Ploche ONE: Deregulácia medzi Mir-29b /c a DNMT3A je spojená s epigenetické umlčanie génu CDH1, ktoré ovplyvňujú bunky migrácie a invázie v žalúdočnej Cancer

abstraktné

deregulácii rodiny Mir-29 a DNA metyltransferázy 3A (DNMT3A) je spojená s rakovinou žalúdka (GC). A zároveň zvýšiť dôkazov naznačuje, MIR-29b /c mohla regulovať metylácie DNA zacielením DNMT3A, je v súčasnej dobe známe, či epigenetické umlčanie MIR-29b /c cez promótor hypermetylace v GC je spôsobená abnormálne expresiou DNMT3A. Preto sme za cieľ zhodnotiť, či existuje regulácia cross-talk medzi MIR-29b /c a DNMT3A a či je spojená s malígnym fenotypom v GC. Po prvé, hojenie rán a Transwell testami bolo zistené, že mier-29b /c potláča metastázy tumoru v GC. Luciferázový reportéri test preukázal, že DNMT3A je priamym cieľom MIR-29b /c. Použili sme bisulfitového genómovej sekvenovania pre analýzu stavu DNA metylácie MIR-29b /c. Percento metylovaných CPG bol v bunkách DNMT3A zbavenú významne znížila v porovnaní s kontrolami. Okrem toho zapojenie DNMT3A pri podpore migrácie GC buniek bolo spojené s promótor metylácie-sprostredkované represie CDH1. V 50 párovaných vzoriek klinických GC tkaniva, zníženie MIR-29b /c bola signifikantne v korelácii so stupňom diferenciácie a invázie buniek a bola v negatívnej korelácii s expresiou DNMT3A. Spoločne Naše predbežné výsledky ukazujú, že nasledujúce proces môže byť zapojený do GC vzniku nádorov. MIR-29b /c potlačia downstream génu DNMT3A, a naopak, Mir-29b /c je potlačená DNMT3A v metylácie DNA spôsobom závislým. Deregulácii oboch MIR-29b /c a DNMT3A vedie k epigenetické umlčanie CDH1 a prispieva k metastáz fenotypu v GC. Toto zistenie ukazuje, že metylácie DNA asociované umlčanie MIR-29b /c je kritická pre vývoj GC, a preto môže byť terapeutickým cieľom

Citácia :. Cui H, Wang L, P Gong, Zhao C, Zhang S , Zhang K, et al. (2015) Deregulácia medzi MIR-29b /c a DNMT3A je spojená s epigenetické umlčanie génu CDH1, ktoré ovplyvňujú bunky migrácie a invázie v rakoviny žalúdka. PLoS ONE 10 (4): e0123926. doi: 10,1371 /journal.pone.0123926

Akademický Editor: Rajeev Samanta, University of Alabama v Birminghame, Spojené štáty

prijatá: 04.09.2014; Prijaté: 09.03.2015; Uverejnené: 15.apríla 2015

Copyright: © 2015 Cui et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje spadajú do papiera a jeho podporné informácie súbory

Financovanie :. Táto práca bola podporená Národnej prírodnej Science Foundation Číny (Grant No. 81171915, No. 91229107 a č 81472548), http: //www .nsfc.gov.cn /. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

rakovina žalúdka (GC) je druhým najviac fatálne zhubný nádor na celom svete. To predstavuje celkom asi 1 milión nových prípadov a 0,7 milióna úmrtí ročne, z ktorých viac ako 70% dochádza v rozvojových krajinách, najmä v krajinách východnej Ázie [1]. Hoci liečiteľná, ak zistený čoskoro, väčšina pacientov GC je diagnostikovaných s neskoršom štádiu choroby. U pacientov s operabilným ochorením, obvyklú chirurgiu, a kombinačné chemoterapia sú uvedené. Avšak celkové 5-ročné prežitie u pacientov GC je nižší ako 30% [1, 2]. Pozoruhodne, GC je často sprevádzaná peritoneálnej šírenia a metastáz do regionálnych lymfatických uzlín a vzdialených orgánov prostredníctvom lymfatických ciev a žilovej [3]. Tak, identifikáciu molekulárnych aberácie v GC môže zlepšiť naše chápanie žalúdočné karcinogenéze a pomáhajú nám rozdeliť pacientov do biologicky a klinicky relevantných podskupín, ako aj rozvoj nových liečebných postupov.

mikroRNA (miRNA) sú skupinou endogénnych, malý, nekódujúca regulačné RNA o zhruba 20 až 25 nukleotidov, ktoré negatívne regulujú expresiu génov inhibíciou translácie alebo indukovať degradácii mRNA pomocou párovanie báz s 3 'netranslatované oblasti (3' UTR) cieľového messenger RNA (mRNA) [4]. Zmenené úrovne expresie miRNA boli hlásené u mnohých druhov rakoviny a viesť k aberantne expresiu cieľových génov, ktoré ovplyvňujú zhubného správanie, ako je proliferácia, odolnosť voči apoptóze a metastáz [5-7]. Pribúda dôkazov ukazuje, že deregulovaných miRNA (napr, MIR-17, MIR-129, MIR-148a, a mier-378) prispieva k žalúdočnej karcinogenéze [8-10], ktoré naznačujú, že miRNA by mohli byť použité ako diagnostické a prognostické biomarkery GC .

rodina MIR-29 (MIR-29s) je konzervatívny rodina miRNA, ktorá zahŕňa MIR-29a /b /C. Znížená expresia Mir-29 je popísaný v mnohých druhov rakoviny, vrátane GC [11-14]. Predchádzajúce štúdie preukázali, že mier-29 hrá dominantnú úlohu v proliferácii buniek, GC progresiu bunkového cyklu, apoptózy a motility buniek [14, 15]. Potenciálne ciele Mir-29s, ktoré prispievajú k malígne GC fenotypu zahŕňajú Cdc42, CCND2 a MMP2 [14, 15]. Okrem toho niektoré štúdie zistili Mir-29S ako prispievatelia na reguláciu metylácie DNA zameraním DNMT3s u karcinómu pľúc [13]. Okrem toho niekoľko cieľových génov, ako TCL-1, CDK6, laminínu-1 a MCL-1, boli hlásené tiež v iných rakoviny [16]. Pozoruhodne, hoci dôkazy o tom, miRNA-29 môže fungovať ako tumor-supresorových génov, jednu kľúčovú otázku týkajúcu sa výrazu Mirna-29 stále zostávajú nevyriešené čiastočne. Aké sú kontrolné mechanizmy expresie miRNA-29 v GC buniek? Bolo oznámené, že c-myc sa podieľa na Mir-29a /b represie [17]. Určiť ďalšie potlačenie mechanizmov je predmetom záujmu.

Je známe, že transkripčný umlčanie nádorových supresorových génov (ZTS) od CPG ostrov hypermetylace je spoločným znakom rakoviny. Zaujímavé je, podobne ako zaručené tradičné špeciality kódujúcich proteíny, značný počet miRNA sú upravené metylácie promótorom [18-20]. V skutočnosti došlo k rastúci počet štúdií, ktoré ukazujú, že tumor supresorové miRNA, ako je MIR-34b, mier-129 a mier-124, sú často umlčal metylácie DNA v GC [21-23]. Na základe analýzy programov CPG Island Searcher na báze naše prognóza ukazuje, že miRNA-29b /c obsahuje CPG ostrovy vo svojich domnelých promotorových oblastí. Je však ešte nie je jasné, či aberantne DNA hypermetylace zodpovedá za dysregulácia MIR-29b /c. Okrem toho je známe, či existuje regulácia spätnej väzby medzi MIR-29b /c a DNMT3s. V skutočnosti, žiadna predchádzajúca štúdia skúmala metylačného statusu MIR-29b /c v GC buniek, a žiadny z nich preskúmal vzťah medzi metylácie MIR-29b /c a úrovne expresie DNMT3s. V tejto štúdii sme zistili, že mier-29b /c potlačená expresia DNMT3A zacielením jeho 3 'UTR, ktorá prispela k inhibícii migrácie a invázie GC buniek. Na druhej strane, DNMT3A down-regulované MIR-29b /c pomocou aberantne hypermetylace promótorom. Existuje teda možnosť spätnej väzby medzi MIR-29b /c a DNMT3A, v ktorom je down-regulácia MIR-29b /c ruší potlačenie DNMT3A. Medzitým, up-regulácia DNMT3A ovplyvňuje expresiu MIR-29b /c o metylácie promótorom. Tieto zistenia naznačujú, cross-talk medzi MIR-29b /c a DNMT3A. Ich nerovnováha a deregulácia je spôsobená epigenetického mechanizmom, ktorý môže byť zapojený do migrácie a invázie vlastnosťami GC buniek.

Materiály a metódy

bunkových kultúr

GC bunkové línie, vrátane AGS a BGC-823, boli získané z bunkovej banky čínskej akadémie vied a udržiavané v RPMI-1640 médiu doplnenom 10% fetálnym hovädzím sérom (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 u /ml penicilínu a 100 mg /ml streptomycínu (Invitrogen, Carlsbad, CA) vlhké s inkubátora s 5% CO _{2 atmosfére pri teplote 37 ° C.}

vzorky tkaniva

50 pary GC tkanív a ich priľahlé vzorky non-rakovinové tkanivá boli zhromaždené v rokoch 2011 a 2013 od Jiangning nemocnice Nanjing. Klinické údaje z pacientov s GC je uvedený v tabuľke S1. Štúdia bola schválená Výborom pre etické skúmanie výskumu v Jiangning nemocnici Nanjing v Číne, a pacienti podpísali informovaný súhlas formy. Všetky vzorky sa tkanivá boli získané od pacientov s GC. Boli zhromaždené v priebehu chirurgického zákroku a okamžite zmrazený v kvapalnom dusíku až do RNA a proteín extrakcii.

reakcie reverznej transkripcie a kvantitatívnej PCR v reálnom čase (qPCR)

Celková RNA bola extrahovaná z buniek a tkaniva zožne za použitia TRIzolu činidla (Invitrogen, Carlsbad, CA) podľa inštrukcií výrobcu.

pre detekciu expresie miRNA, driek-loop RT-PCR bola vykonaná, ako bolo opísané skôr [24], a U6 malé RNA boli použitý ako vnútorná kontrola. qPCR bola vykonaná pomocou SYBR Premix Ex Taq (Takara, Dalian, Čína) podľa protokolu výrobcu. Relatívna expresia bola hodnotená porovnávacia metódou CT. Primeru sekvencie každého génu sú uvedené v tabuľke S2.

Western blot

Western bloty boli vykonávané s použitím anti-DNMT3A (abca, Cambridge, UK), anti-CDH1 (abca, Cambridge, UK), anti-Vimentin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) a anti- β
aktínu protilátky (Sigma, Ronkonkoma, NY, USA) a detekcia bola vykonávaná s Super Signal chemiluminiscenčný substrátom (Pierce, Rockford, IL, USA).

transfekcia

MIR-29b /c /má rovnakú funkciu ako inhibítory a negatívne molekuly (riadenie ťahanice napodobniť a inhibítor) boli syntetizované a purifikované podľa GenePharma Company (Shanghai, Čína). Sekvencie sú uvedené v tabuľke S2. Boli transfekovány do buniek v konečnej koncentrácii 50 nM s použitím Lipofectamine 2000-transfekčního činidla (Invitrogen, Carlsbad, USA) podľa protokolu výrobcu. Médium bolo vymenené po 6 hodinách. Bunky boli kultivované počas 48 hodín a zozbieraná pre analýzu. Účinnosť transfekcia percent bola stanovená hodnotením hladín MIR-29b /c expresie alebo porazený po transfekciu (S1A a S1B Obr). Protokol pre stanovenie DNMT3A stabilných porazený bunky bolo popísané v našej predchádzajúcej práci [25]. Expresie DNMT3A v BGC-shDNTM3A a AGS-shDNTM3A buniek (obr S1C) dramaticky klesla v porovnaní s kontrolnými bunkami.

hojenie rán, migrácia a invázia testy

pohyblivosť buniek bolo podrobené hojenie rán analýza test, ako je opísané skôr [26]. Poškriabaniu rana bola vytvorená s použitím 200 ul pipety na bunkovej monovrstvy v súvislých šiestich jamkami. Bunky boli potom premyté čerstvým médiom pre odstránenie plávajúcich buniek a šírenie uzáveru rany bol pozorovaný po 48 hodinách a fotografovaná pod mikroskopom. Potenciál pre migráciu a inváziu buniek po transfekciu boli vyhodnotené testom Transwell. Bunky boli pestované do 70% zhlukovania a transfekovány po dobu 24 hodín s Mir-29b /c napodobňuje alebo riadiacich napodobenín, a inhibítor Mir-29b /inhibítor c alebo ovládanie. V teste migrácie, bunky boli pestované v 200 ml média s 1% fetálnym hovädzím sérom v hornej komore transwell vložky nepokrytých. V spodnej komore 600 ml média s 10% fetálneho hovädzieho séra bol použitý ako chemoatraktant pre podporu migrácie buniek. V teste invázie, horná komora transwell vložiek boli potiahnuté s 50 ml 1,0 mg /ml Matrigelu a bunky boli umiestnené v hornej komore Matrigel potiahnuté transwell vložky (Millipore, USA). Po 24-hodinovej inkubácii, non-migrujúci alebo non-napádať bunky boli opatrne odstránené vatovým tampónom. Všetky bunky boli zafarbené za použitia 0,1% farbením s krištáľovou violeťou a spočítajú v 5 poliach pod inverzným mikroskopom. Tieto nezávislé pokusy boli opakované trikrát.

hydrogénsiričitanu genómovej sekvenovania (BPS)

genómovej DNA bola extrahovaná z buniek za použitia metódy fenol-chloroform. Bisulfitového vykonala CpGenome Universal DNA Modification Kit (Millipore, USA) podľa návodu výrobcu. PCR produkty pre bisulfitová sekvencovania bol čistený na gélu a subklonován do vektorového systému pMD19-T (Takara, Dalian, Čína). Najmenej desať kolónie boli radené tak, aby posúdiť stupeň metylácie na každom mieste CPG. Primery sú uvedené v tabuľke S2.

Luciferase reportér test

Denník pre luciferázovým reporterovým testom bolo opísané skôr [14]. 3'UTR ľudského DNMT3A bol PCR amplifikovaný a klonovaný medzi miesta Not I a XBA I PGL-3 (Promega, USA). Bunky BGC-823 boli schovať v hustote 5 x 10 ^{5 na jamku v 12-jamkové doštičke pred transfekciu. Bunky boli transfekovány PGL-3 luciferázy svetlušiek reportérov (1 ug na jamku), PRL-TK (50 ng na jamku) a mier-29 má rovnakú funkciu ako /inhibítor (50 nM), alebo ako negatívna kontrola napodobňuje /inhibítory (50 nM) s použitím Lipofectamine- 2000 transfekční činidlo (Invitrogen, Carlsbad, USA) podľa protokolu výrobcu. Aktivita luciferázy bola testovaná 48 hodín po transfekciu s použitím Dual-aktivita luciferázy Assay System (Promega, USA). Všetky experimenty boli vykonané v troch nezávislých opakovaní.}

Štatistická analýza

Nezávislý Študent je t
-test bol použitý na porovnanie výsledkov, ktoré sú vyjadrené ako priemer ± SD medzi dvoma vopred vybraných skupín. Ak chcete určiť korelácia medzi premennými, Pearson
's korelačný koeficient bol vypočítaný. A P
-hodnota menšia ako 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú.

Výsledky

MIR-29b /je nutné a dostatočné pre migráciu GC bunka
c

Predchádzajúce štúdie naznačujú, že mier-29b /c je kritická pre GC invázie buniek. Pre ďalšie vyhodnotenie, či MIR-29b /c je zodpovedný za migráciu GC buniek od in vitro
proti poškriabaniu hojenie rán test a test Transwell boli vykonané. Po prechodnú transfekcia MIR-29b /C napodobňuje alebo negatívne kontrolou, do buniek BGC-823, hojenie rán testu ukázal, že bunky s núteným expresie Mir-29b /c vykazovali pozoruhodne pomalší oživenie v porovnaní s kontrolnými bunkami (obr 1A). Rovnako tak migračný test Transwell ukázali, že zvýšená expresia MIR-29b /c bolo spojené s výrazne nižšou migrácie ako kontroly ( P
menšie ako 0,05, obr 1B). Okrem toho, v súlade s inými údajmi v HGC-207 a MGC-803 GC buniek [14], že mier-29b /c nadmerná expresia bunky tiež odhalila významné zníženie schopnosti invazívneho v teste na Matrigel invázie ( P Hotel <0,05, obrázok 1C). Tieto výsledky naznačujú, že mier-29b /c nie je dôležité len pre GC invázie buniek, ale aj pre migráciu buniek. Pre ďalšie potvrdenie supresívne účinky MIR-29b /C na migráciu GC buniek a inváziu buniek BGC-823 boli prechodne transfekovány inhibítory MIR-29b /C alebo negatívna kontrola. Vypustenie MIR-29b /c významne zvýšilo migračnej a invazívne schopnosti GC buniek, čo sa hodnotilo podľa hojenie rán (obr 1D) a testu Transwell ( P
menšie ako 0,05, obr 1E a obr 1F). Súhrnne tieto výsledky ukazujú, že mier-29b /c účinne eliminoval migráciu GC buniek a inváziu, ktoré z tohto dôvodu prispeli k raných fázach malígne progresiu GC.

DNMT3A je priamy transkripčný cieľom MIR-29b /c v GC

Ak chcete pochopiť mechanizmus fundamentálne vplyv MIR-29b /c o migrácii a invázii buniek, sme skúmali cieľov MIR-29b /c. DNMT3A 3'UTR je komplementárna s Mir-29b /c a je priamym cieľový gén MIR-29b /c, a tak sme vykonali reporterového testu v BGC-823 buniek. DNMT3A mRNA 3'UTR bol vložený do spodnej oblasti jedného luciferázového reportérového génu z PGL-3 vektora (to DNMT3A 3'UTR-Luc). Tieto konštrukty boli potom kotransfekovány prl-TK a Mir-29B /c napodobňuje alebo negatívnych kontrolných napodobňuje do buniek BGC-823. Ako je znázornené na obr 2A, je relatívna aktivita luciferázy bola významne znížená v PGL-3 vektorov s DNMT3A 3 'UTR ( P Hotel &0,05). Avšak, konštrukty kotransfekovány inhibítorom /c s MIR-29b neovplyvnil aktivitu luciferázy u PGL-3 vektorov s DNMT3A 3'UTR v porovnaní s konštrukty kotransfekovány negatívnym inhibítorom kontroly (obrázok 2B). Pre ďalšie overenie tohto miRNA-cieľovú interakciu, kvantitatívnej RT-PCR (QRT-PCR) a western bloty boli vykonávané s cieľom potvrdiť reguláciu DNMT3A Mir-29b /c. My prechodne transfekovány Mir-29b /C mimiku alebo negatívne kontrolou, mimiku do buniek BGC-823. Zvýšená MIR-29b /c znižuje expresiu DNMT3A na mRNA (obr 2c) a na úrovni proteínu (obr 2E, lane1-3). Naopak, mier-29b /c down-regulácia jej inhibítorom zvýšila expresiu DNMT3A na mRNA (obr 2D) a nízka hladina bielkovín (obr 2E, lane4-6). Súhrnne tieto výsledky ukazujú, že DNMT3A je priamy transkripčný cieľom MIR-29b /c a je negatívne spojené s Mir-29b /c expresiu v GC buniek.

MIR-29b /c je potlačená v DNMT3A metylácie DNA spôsobom závislým

Vzhľadom k tomu, že sa odchyľujú hypermetylace je rozhodujúci pre miRNA down-regulácia, sme špekulovali, že existuje negatívna spätná väzba medzi MIR-29b /c a DNMT3A. Pre testovanie tejto hypotézy, že prítomnosť CPG ostrov metylácie v promotorové oblasti Mir-29b /c bola hodnotená pomocou analýzy BPS v bunkách DNMT3A-porazený. Ako je znázornené na obrázku 3a, 7 jednotlivé stránky CPG v rámci ostrovných regiónov CPG (5 kb upstream MIR-29b /C) boli sekvenované pre identifikáciu methylata cytosinové zvyšky. Frekvencia MIR-29b /c metylácie promótorom v DNMT3A-knockdown buniek bola 34,2%, čo je podstatne nižšia ako kontrolná bunky (58,6%, obr 3B). Tento výsledok ukazuje, že transkripčný umlčanie MIR-29b /c v GC buniek je spojená s prítomnosťou CPG ostrova hypermetylace, čo bolo potvrdené meraním zrelé MIR-29b /c pomocou QRT-PCR. Tam bola významne zvýšená MIR-29b /c expresiu v bunkách AGS-shDNMT3A a BGC-shDNMT3A v porovnaní s ich kontrolami (obr 3C). Tieto zistenia naznačujú dôležitú molekulárnej základ pre miR29-B /C down-regulácia a podporujú hypotézu, že existuje cross-talk medzi MIR-29b /c a DNMT3A.

DNMT3A podporuje GC bunkovú migráciu

molekulárnej spojenie medzi MIR-29b /c a DNMT3A vzniesol otázku DNMT3A zapojenie do sťahovania GC buniek. Ďalej sme aplikovali in vitro
testy zisťujú funkčné zmeny v správaní buniek tieto zmenené expresie DNMT3A. Test hojenie rán preukázali najmä pomalší oživenie buniek BGC-shDNMT3A v porovnaní s kontrolnými bunkami (obrázok 4A, Top), ale iba mierne oživenie v bunkách AGS-shDNMT3A v porovnaní s kontrolnými bunkami (obrázok 4A, dole). Tieto výsledky ukazujú, že je dôležité, DNMT3A pre mobilitu buniek. Vzhľadom na to, že bunkové adhézne molekuly sú dôležité pre bunkové motility, expresie CDH1 a vimentin boli skúmané pomocou QRT-PCR a westernovým prenosom. Vyradenie DNMT3A expresia významne zvýšil expresiu tak na úrovni mRNA a bielkovín CDH1, ale nemal významný účinok na expresiu vimentin (obr 4B a 4C), čo naznačuje, že CDH1 môže byť cieľom DNMT3A sprostredkovanej dysregulácia bunky pohyblivosť. Ďalej sme vykonali test BGS na génu CDH1 v bunkách DNMT3A-porazený. Ako je znázornené na obr 4D, percento metylovaných CPG sa nachádzajú v CDH1 bola v bunkách DNMT3A ochudobnené nižšie ako u kontrolných buniek (35,8% vs. 94,1%). Tieto výsledky ukazujú, že abnormálne expresie DNMT3A vedie k epigenetické umlčanie CDH1.

MIR-29b /c sa podieľa na potlačenie CDH1

Pre ďalšie skúmanie účinku zmenené spätných 29b /c výraz CDH1, my prechodne transfekovány mir-29b /c napodobňuje alebo negatívna kontrola napodobňujú do BGC-823 buniek. V porovnaní s kontrolami, vynútené expresie MIR-29b /C výrazne zvýšil expresiu CDH1 tak na úrovni mRNA a nízka hladina bielkovín (obr 4E a 4F). Následne stav metylácie promotorové oblasti CDH1 bola skúmaná pomocou testu BGS v Mir-29b /C napodobňuje alebo negatívne kontrolou, napodobňujú prechodne transfekovány BGC-823 buniek. Výsledky ukázali, že frekvencia CDH1 metylácie promótorom v Mir-29b /c nadmerná expresia buniek bola 5,2% alebo 12,9%, čo je podstatne nižšia ako úroveň meranej v kontrolných bunkách (88,2%, obr 4G). Tieto údaje sú v súlade s tým výsledkom, že DNMT3A knockdown sprostredkúva up-regulácia CDH1 a ukazuje, že de-regulácia MIR-29b /c a DNMT3A sa podieľajú na migráciu a inváziu buniek GC.

znížená expresia Mir-29b a mier-29c do GC tkanivách

expresie MIR-29b /C vo 50 GC nádorov a párových nenádorových tkanív bola skúmaná pomocou QRT-PCR. V porovnaní s párových nenádorových tkanív, frekvencia Mir-29b a mier-29c down-regulácia bola 66% (33/50) a 60% (30/50) (definovaná ako pokles väčší ako dvojnásobok), v danom poradí (obr 5A a 5B). Priemerná zmena Záhyb Mir-29b a mier-29c bolo v nádorových tkanivách výrazne nižšie ako v nenádorových tkanív ( P
< 0,01, obr 5C a 5D). Preskúmať klinicko význam Mir-29B a mier-29c expresných vzorov v GC vzniku nádorov, boli analyzované klinické príznaky pacientov GC. Všetci pacienti 43 analyzované boli rozdelené do dvoch skupín podľa Mir-29b a hladín expresie Mir-29c. Znížila MIR-29b silne korelujú so stupňom diferenciácie nádorových buniek a invázie, zatiaľ čo sa znížila Mir-29c iba v korelácii s invázie nádoru (Tabuľka 1). Okrem toho, je vzťah medzi MIR-29b /c expresie a DNMT3A expresie bola testovaná v 33 prípadoch GC. Štúdia ukázala, že združenie DNMT3A expresie bola v negatívnej korelácii s Mir-29b ( R
= -0,640, P Hotel < 0,01, obr 5E) a mier-29c ( R
= -0,349, P Hotel < 0,05, obr 5F). Súhrnne tieto dáta ukazujú, že mier-29b /c môže hrať dôležitú úlohu v progresii žalúdočnej rakoviny.

Diskusia

konzervované MIR-29 rodiny, vrátane MIR-29a, spätných 29b a mier-29c, sa podieľa na niekoľkých pivničných procesy, ako je proliferácia, diferenciácia, apoptózy a metastáz, čo je dobre analyzované rodina miRNA v vzniku nádorov [16]. Predchádzajúce štúdie ukázali, že zvýšená expresia MIR-29a je spojená s lepšie celkové prežitie vo fáze II u pacientov s rakovinou hrubého čreva [27] a nižšie hladiny Mir-29b by mohli podporovať rakoviny prostaty metastázy regulovaním epiteliálne-mezenchýmových prechodové signálne dráhy [28] , Okrem toho, mier-29C funguje ako metastáz supresor, ktorý inhibuje adhéziu buniek rakovina pľúc na extracelulárnej matrix a migrácia in vitro stroje a in vivo
[29]. V GC, významne znížila hladiny Mir-29b a mier-29c, a to najmä, boli pozorované v porovnaní s Mir-29a [14], čo naznačuje, že mier-29b /c môže hrať dôležitú úlohu. Tak, mier-29b /c bol vybraný pre analýzu v tejto štúdii. V tejto štúdii sme ukázali, zvýšená MIR-29b /c potláča migráciu a inváziu buniek BGC-823 za použitia hojenie rán testu a testu Transwell. Tieto výsledky sú v súlade s ostatnými vykazovaných údajov získaných z SGC-7901, HGC-27 a MGC-803 GC buniek [14, 15]. Vzhľadom na to, že mier-29b /c tiež hrať úlohu v proliferáciu a apoptózu v GC, sme hodnotili schopnosť bunkového rastu a mieru bunkovej apoptózy v BGC-823 buniek. Výsledky ukázali, že nie je žiadny rozdiel v proliferáciu na 48 hodín pre mier-29b /c napodobňuje alebo inhibítorov-transfekciou buniek, v porovnaní s negatívnymi kontrolnými bunkami ( P Hotel &0,05, S2A a S2B Obr). Okrem toho, annexin-V farbenie nebolo preukázané žiadne dramatické zvýšenie hladiny apoptózy v Mir-29b /c napodobňuje-transfekciou buniek po 48 hodinách inkubácie (Obr S2C). Okrem toho, analýza bunkového cyklu nepreukázali žiadne významné rozdiely v G1, S, G2 /M fázy po liečbe s Mir-29b /C napodobňuje alebo negatívne kontrolou, napodobňuje počas 48 hodín ( P Hotel &0,05, S2D obr). Tieto údaje naznačujú, že mier-29b /c spomaľuje hojenie oživenie plochy na 48 hodín hlavne z dôvodu znížených pohyblivosť buniek schopností.

miRNA vykonávať svoje funkcie, najmä sa zameriavajú na 3'UTRs rôznych génov. Avšak podrobná molekulárne mechanizmy MIR-29b /c spojené s malígnym vývojom GC sú zle pochopené. Pozoruhodne, mier-29b /c zdieľa rovnakú komplementarita do miest v 3 'UTR DNMT3A, ktorý bol predpovedal programy cieľových predikčných vrátane TargetScan, Miranda a miRBase. Zatiaľ nie je známe, či MIR-29b /c reguluje abnormálne metylácii génov spojených s metastázami interakciou s DNMT3A počas vývoja GC. Preto sme vykonali Luciferase reportéri test a zistilo sa, že expresia s vysokým DNMT3A bola spojená s nízkym Mir-29b /c expresiu v GC buniek, čo ukazuje, DNMT3A je priamy transkripčný cieľom MIR-29b /c. Avšak molekulárnej základ, ktorý vedie k nerovnováhe Mir-29b /c v GC zostáva neznámy. MIR-29 Proximálna predkladatelia majú väzbové miesta pre niekoľko transkripčných faktorov, ako je c-Myc a CEBPA, ktoré prispievajú k deregulácii Mir-29s [30, 31]. Avšak, výskum na epigenetické regulácia miRNA-29 nebola hlásená.

V eukaryotických bunkách, sú tam tri enzymaticky aktívny metyltransferáza DNA (DNMTs), DNMT1, DNMT3A a DNMT3B. Expresie DNMT3A v GC je výrazne vyššia ako u DNMT3B [32, 33]. Navyše len zvýšená DNMT3A expresia je významne spojený s kratším bez ochorenia dobu prežitia v GC [34], čo naznačuje, DNMT3A hrá viac dôležitú úlohu v žalúdočnej rakoviny. Preto sme sa zamerali skúmať, či existujú predpisy negatívna spätná väzba medzi MIR-29b /c a DNMT3A. V tejto štúdii sme použili test BGS k analýze stavu DNA metylácie MIR-29b /c vo DNMT3A RNAi GC buniek. V skutočnosti, znížená MIR-29b /c bolo čiastočne kvôli DNMT3A sprostredkovanej hypermetylace. Ďalej sme potvrdili, že DNMT3A sa podieľa na podpore migrácie GC buniek cez down-reguláciu CDH1. Medzitým sme sa tiež ukázalo, že mier-29b /c sa podieľa na potlačenie CDH1. Charakteristickým znakom nádorových metastáz je strata CDH1 expresia [35], a hypermetylace v promotorové oblasti CDH1 je tiež pozorovaný v GC [36]. Tak, naše výsledky ukazujú, že obaja MIR-29b /c a DNMT3A sú spojené s CDH1 down-regulácia prostredníctvom DNMT3A sprostredkovanej promótorom hypermetylace. Úloha ďalších DMNTs, napríklad DNMT3B, pri úprave Mir-29b /c musí byť posudzovaná v ďalších štúdiách.

V GC vzoriek, sme skúmali expresné vzor MIR-29b /c v 50 párov GC tkaniva. Znížila MIR-29b /c (fold-change cut-off: 2,0) bolo významne koreluje s diferenciácie a invázie stupňa v GC, čo naznačuje, že mier-29b /c hrá rozhodujúcu úlohu v GC malígny údržbu a priamo ukazuje klinický význam Mir -29b /c progresiu GC. Stručne povedané, naša štúdia ukazuje, že tam môže byť cross-talk medzi MIR-29b /c a DNMT3A. Nerovnováha z týchto faktorov môže byť zapojené do migrácie GC a invázie fenotyp. Táto nerovnováha môže obsahovať nízku hladinu expresie MIR-29b /c mohla zrušiť potlačenie DNMT3A a vysokú úroveň DNMT3A ďalej ovplyvňuje expresiu MIR-29b /c pomocou epigenetické mechanizmu. Tieto nálezy môžu byť prospešné pre rozvoj nových liečebných možností pre GC, že cieľové MIR-29b /c a jeho následného génu DNMT3A.

Podporné informácie
S1 Obr. Účinnosť transfekcia bola percento poskytuje vyhodnotenie hladiny MIR-29b /c alebo DNMT3A.
(A a B) QRT-PCR bola vykonaná pre detekciu relatívnej expresie MIR-29b /c v BGC-823 buniek napodobňuje (a), alebo inhibítory (B) po 48-hodinovej transfekciu. (C) RT-PCR a western bloty boli vykonávané na zistenie efektivity DNMT3A Knockdown v BGC a AGS buniek. β
aktínu bol použitý ako kontrola nanášania
doi :. 10,1371 /journal.pone.0123926.s001
(TIF)
S2 Obr. Role MIR-29b /c v cykle proliferácie BGC-823 buniek, apoptóze a buniek.
(A) Rýchlosti bunkového rastu MIR-29b /c nadmernou expresiou boli detekované pomocou CCK-8 testu proliferácie. MIR-29b /c nadmerná expresia nepreukázala žiadny významný rozdiel pri 48 hodín, v porovnaní s negatívnymi kontrolnými bunkami ( P Hotel &0,05). (B) Rýchlosti bunkového rastu MIR-29b inhibícia /c boli detekované pomocou CCK-8 testu proliferácie. Potlačenie MIR-29b /c nepreukázali žiadne významné zmeny na 48 hodín v porovnaní s negatívnymi kontrolnými bunkami ( P Hotel &0,05). (C) Apoptóza test ukazuje žiadne dramatické indukciu apoptózy MIR-29b /c nadmernou expresiou na 48 hodín v porovnaní s negatívnymi kontrolnými bunkami. Biparametric histogram zobrazuje bunku v ranom (pravej dolnej kvadrant) a neskoré apoptotické štáty (pravom hornom kvadrante). (D) test Bunkový cyklus sa vykonáva prietokovou cytometriou na BGC-823 buniek po MIR-29b /c napodobňuje alebo negatívne kontrolné ošetrenie simuluje dobu 48 hodín. Percentá MIR-29b /c nadmerná expresia alebo kontrolné bunky v G1, S a G2 /M sú uvedené v stĺpcovom grafe ako stredná ± s.d. z troch nezávislých experimentov. V porovnaní s kontrolnými bunkami, nebol zistený žiadny významný účinok na bunkový cyklus po MIR-29b /c nadmernou expresiou
doi :. 10,1371 /journal.pone.0123926.s002
(TIF)
S1 metóda. rast buniek a apoptózu test
doi :. 10,1371 /journal.pone.0123926.s003
(DOC)
S2 metóda. . Bunkový cyklus test
doi: 10,1371 /journal.pone.0123926.s004
(DOC)
Tabuľka S1. Klinické príznaky u pacientov s karcinómom žalúdka
doi: 10,1371. /Journal.pone.0123926.s005
(DOC)
S2 stôl. . Mierny napodobňovať a inhibítor sekvenciami a primery použité v tejto štúdii
doi: 10,1371 /journal.pone.0123926.s006
(DOC)

Poďakovanie

Ďakujeme Dr. Gang chen z Nanjing Jiangning nemocnice pre zbieranie vzoriek. Ďakujeme Prof. Sheng Zhong z Capital lekárskej univerzity za pomoc pri úprave rukopisu.

• Ploche ONE: Chrysin Zabraňuje nádoru Promoter vyvolanej MMP-9 Vyjadrenie tým, že blokuje AP-1 cez potláčanie EKR a JNK dráh v žalúdku nádorových buniek
• Ploche ONE: Vplyv odstránenie Helicobacter pylori na expresiu Úrovne FHIT, IL-8 a P73 v žalúdočnej sliznici príbuzným na žalúdočné rakovinu pacientov