PLOS ONE: Déréglementation entre miR-29b /c et Dnmt3a est associée à épigénétique Silencing du CDH1 Gene, affectant la migration cellulaire et l'invasion dans gastrique Cancer

Résumé

Le de-régulation du miR-29 famille ADN méthyltransférase et 3A (Dnmt3a) est associée à un cancer gastrique (CG). Tout en augmentant la preuve indique miR-29b /c pourrait réguler méthylation de l'ADN en ciblant Dnmt3a, il est actuellement inconnu si le silençage épigénétique de miR-29b /c via promoteur hypermethylation en GC est causée par une expression anormale de Dnmt3a. Ainsi, nous avons cherché à évaluer si la réglementation diaphonie existe entre miR-29b /c et Dnmt3a et si elle est associée à un phénotype malin en GC. Tout d'abord, la cicatrisation des plaies et des essais Transwell révélé que miR-29b /c supprime les métastases tumorales dans GC. Un dosage de rapporteur de la luciférase a démontré que Dnmt3a est une cible directe de miR-29b /c. Nous avons utilisé le séquençage génomique bisulfite pour analyser l'état de méthylation d'ADN de miR-29b /c. Le pourcentage de CpG méthylés a été significativement réduite dans les cellules Dnmt3a appauvrie par rapport aux témoins. En outre, l'implication des Dnmt3a dans la promotion de la migration des cellules de GC a été associée à la répression méthylation du promoteur médiée par des CDH1. Dans 50 échantillons cliniques appariés de tissus GC, a diminué miR-29b /c était significativement corrélée avec le degré de différenciation et de l'invasion des cellules et a été corrélée négativement avec l'expression de Dnmt3a. Ensemble, nos résultats préliminaires suggèrent que le processus suivant peut être impliqué dans la tumorigenèse GC. miR-29b /c Dnmt3a supprime le gène en aval et à son tour, miR-29b /c est supprimée par Dnmt3a dans une manière dépendante de la méthylation de l'ADN. Le de-régulation des deux miR-29b /c et Dnmt3a conduit à la mise sous silence épigénétique de CDH1 et contribue au phénotype de métastases dans GC. Cette constatation révèle que méthylation de l'ADN associée au silence de miR-29b /c est critique pour le développement de GC et peut donc être une cible thérapeutique

Citation:. Cui H, Wang L, P Gong, Zhao C, Zhang S Zhang K, et al. (2015) La déréglementation entre miR-29b /c et Dnmt3a est associée à épigénétique Silencing du CDH1 Gene, affectant la migration cellulaire et l'invasion dans le cancer gastrique. PLoS ONE 10 (4): e0123926. doi: 10.1371 /journal.pone.0123926

Editeur académique: Rajeev Samant, Université d'Alabama à Birmingham, ÉTATS-UNIS

Reçu: 4 Septembre 2014; Accepté 9 Mars 2015; Publié: 15 Avril 2015

Droit d'auteur: © 2015 Cui et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

financement:. Ce travail a été soutenu par la national science Foundation naturel de Chine (Grant No. 81171915, n ° 91229107 et n ° 81472548), http: //www .nsfc.gov.cn /. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique (GC) est le deuxième cancer le plus mortel dans le monde entier. Il représente un total d'environ 1 million de nouveaux cas et 0,7 millions de décès chaque année, plus de 70% surviennent dans les pays en développement, en particulier dans les pays d'Asie orientale [1]. Bien guérissable si détecté tôt, la plupart des patients du GC sont diagnostiqués avec la maladie à un stade avancé. Pour les patients souffrant d'une maladie pouvant être actionné, la chirurgie et la combinaison des chimiothérapies classiques sont indiqués. Cependant, le taux de survie globale à 5 ans des patients atteints de GC est inférieure à 30% [1, 2]. Notamment, GC est souvent accompagnée par la diffusion péritonéale et des métastases aux ganglions lymphatiques régionaux et des organes éloignés à travers les vaisseaux lymphatiques et veineux [3]. Ainsi, l'identification des aberrations moléculaires en GC peut améliorer notre compréhension de la cancérogenèse gastrique et nous aider à subdiviser les patients en biologiquement et cliniquement sous-groupes pertinents, ainsi que de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Les microARN (miARN) sont une classe de endogène, petite, non codante ARNs régulateurs d'environ 20-25 nucléotides qui régulent négativement l'expression des gènes en inhibant la traduction ou induisant la dégradation de l'ARNm par appariement de bases avec la région 3 'non traduite (3'UTR) des ARN messagers cibles (ARNm) [4]. les niveaux d'expression altérés de miARN ont été rapportés dans de nombreux cancers et se traduire par une expression aberrante de gènes cibles qui influencent le comportement malin, comme la prolifération, la résistance à l'apoptose et les métastases [5-7]. Des preuves croissantes montrent que miARN déréglementés (par exemple, miR-17, miR-129, miR-148a et miR-378) contribuent à la cancérogenèse gastrique [8-10], qui indiquent que les miARN pourraient être utilisés comme biomarqueurs diagnostiques et pronostiques en GC .

Le miR-29 famille (miR-29s) est une famille conservée de miARN qui comprend miR-29a /b /c. expression Diminution de miR-29s a été décrite dans plusieurs cancers, y compris GC [11-14]. Des études antérieures démontrent que miR-29 jouent un rôle dominant dans la prolifération des cellules GC, la progression du cycle cellulaire, l'apoptose et la motilité des cellules [14, 15]. Les cibles potentielles de miR-29s contribuant au GC phénotype malin comprennent Cdc42, CCND2 et MMP2 [14, 15]. En outre, certaines études ont identifié miR-29s en tant que contributeurs à la régulation de la méthylation de l'ADN en ciblant DNMT3s dans le cancer du poumon [13]. En outre, plusieurs gènes cibles, tels que TCL-1, CDK6, la laminine-1 et MCL-1, ont également été rapportés dans d'autres cancers [16]. Notamment, en dépit des preuves démontrant miRNA-29s peut fonctionner comme des gènes suppresseurs de tumeur, une question clé relative à miRNA-29s expression restent encore partiellement en suspens. Quels sont les mécanismes de contrôle de miARN-29s expression dans les cellules du GC? Il a été rapporté que c-Myc est impliqué dans miR-29a /b répression [17]. Identifier les mécanismes de suppression supplémentaires est d'intérêt.

Il est connu que la répression transcriptionnelle des gènes suppresseurs de tumeurs (STG) par CpG île hyperméthylation est une caractéristique commune de la cancérogenèse. Fait intéressant, semblable à TSG codant pour des protéines, un nombre important de miARN sont réglementés par la méthylation du promoteur [18-20]. En effet, il y a eu un nombre croissant d'études montrant que miARN suppresseurs de tumeurs, tels que miR-34b, miR-129 et miR-124, sont souvent réduits au silence par méthylation de l'ADN dans GC [21-23]. Sur la base de l'analyse du programme CpG île Searcher, notre prédiction a montré que miRNA-29b /c contient des îlots CpG dans leurs régions promotrices putatives. Cependant, il ne sait pas encore si aberrante hyperméthylation d'ADN représente la dysrégulation de miR-29b /c. En outre, on ne sait pas si un règlement de rétroaction existe entre miR-29b /c et DNMT3s. En fait, aucune étude précédente a examiné l'état de méthylation de miR-29b /c dans les cellules du GC, et aucun n'a exploré la relation entre la méthylation de miR-29b /c et les niveaux d'expression de DNMT3s. Dans cette étude, nous avons constaté que miR-29b /c supprimé l'expression de Dnmt3a en ciblant son 3'UTR, qui a contribué à l'inhibition de la migration des cellules de GC et de l'invasion. D'autre part, Dnmt3a régulée à la baisse miR-29b /c par l'intermédiaire d'une hyperméthylation aberrante du promoteur. Ainsi, une boucle de rétroaction potentiel existe entre miR-29b /c et Dnmt3a, dans laquelle la régulation à la baisse miR-29b /c supprime la suppression de Dnmt3a. Par ailleurs, la régulation positive de Dnmt3a affecte l'expression de miR-29b /c par méthylation du promoteur. Ces résultats suggèrent une diaphonie entre miR-29b /c et Dnmt3a. Leur déséquilibre et la déréglementation est la cause par un mécanisme épigénétique qui peuvent être impliqués dans les caractéristiques de la migration et l'invasion cellulaire de GC.

Matériaux et méthodes

culture
Cell

lignées cellulaires de GC, y compris AGS et BGC-823, ont été obtenus à partir de la Banque de cellules de l'Académie chinoise des sciences et maintenues dans un milieu RPMI-1640 additionné de 10% de sérum de veau fœtal (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 U /ml de pénicilline et 100 mg /ml de streptomycine (Invitrogen, Carlsbad, CA) dans un incubateur humidifié avec un CO 5% _{2 atmosphère à 37 ° C.}

des échantillons de tissus

50 paires de tissus GC et leur adjacente des échantillons de tissus non-cancéreuses ont été recueillies entre 2011 et 2013 de l'hôpital de Jiangning de Nanjing. L'information clinique des patients atteints de GC est indiquée dans le tableau S1. L'étude a été approuvée par le Comité d'examen éthique de la recherche à l'Hôpital Jiangning de Nanjing en Chine, et les patients ont signé des formulaires de consentement éclairé. Tous les échantillons de tissu ont été obtenus à partir de patients atteints de GC. Ils ont été recueillis lors de la chirurgie et immédiatement congelés rapidement dans de l'azote liquide jusqu'à ce que l'ARN et de protéines extraction.

Inverser la réaction de transcription et quantitative PCR en temps réel (qPCR)

L'ARN total a été extrait des cellules et les tissus récoltés avec le réactif Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) selon les instructions du fabricant.

pour détecter l'expression de miARN, une tige-boucle de RT-PCR a été effectuée comme décrit précédemment [24], et U6 petits ARN étaient utilisé en tant que contrôle interne. qPCR a été réalisée en utilisant SYBR Ex Taq Premix (Takara, Dalian, Chine) selon le protocole du fabricant. L'expression relative a été évaluée par la méthode de CT comparatif. Les séquences d'amorce de chaque gène sont indiqués dans le tableau S2.

transfert de Western

Western blots ont été effectués en utilisant l'anti-Dnmt3a (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), anti-CDH1 (Abcam, Cambridge, UK), anti-vimentine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) et anti β
actine anticorps (Sigma, Ronkonkoma, NY, USA), et de détection a été réalisée avec un substrat de chimioluminescence super signal (Pierce, Rockford, IL, USA).

transfection

miR-29b /c imite /inhibiteurs et des molécules de contrôle négatif (contrôle de brouillage mimétique et de l'inhibiteur) ont été synthétisés et purifiés par la Société GenePharma (Shangai, Chine). Les séquences sont présentées dans le tableau S2. Ils ont été transfectés dans les cellules à une concentration finale de 50 nM en utilisant la lipofectamine 2000-réactif de transfection (Invitrogen, Carlsbad, USA) selon le protocole du fabricant. Le milieu a été changé au bout de 6 heures. Les cellules ont été cultivées pendant 48 heures, et récoltées pour analyse. L'efficacité de transfection pour cent a été déterminée par une évaluation des niveaux de miR-29b /c expression ou knockdown suivante transfections (S1A et S1B Fig). Le protocole pour établir la Dnmt3a cellules knockdown stables a été décrite dans nos précédents travaux [25]. L'expression de Dnmt3a considérablement diminué dans les cellules BGC-shDNTM3A et AGS-shDNTM3A (S1C Fig) par rapport aux cellules témoins.

Cicatrisation, la migration et l'invasion des essais

la mobilité cellulaire a été soumis à la cicatrisation des plaies analyse de dosage tel que décrit précédemment [26]. Une blessure à la rayure a été générée à l'aide d'une pointe de pipette 200 pi sur les monocouches de cellules confluentes dans des plaques à six puits. Les cellules ont ensuite été lavées avec du milieu frais pour éliminer les cellules flottantes, et la propagation de la fermeture de la plaie a été observée au bout de 48 heures et photographiées sous un microscope. Le potentiel de la migration et l'invasion des cellules transfectées ont été évaluées par un essai Transwell. Les cellules ont été cultivées jusqu'à une confluence de 70% et transfectées pendant 24 heures avec les mimétiques /c miR-29b ou mimétiques de commande, et un inhibiteur de l'inhibiteur ou le contrôle miR-29b /c. Dans l'essai de migration, les cellules ont été cultivées dans 200 ml de milieu avec 1% de sérum de fœtus bovin dans la chambre supérieure d'un insert Transwell non revêtue. Dans la chambre inférieure, à 600 ml de milieu avec 10% de sérum de foetus de bovin a été utilisé comme agent chimio-attractif pour favoriser la migration cellulaire. Dans l'essai d'invasion, la chambre supérieure des inserts Transwell ont été revêtues avec 50 ml de 1,0 mg /ml de Matrigel et les cellules ont été étalées dans la chambre supérieure de l'insert Transwell revêtu de Matrigel (Millipore, USA). Après une incubation de 24 heures, la non-migration ou de cellules non-envahissant ont été doucement enlevé avec un coton-tige. Toutes les cellules ont été colorées en utilisant 0,1% coloration cristal violet et comptés dans 5 champs sous un microscope inversé. Les expériences indépendantes ont été répétées trois fois.

séquençage génomique au bisulfite (BGS)

ADN génomique a été extrait des cellules en utilisant la méthode au phénol-chloroforme. Le traitement au bisulfite a été réalisée par l'Universal Modification Kit ADN CpGenome (Millipore, USA) en suivant les instructions du fabricant. Les produits de PCR pour le séquençage au bisulfite ont été purifié sur gel et sous-cloné dans un système de vecteur pMD19-T (Takara, Dalian, Chine). Au moins dix colonies ont été séquencés pour évaluer le degré de méthylation sur chaque site CpG. Les amorces sont listées dans le tableau S2.

luciférase reporter test

Le protocole pour le dosage rapporteur de la luciférase a été décrit précédemment [14]. 3'UTR de Dnmt3a humaine a été amplifié par PCR et clone entre les sites de Not I et Xba I de pGL-3 (Promega, USA). Les cellules BGC-823 ont été étalées à une densité de 5 x 10 ^{5 par puits dans une plaque de 12 puits avant que les transfections. Les cellules ont été transfectées avec PGL-3 journalistes luciférase de luciole (1 pg par puits), PRL-TK (50 ng par puits) et miR-29 imite /inhibiteur (50 nM) ou imite de contrôle /inhibiteurs négatifs (50 nM) en utilisant Lipofectamine- 2000 réactif de transfection (Invitrogen, Carlsbad, USA) selon le protocole du fabricant. On a testé l'activité de luciférase 48 heures après la transfection en utilisant l'activité du système de dosage Dual-Luciferase (Promega, USA). Toutes les expériences ont été réalisées comme trois répétitions indépendantes.}

L'analyse statistique

Le Student indépendante t
-test a été utilisé pour comparer les résultats, qui sont exprimés en la moyenne ± Dakota du Sud entre deux groupes quelconques choisis au préalable. Pour déterminer les corrélations entre les variables, Pearson
coefficient de corrélation a été calculée. A P
-value moins de 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Résultats

miR-29b /c est nécessaire et suffisante pour la migration des cellules de GC

des études antérieures impliquent que miR-29b /c est critique pour l'invasion des cellules GC. Pour mieux évaluer si miR-29b /c est responsable de la migration des cellules de GC, un in vitro
test in scratch cicatrisation et le dosage Transwell ont été réalisées. Après avoir transfecter transitoirement les miR-29b /mimétiques de carbone ou un contrôle négatif dans les cellules BGC-823, la cicatrisation des plaies essai a montré que les cellules avec l'expression forcée de miR-29b /c ont montré une récupération sensiblement plus lent par rapport aux cellules témoins (fig 1A). De même, l'essai de migration Transwell a montré que la surexpression de miR-29b /c était associée à une migration beaucoup moins que les témoins ( P
< 0,05, figure 1B). En outre, en accord avec d'autres données dans HGC-207 et MGC-803 cellules GC [14], les cellules miR-29b /c surexpression a également révélé une réduction significative de la capacité invasive dans l'essai d'invasion Matrigel ( P
<0,05, figure 1C). Ces résultats suggèrent que miR-29b /c est non seulement importante pour l'invasion des cellules GC, mais aussi pour la migration cellulaire. Pour confirmer davantage les effets suppresseurs de miR-29b /c sur la migration des cellules de GC et de l'invasion, les cellules BGC-823 ont été transitoirement transfectées avec les inhibiteurs de miR-29b /c ou un contrôle négatif. La suppression de miR-29b /c significativement augmenté les capacités migratoires et invasives des cellules GC, qui a été évaluée par la cicatrisation des plaies (figure 1D) et un dosage Transwell ( P
< 0,05, figure 1E et la Fig 1F). Collectivement, ces résultats indiquent que miR-29b /c effectivement aboli la migration et l'invasion des cellules GC, qui a donc contribué aux premiers stades de la progression maligne du GC.

Dnmt3a est une cible transcriptionnelle directe de miR-29b /c GC

Pour comprendre le mécanisme sous-jacent de l'effet de miR-29b /c sur la migration et l'invasion cellulaire, nous avons étudié les cibles de miR-29b /c. Dnmt3a 3'UTR est complémentaire de miR-29b /c et est un gène cible directe de miR-29b /c, donc nous avons effectué un test de journaliste dans BGC-823 cellules. Dnmt3a l'ARNm 3'UTR a été inséré dans la région en aval d'un gène rapporteur de luciférase à partir du vecteur pGL-3 (à savoir Dnmt3a 3'UTR-Luc). Les constructions ont ensuite été cotransfectées avec les synoptiques de contrôle négatif dans les cellules BGC-823 pRL-TK, et les /c imite miR-29b ou. Comme on le voit sur la figure 2A, l'activité relative de luciférase a été significativement réduite dans les PGL-3 vecteurs avec le Dnmt3a 3'UTR ( P
< 0,05). Cependant, les constructions co-transfectées avec l'inhibiteur /c miR-29b n'a pas affecté l'activité de luciférase des vecteurs PGL-3 avec le Dnmt3a 3'UTR par rapport aux constructions co-transfectées avec l'inhibiteur témoin négatif (figure 2B). Afin de valider cette interaction miARN-cible, RT-PCR quantitative (qRT-PCR) et Western blots ont été effectués pour confirmer la régulation de Dnmt3a par miR-29b /c. Nous transfectées transitoirement les miR-29b /imite c ou imite de contrôle négatif dans les cellules BGC-823. L'augmentation de miR-29b /c réduisait l'expression de l'ARNm à Dnmt3a (figure 2C) et les taux de protéine (figure 2E, lane1-3). A l'inverse, le miR-29b /c régulation vers le bas par son inhibiteur a augmenté l'expression de l'ARNm à Dnmt3a (figure 2D) et les taux de protéine (figure 2E, lane4-6). Collectivement, ces résultats indiquent que Dnmt3a est une cible transcriptionnelle directe de miR-29b /c et est associée négativement à miR-29b /c expression dans les cellules du GC.

miR-29b /c est supprimée par Dnmt3a dans un méthylation de l'ADN-dépendante de manière

Étant donné que hyperméthylation aberrante est critique pour miRNA régulation à la baisse, nous spéculé que la rétroaction négative existe entre miR-29b /c et Dnmt3a. Pour tester cette hypothèse, la présence d'îlots CpG méthylation dans la région promotrice miR-29b /c a été évaluée par une analyse BGS dans les cellules Dnmt3a-knockdown. Comme cela est représenté sur la figure 3A, 7 sites CpG individuels dans les régions îlot CpG (5 kb en amont du miR-29b /c) ont été séquences pour identifier les résidus de cytosine méthylés. La fréquence de miR-29b /c méthylation de promoteur dans des cellules Dnmt3a-knockdown était de 34,2%, ce qui était significativement inférieur à celui des cellules témoins (58,6%; la figure 3B). Ce résultat indique que la répression transcriptionnelle de miR-29b /c dans les cellules de GC est associée à la présence d'îlots CpG hyperméthylation, qui a été confirmée par la mesure de maturité miR-29b /c par qRT-PCR. On a augmenté de manière significative miR-29b /c expression dans les cellules AGS et shDNMT3A BGC-shDNMT3A par rapport à leurs témoins (figure 3C). Ces résultats indiquent une base moléculaire important pour miR29-b /c la régulation et l'hypothèse selon laquelle il est diaphonie entre miR-29b /c et Dnmt3a.

Dnmt3a favorise la migration des cellules GC

la connexion moléculaire entre miR-29b /c et Dnmt3a a soulevé la question de la participation Dnmt3a dans la migration des cellules de GC. Nous avons appliqué plus in vitro
tests pour déterminer les changements fonctionnels dans le comportement des cellules suivantes expression altérée de Dnmt3a. Le dosage de la cicatrisation des plaies a démontré une récupération sensiblement plus lent dans les cellules BGC shDNMT3A par rapport aux cellules témoins (figure 4A, en haut), mais seulement une légère reprise dans les cellules AGS shDNMT3A par rapport aux cellules témoins (figure 4A, en bas). Ces résultats indiquent que Dnmt3a est important pour la mobilité cellulaire. Étant donné que les molécules d'adhésion cellulaire jouent un rôle important pour la motilité cellulaire, l'expression de la vimentine et CDH1 ont été examinés par la qRT-PCR et transfert western. Knockdown de l'expression Dnmt3a augmenté de manière significative l'expression CDH1 aux niveaux d'ARNm et de protéines, mais n'a pas eu un effet remarquable sur l'expression de la vimentine (figure 4B et 4C), ce qui suggère que CDH1 peut être une cible de dysrégulation Dnmt3a médiée par des cellules motilité. En outre, nous avons effectué un essai sur le gène BGS CDH1 dans les cellules Dnmt3a-knockdown. Comme cela est représenté sur la figure 4D, le pourcentage de CpG méthylés situés à l'intérieur CDH1 était plus faible dans les cellules Dnmt3a appauvrie que dans les cellules témoins (35,8% vs 94,1%). Ces résultats indiquent que l'expression anormale de Dnmt3a conduit à un silençage épigénétique de CDH1.

miR-29b /c est impliqué dans la suppression de CDH1

Pour étudier davantage l'effet modifié Mir- 29b /c expression sur CDH1, nous transfectées transitoirement les miR-29b /imite c ou contrôle négatif imitent en BGC-823 cellules. Par rapport aux contrôles, l'expression forcée de miR-29b /c significativement augmenté l'expression de CDH1 tant au niveau de la protéine (figure 4E et 4F) ARNm et. Par la suite, l'état de méthylation de la région promoteur du CDH1 a été examiné en utilisant un dosage BGS dans le miR-29b /c ou des mimétiques de contrôle négatif imitent transfectées transitoirement BGC-823 cellules. Les résultats ont montré que la fréquence de CDH1 méthylation de promoteur dans les cellules de surexpression /c miR-29b était de 5,2% ou 12,9%, ce qui était significativement inférieur à celui mesuré dans les cellules témoins (88,2%; la figure 4G). Ces données sont compatibles avec le résultat que Dnmt3a knockdown médie la régulation positive des CDH1 et démontre que le de-régulation de miR-29b /c et Dnmt3a sont impliqués dans la migration des cellules de GC et de l'invasion.

Diminution de l'expression de miR-29b et miR-29c dans les tissus du GC

L'expression de miR-29b /c dans 50 tumeurs du GC et des tissus non tumoraux appariés a été examiné par qRT-PCR. Par rapport aux tissus non tumoraux les paires de la fréquence de miR-29b et miR-29c régulation vers le bas (définie comme une diminution supérieure à deux fois) était de 66% (33/50) et 60% (30/50), respectivement (figure 5A et 5B). Le facteur de variation moyenne de miR-29b et miR-29c était significativement plus faible dans les tissus de la tumeur que dans les tissus non tumoraux ( P
< 0,01, figure 5C et 5D). Pour explorer la signification clinicopathologique des miR-29b et miR-29c profils d'expression dans GC tumorigenèse, les caractéristiques cliniques des patients du GC ont été analysés. Tous les 43 patients analysés ont été classés en deux groupes selon les niveaux d'expression de miR-29c miR-29b et. Diminution de miR-29b fortement corrélé avec le degré de différenciation des cellules tumorales et à l'invasion, alors diminué miR-29c uniquement en corrélation avec l'invasion tumorale (Tableau 1). En outre, la relation entre miR-29b /c expression et Dnmt3a expression a été testé dans 33 cas de GC. Une étude d'association a montré que l'expression de Dnmt3a était corrélée négativement avec miR-29b ( R
= -0,640, P
< 0,01, figure 5E) et miR-29c ( R
= -0,349, P
< 0,05, figure 5F). Collectivement, ces données indiquent que miR-29b /c pourrait jouer un rôle important dans la progression de la carcinogenèse gastrique.

Discussion

Le conservé miR-29 famille, y compris miR-29a, Mir- 29b et miR-29c, est impliqué dans plusieurs processus cave, tels que la prolifération, la différenciation, l'apoptose et les métastases, les une famille bien analysé des miARN dans la tumorigenèse [16] faire. Des études antérieures ont montré que l'augmentation de l'expression de miR-29a est associée à de meilleurs taux de survie globale à l'étape II patients atteints de cancer du côlon [27] et des niveaux inférieurs de miR-29b pourraient favoriser les métastases du cancer de la prostate en régulant la transition des voies de signalisation épithéliales-mésenchymateuses [28] . En outre, les fonctions de miR-29c comme suppresseur de métastases qui inhibe l'adhérence des cellules du cancer du poumon à la matrice extracellulaire et la migration in vitro et

in vivo [29]. En GC, réduit de façon significative les niveaux de miR-29b et miR-29c, en particulier, ont été observées par rapport à miR-29a [14], ce qui suggère que miR-29b /c peut jouer un rôle plus important. Ainsi, miR-29b /c a été sélectionné pour l'analyse dans cette étude. Dans la présente étude, nous avons montré une augmentation de miR-29b /c supprime la migration et l'invasion de BGC-823 cellules en utilisant un test de cicatrisation et un dosage Transwell. Ces résultats sont cohérents avec d'autres données rapportées obtenues à partir de SGC-7901, HGC-27 et MGC-803 cellules GC [14, 15]. Étant donné que miR-29b /c jouent également un rôle dans la prolifération et de l'apoptose dans les GC, nous avons évalué la capacité de croissance des cellules et les niveaux de l'apoptose cellulaire dans les cellules BGC-823. Les résultats ont montré qu'il n'y a pas de différence de prolifération à 48 heures pour miR-29b mimétiques /c ou des cellules inhibiteurs transfectées par rapport aux cellules témoins négatives ( P
> 0,05, S2A et S2B figure). En outre, la coloration de l'annexine V n'a démontré aucune augmentation spectaculaire des niveaux d'apoptose dans les cellules miR-29b /c mimétiques transfectées après 48 heures d'incubation (Fig S2C). En outre, l'analyse du cycle cellulaire a montré aucune différence significative dans G1, S, G2 /M phases après le traitement avec les miR-29b /imite c ou imite de contrôle négatif pour 48 heures ( P
> 0,05, S2D Figue). Ces données suggèrent que miR-29b /c ralentit enroulé reprise dans la zone à 48 heures principalement en raison des capacités de la motilité cellulaire a diminué.

miARN exercent leurs fonctions principalement en ciblant les 3'UTRs de gènes différents. Cependant, les mécanismes moléculaires détaillés de miR-29b /c liés au développement de GC malignes sont mal comprises. Notamment, miR-29b /actions c la même complémentarité des sites dans le 3'UTR de Dnmt3a, qui a été prédit par les programmes de prédiction de cibles, y compris TargetScan, Miranda et miRBase. On ne sait pas encore si miR-29b /c régule la méthylation anormale de gènes associés à une métastase par interaction avec Dnmt3a au cours du développement de la CG. Par conséquent, nous avons effectué un dosage de rapporteur de luciférase et on a trouvé qu'une expression élevée Dnmt3a était associée à une faible miR-29b /c expression dans des cellules GC, ce qui indique Dnmt3a est une cible transcriptionnelle directe de miR-29b /c. Cependant, la base moléculaire qui conduit au déséquilibre de miR-29b /c CG reste inconnue. miR-29 promoteurs proximaux ont des sites de liaison pour plusieurs facteurs de transcription, tels que c-Myc et CEBPA, qui contribuent à la déréglementation du miR-29s [30, 31]. Cependant, la recherche sur la régulation épigénétique de miARN-29s n'a pas été signalée.

Dans les cellules eucaryotes, il y a trois ADN méthyltransférases enzymatiquement actifs (DNMTs), Dnmt1, Dnmt3a et DNMT3B. L'expression de la Dnmt3a GC est nettement supérieur à celui de DNMT3B [32, 33]. En outre, seulement une expression accrue de Dnmt3a est significativement associée à une période plus courte sans maladie survie dans GC [34], ce qui indique Dnmt3a joue un rôle plus important dans la carcinogenèse gastrique. Ainsi, nous avons cherché à déterminer si les règlements de rétroaction négative existe entre miR-29b /c et Dnmt3a. Dans cette étude, nous avons utilisé un test BGS pour analyser l'état de méthylation d'ADN de miR-29b /c dans les cellules Dnmt3a ARNi GC. En effet, le miR-29b /c diminué était en partie due à l'hyperméthylation Dnmt3a médiée. En outre, nous avons confirmé que Dnmt3a est impliqué dans la promotion de la migration des cellules GC via la régulation négative CDH1. Pendant ce temps, nous avons également montré que miR-29b /c est impliqué dans la suppression de CDH1. Une caractéristique de métastases du cancer est la perte de l'expression CDH1 [35] et une hyperméthylation de la région promotrice CDH1 est également observée dans le GC [36]. Ainsi, nos résultats montrent que les deux miR-29b /c et Dnmt3a sont associés à la régulation vers le bas CDH1 par Dnmt3a à médiation par hyperméthylation de promoteur. Le rôle des autres DMNTs, par exemple DNMT3B, dans la régulation de miR-29b /c doit être examiné dans les études futures.

Dans les échantillons de GC, nous avons examiné le profil d'expression de miR-29b /c dans 50 paires de les tissus GC. Diminution de miR-29b /c (changement pliez coupure: 2,0) était significativement corrélée avec la différenciation et de l'invasion diplôme en GC, ce qui suggère que miR-29b /c joue un rôle essentiel dans l'entretien maligne GC et démontre directement la signification clinique de miR -29b /c dans la progression du GC. En résumé, notre étude révèle qu'il peut y avoir diaphonie entre miR-29b /c et Dnmt3a. Un déséquilibre de ces facteurs peuvent être impliqués dans la migration de GC et d'invasion phénotypes. Ce déséquilibre peut comprendre l'expression de faible niveau de miR-29b /c peut supprimer la suppression de Dnmt3a et des niveaux élevés de Dnmt3a affecte en outre l'expression de miR-29b /c par un mécanisme épigénétique. Ces résultats peuvent être bénéfiques pour le développement de nouvelles options de traitement pour les GC qui ciblent miR-29b /c et son Dnmt3a gène en aval.

Informations complémentaires
S1 Fig. L'efficacité de transfection en pourcentage a été fournie par l'évaluation des niveaux de miR-29b /c ou Dnmt3a.
(A et B) qRT-PCR a été réalisée pour détecter l'expression relative de miR-29b /c dans BGC-823 cellules avec des mimétiques (A) ou inhibiteurs (B) après la transfection de 48 heures. (C) RT-PCR et Western blots ont été effectués pour détecter l'efficacité du Dnmt3a knockdown dans les cellules BGC et AGS. β
actine a été utilisé comme un contrôle de chargement
doi:. 10.1371 /journal.pone.0123926.s001
(TIF)
S2 Fig. Le rôle de miR-29b /c dans le cycle BGC-823 prolifération des cellules, l'apoptose et la cellule.
(A) Les taux de miR-29b /c surexpression croissance cellulaire ont été détectés par CCK-8 essai de prolifération. miR-29b /c surexpression n'a montré aucune différence remarquable à 48 heures par rapport aux cellules de contrôle négatif ( P
> 0,05). (B) Les taux de miR-29b /c inhibition de la croissance cellulaire ont été détectés par la CCK-8 essai de prolifération. La suppression de miR-29b /c n'a montré aucun changement significatif à 48 heures par rapport aux cellules témoins négatives ( P
> 0,05). (C) Apoptose test montrant aucune induction dramatique de l'apoptose par miR-29b /c surexpression à 48 heures par rapport aux cellules témoins négatives. L'histogramme montre biparamétrique cellulaire au début (quadrant inférieur droit) et les états apoptotiques tardives (quadrant supérieur droit). (D) L'analyse du cycle cellulaire a été effectuée par cytométrie de flux sur BGC-823 cellules après mimétiques miR-29b /c ou négatif le traitement des mimétiques de commande pendant 48 heures. Les pourcentages de miR-29b /c surexpression ou de contrôle des cellules dans le G1, S et G2 /M sont présentés dans le graphique à barres comme la moyenne ± S.D. de trois expériences indépendantes. Par rapport aux cellules témoins, il n'y avait pas d'effet significatif sur le cycle cellulaire après miR-29b /c surexpression
doi:. 10.1371 /journal.pone.0123926.s002
(TIF) PROCEDE S1. La croissance cellulaire et le dosage de l'apoptose
doi:. 10.1371 /journal.pone.0123926.s003
(DOC)
S2 Méthode. . Cycle cellulaire test
doi: 10.1371 /journal.pone.0123926.s004
(DOC)
Tableau S1. Les caractéristiques cliniques des patients atteints de cancer gastrique
doi: 10.1371. /journal.pone.0123926.s005
(DOC)
S2 Tableau. . MiRNA mimique et inhibiteur des séquences et des amorces utilisées dans cette étude
doi: 10.1371 /journal.pone.0123926.s006
(DOC)

Remerciements

Nous remercions le Dr Gang Chen de l'hôpital de Nanjing Jiangning pour la collecte des échantillons. Nous remercions le professeur Sheng Zhong de l'Université médicale de la capitale pour aider à modifier le manuscrit.

• PLOS ONE: Chrysin Inhibe Tumor Promoteur-Induced MMP-9 Expression par blocage AP-1 via Suppression des voies ERK et JNK dans les cellules du cancer gastrique
• PLOS ONE: Effet de l'éradication de l'Helicobacter pylori sur les niveaux d'expression de FHIT, IL-8 et P73 dans la muqueuse gastrique des parents au premier degré de Gastric Cancer Patients