/50) in 60% (30/50), zaporedju (slika 5A in 5B). Povprečna sprememba krat miR-29b in pokoj-29c je bilo v tumorskih tkivih bistveno nižji kot pri ne-tumorskih tkivih ( P
< 0,01, slika 5C in 5D). Raziskati clinicopathological pomen miR-29b in miR-29C vzorcev izražanja v GC tumorigeneze so bili analizirani klinične značilnosti bolnikov GC. Vse 43 bolnikov analizirane so bile razdeljene v dve skupini glede na pokoj-29b in stopnjah izražanja miR-29c. Zmanjšana miR-29b je močno povezana s stopnjo diferenciacije tumorskih celic in invazije, medtem ko se je MIR-29C korelaciji le z invazijo tumorja (tabela 1). Poleg tega je bilo razmerje med miR-29b /c izražanja in DNMT3A izražanja testirali v 33 primerih GC. Združenje študija je pokazala, da je bila DNMT3A izraz negativni korelaciji s pokoj-29b ( R
= -0,640, P
< 0,01, slika 5E) in miR-29c ( R
= -0,349, P
< 0,05, slika 5F). Kolektivno, ti podatki kažejo, da miR-29b /c lahko igrajo pomembno vlogo pri napredovanju želodca rakotvornost.

Pogovor

ohranja miR-29 družine, vključno s pokoj-29a, miR- 29b in miR-29c, ki je vpleten v več kletnih procesi, kot so proliferacija, diferenciacija, apoptoza in metastaze, zaradi česar so dobro analizirati, družina miRNAs v tumorigeneze [16]. Prejšnje študije so pokazale, da povečano izražanje pokoj-29a je povezana z boljšimi splošne stopnje preživetja v fazi II bolnikov z rakom debelega črevesa [27] in nižja raven pokoj-29b lahko spodbudi nastanek raka prostate metastaze, ki ga ureja epitelijskih-mezenhimskih prehodnih signalnih poti [28] . Poleg tega miR-29c deluje kot metastaz supresorski, ki preprečuje sprijemanje pljučni rak celic na zunajcelični matriks in migracije in vitro
in in vivo
[29]. V GC, znatno zmanjša raven pokoj-29b in pokoj-29c, zlasti pa so bili v primerjavi s pokoj-29a [14] ugotoviti, kar pomeni, da lahko miR-29b /c igrala bolj pomembno vlogo. Tako je miR-29b /c izberemo za analizo v tej študiji. V tej študiji smo pokazali povečano miR-29b /c zavira migracije in vdor BGC-823 celic z uporabo celjenje ran testa in Transwell testa. Ti rezultati so skladni z drugimi sporočenih podatkov, pridobljenih iz SGC-7901, HGC-27 in MGC-803 GC celic [14, 15]. Glede na to, da miR-29b /c prav tako igrajo vlogo pri širjenju in apoptoze v GC, smo ocenili sposobnost celične rasti in stopnje celične apoptoze v BGC-823 celic. Rezultati so pokazali, da ni razlike v širjenju na 48 ur za miR-29b /c posnema ali zaviralci-transfektiranih celic, v primerjavi z negativnimi kontrolnimi celic ( P
> 0,05, S2A in S2B slika). Poleg tega aneksin-V obarvanje niso pokazale dramatično povečanje ravni apoptoze v miR-29b /c posnema-transfekciji celic po 48 urah inkubacije (S2C sl). Poleg tega analiza celični cikel pokazala nobenih pomembnih razlik v G1, S, G2 /M fazi po zdravljenju s pokoj-29b /c posnema ali negativne kontrole posnema za 48 ur ( P
> 0,05, S2D fig). Ti podatki kažejo, da upočasni miR-29b /c rane okrevanje območje na 48 ur, predvsem zaradi zmanjšane celične gibljivosti sposobnosti.

miRNAs izvajajo svoje naloge predvsem z usmerjanjem na 3'UTRs različnih genov. Vendar pa se podrobna molekularne mehanizme miR-29b /c, povezane z maligno razvoj GC slabo razumljen. Predvsem miR-29b /c na isto dopolnjevanje mest v 3'UTR DNMT3A, ki ga je napovedal po programih ciljne napoved vključno TargetScan, Miranda in miRBase. Pa še ni znano, ali miR-29b /c ureja nenormalno metilacije genov, povezanih z metastazami z interakcijo z DNMT3A med razvojem GC. Zato smo izvedli luciferazno reporterskega testa in ugotovili, da je bila ekspresija visoka DNMT3A povezan z nizkimi miR-29b /c izražanja v GC celicah, kar kaže DNMT3A je neposredna transkripcijski cilj miR-29b /c. Vendar molekularne osnove, ki vodi do neravnovesja v pokoj-29b /c v GC ostaja neznan. miR-29 proksimalne predlagatelji imeli veznih mest za več transkripcijskih faktorjev, kot je c-myc in CEBPA, ki prispevajo k deregulaciji pokoj-29s [30, 31]. Vendar pa niso poročali raziskave o epigenetske ureditvi miRNA-29s.

V evkariontskih celicah, obstajajo tri encimsko aktivne metiltransferaz DNA (DNMTs), DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. Izraz DNMT3A v GC je bistveno višja od DNMT3B [32, 33]. Poleg tega se je povečala le izraz DNMT3A značilno povezana s krajšim obdobjem preživetje brez bolezni v PK [34], kar kaže DNMT3A ima bolj pomembno vlogo pri želodčnem rakotvornost. Tako smo želeli raziskati, ali obstajajo predpisi negativno povratno zanko med miR-29b /c in DNMT3A. V tej študiji smo uporabili BGS testa za analizo stanja DNA metilacijskega miR-29b /c v DNMT3A RNAi GC celic. Dejansko je bila zmanjšana miR-29b /c delno zaradi DNMT3A posredovano hypermethylation. Poleg tega smo potrdili, da je DNMT3A sodeluje pri spodbujanju migracije GC celic preko navzdol regulacijo CDH1. Medtem pa smo tudi pokazali, da je miR-29b /c vpleten v zatiranje CDH1. Zaščitni znak raka metastaz je izguba CDH1 izražanja [35], in hypermethylation v CDH1 promotorja regiji je opaziti tudi v GC [36]. Tako so naši rezultati kažejo, da sta oba miR-29b /c in DNMT3A povezana z CDH1 navzdol ureditve skozi DNMT3A posredovano promotorja hypermethylation. Vloga drugih DMNTs, na primer DNMT3B, pri urejanju MIR-29B /treba preučiti v prihodnjih študijah c.

V GC osebkov, smo pregledali izraz vzorec miR-29b /c na 50 parov GC tkiva. Zmanjšana miR-29b /c (raztegljiv sprememba cutoff: 2,0) je bistveno povezana z diferenciacije in invazijo stopnje v PK, kar kaže, da je /c ima miR-29b ključno vlogo pri GC malignega vzdrževanje in neposredno kaže na klinični pomen miR -29b /c na napredovanje GC. Skratka, naša raziskava kaže, da lahko pride do cross-talk med miR-29b /c in DNMT3A. Neravnovesje teh dejavnikov se lahko vključijo v GC migracij in invazijo fenotipov. To neravnovesje lahko vključuje izraz nizke ravni Mir-29b /c lahko odpravijo zatiranje DNMT3A in visoke stopnje DNMT3A dodatno vpliva na izražanje pokoj-29b /c po epigenetskega mehanizma. Te ugotovitve lahko koristna za razvoj novih možnosti zdravljenja za GC, ki ciljajo na miR-29b /c in svoje prodajne genov DNMT3A.

Podpora Informacije
S1 Sl. Učinkovitost je odstotek transfekcijo bila zagotovljena z oceno ravni miR-29b /c ali DNMT3A.
(A in B) QRT-PCR smo izvedli za zaznavanje relativnega izraz miR-29b /c v BGC 823 celicah s posnema (A) ali inhibitorjev (B) po 48-urni transfekciji. (C) RT-PCR in zahodni blots so bile izvedene za ugotavljanje učinkovitosti DNMT3A rasklapanje v BGC in AGS celic. β
P-aktinski smo uporabili kot kontrolo nakladanje
doi:. 10,1371 /journal.pone.0123926.s001
(IOD)
S2 Sl. Vloga pokoj-29b /c v BGC-823 celic orožja, apoptozo in celičnem ciklusu.
(A) Stopnje rasti celic Mir-29b /c prekomerno so odkrile CCK-8 proliferacije. miR-29b /c prekomerno ni pokazala neverjetno razliko v 48 urah v primerjavi z negativnimi kontrolnimi celicami ( P
> 0,05). (B) Stopnje rasti celic Mir-29b zaviranja /c so odkrile CCK-8 proliferacije. Zatiranje miR-29b /c ni pokazala bistvenih sprememb na 48 ur v primerjavi z negativnimi kontrolnimi celicami ( P
> 0,05). (C) Apoptoza test ne kaže dramatično indukcijo apoptoze z miR-29b /c prekomerno v 48 urah v primerjavi z negativnimi kontrolnimi celicami. Biparametric histogram prikazuje celico v začetku leta (spodnjem desnem kvadrantu) in pozno apoptotične države (zgornji desni kvadrant). (D) Preizkus celica ciklus smo izvedli s pretočno citometrijo na BGC-823 celic po miR-29b /c posnema ali negativne kontrole posnema zdravljenja 48 ur. Odstotki miR-29b /c čezmernim ali kontrolnih celicah v G1, S in G2 /M so prikazani v baru grafikonu kot povprečje ± s.d. treh neodvisnih eksperimentov. V primerjavi s kontrolnimi celicami, ni bilo pomembnega vpliva na celičnega ciklusa po miR-29b /c prekomerno
doi:. 10,1371 /journal.pone.0123926.s002
(IOD)
S1 Metoda. rast celic in apoptoza test
doi:. 10,1371 /journal.pone.0123926.s003
(DOC)
S2 Metoda. . Celični ciklus Test
doi: 10,1371 /journal.pone.0123926.s004
(DOC)
S1 tabeli. Klinične značilnosti bolnikov z rakom želodca
doi:. 10,1371 /journal.pone.0123926.s005
(DOC)
S2 tabele. . MiRNA posnemajo in zaviralec sekvenc in primerji, ki se uporabljajo v tej študiji
doi: 10,1371 /journal.pone.0123926.s006
(DOC)

Priznanja

Zahvaljujemo se dr Gang Chen iz Nanjing Jiangning Bolnišnica za zbiranje vzorcev. Zahvaljujemo se prof Sheng Zhong iz Medical University Capital za pomoč, da spremeni rokopis.

• Plos ONE: Chrysin Zavira tumorje-Promotorski povzročena MMP-9 Expression z blokiranjem AP-1 preko zatiranju ERK in JNK Poti v želodcu raka celic
• Plos ONE: Vpliv izkoreninjenje Helicobacter pylori na ekspresivnih nivojev FHIT, IL-8 in P73 v želodčne sluznice prvostopenjske Sorodniki Rak želodca bolnikov