Plos ONE: Čezmerno jedrske apoptozo inducira Factor 1 spremenila proteomskimi Profil Human želodca Cancer Cell MKN45 in povzročena celični cikel za prijetje na G1 /S Faza

Povzetek

jedrskih apoptozo inducira faktor 1 (NAIF1) smo že poročali, da inducira apoptozo. Poleg tega je izraz NAIF1 je močno navzdol urejeno v človeške želodčne tkivih raka v primerjavi s sosednjimi normalnih tkivih. Vendar pa je mehanizem, s katerim gen NAIF1 inducira apoptozo ni povsem jasen. Naši rezultati kažejo, da je NAIF1 minimalno izražen v vseh testiranih želodčnih rakavih celic prog. Naši podatki prav tako kažejo, da je NAIF1 lokaliziran v jedrih celic, ki ga spremlja zeleno fluorescence NAIF1-GFP fuzijskega proteina s fluorescentno konfokalno mikroskopijo zaznana. Nato je bila primerjalna proteomskimi pristop uporablja za identifikacijo diferencialno izražanje proteinov med želodčnih raka celičnih linijah MKN45 /NAIF1 (-) in MKN45 /NAIF1 (+). Našli smo pet beljakovine (proteasom 26S podenote 2, proteasoma 26S podenote 13, NADH dehidrogenaze Fe-S protein 1, šaperonina vsebuje TCP1 podenoto 3 in thioredoxin reduktazo 1), ki so se regulirane in trije proteini (ribonukleazni zaviralci 1, 14-3- 3 protein epsilon izooblika in apolipoprotein AI vezave na beljakovine), ki so bili dol-urejeno v celicah MKN45 prekomerno ekspresijo NAIF1. Prav tako smo ugotovili, da bi lahko NAIF1 povzročijo aretacijo celičnega ciklusa pri G1 /S fazo s spremembo izražanje proteinov celičnega ciklusa cyclinD1, cdc2 in p21. Različno izražene beljakovine opredeljene tukaj se nanašajo na različne celične programov, ki vključujejo celično ciklus, apoptozo in regulacijo signalov in kažejo, da lahko NAIF1 tumor supresor raka želodca. Naša raziskava dokazuje, da ta pojasnjuje vlogo kako NAIF1 funkcij na raka želodca

Navedba. Yang M, Zhong J, Zhao M, Wang J, Gu Y, Yuan X, et al. (2014) Čezmerno jedrske apoptozo inducira Factor 1 spremenila proteomskimi Profil Human želodca Cancer Cell MKN45 in povzročena Cell Cycle prijetje na G1 /S faze. PLoS ONE 9 (6): e100216. doi: 10,1371 /journal.pone.0100216

Urednik: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ', Italija

Prejeto: 27. oktober 2013; Sprejeto: 23. maj 2014; Objavljeno: 13. junij 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta raziskave je podprl Nacionalni Key Temeljni raziskovalni program Kitajske (2007CB914700). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je ena izmed najpogostejših malignih obolenj na svetu, ki povzročajo približno 8% in 10% letnih primerov in smrti zaradi raka, v tem zaporedju. Po svetovnem poročilu epidemijo s strani Svetovne zdravstvene organizacije, so po ocenah skoraj milijon želodca primerov raka in 738,000 smrti se je zgodila leta 2008 [1], [2]. Veliko truda je bilo treba v klinični; Vendar pa je smrtnost bolnikov z rakom želodca je še vedno tako visoka kot 70% [2]. Eden od razlogov za to visoko stopnjo umrljivosti, je, da se bolniki z rakom želodca pogosto niso diagnosticirane do fazi, ki je prepozno, da bi zagotovila učinkovito zdravljenje. Zato obstaja očitna potreba po iskanju novih bioloških označevalcev in učinkovite strategije za zgodnje diagnosticiranje in zdravljenje raka želodca.

Proteomika je bil uporabljen v mnogih področjih raziskav, vključno z raziskavami raka. Skupni vzorci v proteomske analize za raziskave raka vključujejo tkiva in krvi pri bolnikih z rakom, pa tudi rak celičnih linij z različnimi ozadji ali različnih obdelav [3] - [6]. Te proteomskimi analize so bile uporabljene, da razišče izvor in razvoj raka ali iskati diagnostičnih biomarkerjev. Rezultate smo pridobili s pomočjo proteomskimi metode niso le zaradi neposredne regulacije transkripcije ravni, ampak odražajo tudi post-translacijske modifikacije proteinov [3], [7]. Zato smo lahko analizirali tako izražanje in ureditev beljakovin z proteomskimi analiz. Kljub veliko nastajajočih tehnologij, je 2-dimenzionalni elektroforeza v povezavi z masno spektrometrijo še vedno najbolj uporabljena metoda za proteomske analize.

človeški gen za jedrsko apoptozo inducira faktor 1 (NAIF1) se nahaja na kromosomu 9q34.11 . NAIF1 kodira protein z myb
-Kot domeno na svojem N-terminalu regijo [8], [9]. Prejšnje študije so pokazale, da čezmerno NAIF1 v človeške rakave celične linije HeLa in MKN45 inducira apoptozo [8], [10]. . Poleg tega luo sod
ugotovljeno, da se NAIF1 močno izražena v normalnem želodca tkivo, medtem ko je njen izraz navzdol regulirano ali izgubljena v želodčnih tkivih rakom ( P <
0.001). Poleg tega je bila NAIF1 izraz višje v dobro diferencirani-( P
= 0,004) kot v moderately- ali slabo diferenciranim rakom želodca [10]. Vendar pa je vloga NAIF1 pri uravnavanju celičnih beljakovin izraz profil ni znan.

V tej raziskavi smo uporabili proteomskimi tehnologijo, ki temelji na 2-dimenzionalni elektroforeza v kombinaciji z MALDI-TOF za identifikacijo proteinov, povezanih z biološke funkcije NAIF1. protein izraz profili želodčni rak celične linije, MKN45 z NAIF1 prekomerno ali brez njega smo analizirali in primerjali z uporabo 24 cm pH 3-10 NL razpon imobiliziran pH gradient (IPG) trakovi. Za potrditev te podatke, smo izmerili RNA raven izražanja vseh različno izraženih proteinov in tri proteine ​​smo dodatno preveril zahodni blot. Naši rezultati kažejo, da NAIF1 povzroča aretacijo celičnega ciklusa po G1 /S fazi z regulacijo ravni izražanja cyclinD1, cdc2 in p21 beljakovin. Rezultati naše raziskave lahko vodi k boljšemu razumevanju tega, kako NAIF1 deluje v inducira apoptozo in tudi lahko osvetlili diagnozo in zdravljenje želodčnih raka v prihodnosti.

Materiali in metode

celične kulture in transfekciji

človekove želodca rakave celične linije MKN45, BGC823, AGS in SGC7901 so bili pridobljeni iz tumorskih celic banke kitajskega Academic medicinskih znanosti in kultivirani v tekočem Dulbeccovem minimalni esencialni medij (DMEM), dopolnjenem z 10% toplotno inaktiviranim fetalnim govejim serumom (FBS), 100 iE /ml penicilina, 100 ug /ml streptomicina pri 37 ° C v navlaženi 5% CO _{2 atmosferi. DNA transfekciji smo izvedli s pomočjo transfekciji reagenta X-tremeGENE HP DNK (Roche, Švica), v skladu z navodili proizvajalca.}

Expression plazmidov

Z izrazom plazmidov pEGFP-N1-NAIF1, ki mnenje s NAIF1-GFP fuzijski protein, in pEGFP-N1, ki izraža zeleni fluorescenčni protein (GFP), je prijazno, ki jih Dr. Qing Luo [10].

Celični ciklus distribucija analiza

eksponentno narašča celice smo transficirali z pEGFP-N1 vektorja ali pEGFP-N1-NAIF1 plazmida. Celice smo zbrali po 24 h in 48 h sporočilo transfekciji in 1 x 10 ^{6 Celice smo dvakrat sprali s fosfatnim pufrom (PBS), in pritrjen s 4% paraformaldehida pri 4 ° C 1 h. Po centrifugiranju celične pelete smo ponovno suspendirali v raztopini barvanja (0,05 mg /ml propidijevim jodidom (PI), 0,2 mg /ml RNaze in 0,1% Triton X-100) pri 4 ° C za 15 minut v temi. Citometrija analiz za dobre kmetijske prakse in PI je bila izvedena s pomočjo mobilnega analizatorja BD LSR II (BD, San Jose, CA, ZDA). PI fluorescence je bila izmerjena med pozitivnim celične populacije GFP in so bili analizirani porazdelitve ciklov celične uporabo ModFit LT3.2 programske opreme. Trije ločeni vzorci so bili pripravljeni in vse teste smo izvedli v treh izvodih.}

Količinska apoptoza

Količinska apoptoze smo izvedli z uporabo PE aneksina apoptoze Detection Kit I (BD). Na kratko smo BGC823 ali MKN45 celice transficirane z pEGFP-N1 vektorja ali pEGFP-N1-NAIF1 plazmida. Po 24 h ali 48 h naknadno transfekciji celice poberemo, izperemo s hladnim PBS dvakrat in nato ponovno suspendiramo v vezavnem pufru (10 mM Hepes /NaOH (pH 7,4), 140 mM NaCI, 2,5 mM CaCl _{2) . Je ponovno suspendiramo celice inkubiramo z fikoeritrin (PE) konjugiranim aneksin V. (AV) in 7-amino-aktinomicin (7-AAD), nato merjena s pretočno citometrijo z uporabo mobilnega analizatorja BD LSR II. Štiri različne populacije celic, ki lahko zazna v dot-parcele: živih celic (AV ^{- /7-AAD -), apoptotske celice zgodnje faze (AV + /7-AAD - ), pozno-fazni apoptotske celice (AV + /7-AAD +) in nekrotične celice (AV - /7-AAD +). Najmanj 10.000 GFP pozitivne celice preštejemo na vzorec in podatki so poročali kot odstotek apoptotskih celic (AV + /7-AAD - in AV + /7-AAD + ) med vsemi celicami. Tri neodvisne priprave vzorca so bile in vsi testi smo ponovili trikrat.}}

Konfokalni skeniranje

oseminštirideset ur po transfekciji smo celice izprali trikrat s PBS in pritrjen s 4% paraformaldehida za 15 min. pri sobni temperaturi. Za povečanje prepustnosti celične membrane, smo celice inkubirali z 0,5% Triton X-100, čemur sledi inkubacija s 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), da se obarva z jedra. Cellular distribucija NAIF1 smo analizirali s spremljanjem zelene fluorescence fuzijskega proteina NAIF1-GFP uporabo Leica Microsystems Heidelberg GmbH mikroskopom.

priprava Protein za 2-DE

Za vsak vzorec, 5 × 10 ^{6 celic so bile pridelane in liziranih v 1 ml liznega pufra (7 M uree, 2 M tiosečnine, 2% CHAPS, 20 mM DL-ditiotreitol (DTT), 1 mM fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF), 30 mM natrijev fluorid, in 0,25 mg /ml RNaseA) 1 uro pri sobni temperaturi, nato pa centrifugirali pri 4 ° C 30 minut. pri 12.000 obratih na minuto. Supernatant smo prenesli v novo epruveto in koncentriramo z 0,1 M NH _{4COOH. Lize buffer dodali do končnega volumna 800 ul, in koncentracija beljakovin je bila določena z uporabo Bradford testa (Tiangen, Peking, Kitajska).}}

dvodimenzionalna elektroforeza

dvodimenzionalna elektroforeza smo izvedli kot je opisano predhodno [5]. Na kratko, je 1 mg proteinov razredčili do 450 ul z rehidracije pufrom (7 M uree, 2 M tiosečnine, 2% CHAPS in 20 mM DTT). IPG trakov (IPG, 24 cm, pH 3-10, NL, GE Limit.) Smo rehidrirano s hidracijo vzorcev za 18 ur pri sobni temperaturi. Beljakovine bili podvrženi Izoelektrično fokusiranje z Ettan IPGphorIII (GE, CT, ZDA) zaporedoma 1 uro pri 100 proti, 1 h pri 250 proti, 1 h pri 500 proti, 1 h pri 1000 proti 1 h pri 3000 V. 1 h pri 5000 v, 2 uri pri 8000 proti in 6 h pri 8000 proti dobili skupno 80 KVH. Po izoelektričnim fokusiranjem so IPG trakovi uravnotežili s ravnovesja blažilnik I (6 M sečnine, 150 mM Tris-HCl (pH 8,8), 30% glicerola, 2% SDS, 1% DTT) za 15 minut. čemur sledi drugo inkubacijo z drugo uravnotežene pufrom II (6 M sečnine, 150 mM Tris-HCl (pH 8,8), 30% glicerola, 2% SDS, 2,5% jodacetamid) 15 min. Drugi-dimenzija SDS-PAGE je bila izvedena s 12,5% SDS-PAGE gelov z uporabo Ettan Dalt šesti vertikalnih sistemov (GE).

Gel za obarvanje in analiza slike

SDS-PAGE geli so bile določene v določitvi-pufra (10% CH _{3COOH, 40% C 2 H 5OH, in 50% DDH 2O) za 30 min. Geli so bili nato sprani s DDH 2O 10 minut. 3-krat in obarvali s Coomassie modro G-250.}

geli so bili skenirani s skenerjem slike z uporabo MagicScan programsko opremo za ocenjevanje naključne vzorce. Imagemaster platine programske opreme (različica 5.0) je bila uporabljena za analizo gel slik. Lise, ki so se pojavile tako na kontrolni gel in NAIF1 gel smo analizirali in intenzivnost vsake točke je količinsko z izračunom obsega točkovno po normalizaciji gel sliko. Kvantitativna analiza gel slik (tri ponovitve /vzorec) so bili sprejeti in lise s statistično značilno razlik (t-test, * P
< 0,05). So izrezali in prebavljiva za identifikacijo

proteinske identifikacije

različno izražene beljakovine lise so pridobljeni in de-obarvajo v 50 mM NH _{4HCO 3 /acetonitril (50/50) in posušimo z vakuumskim centrifugiranjem. Je gel kosov smo nato razgradili z 10 ng /ml tripsina (Promega, WI, ZDA) v 50 mM NH 4HCO 3 pufrom pri 37 ° C preko noči. Tekočina tripsin prenesemo v čisto epruveto, razredčimo s 100 ul 60% acetonitril /0,1% trifluoroocetne kisline in obdelamo z ultrazvokom 15 minut, trikrat. Vse pridobili tekočino zberemo in vakuumsko posušimo in shranimo pri -80 ° C. Eluirani peptide smo analizirali z uporabo Bruker Ultraflex MALDI-TOF /TOF opremljen z virom SCOUT ga BGI-Pekingu. Rezultati množično spektra so v kontrastu z zaporedji sesalcev iz (brez odvečnega) baze podatkov NCBInr za peptid množično identifikacijo prstnih odtisov.}

RNA Isolation, RT in v realnem času Q PCR

je Total RNA pridobljeni z uporabo TRIzola reagenta (Invitrogen) po protokolu proizvajalca. cDNA smo sintetizirali z reverzno transkripcijo z uporabo 1 ug celotne RNA z oligo (dT) _{18 temelji in M-MuLV reverzne transkriptaze (TAKARA).}

Pri vzvratni transkripcijske PCR, so temeljni premazi za NAIF1 in β-aktina kot sledi: NAIF1 občutek, 5'AGCCACGGTCACCCTGACACA-3 ", in anti-sense, 5'CGTGTCTGCATGCTGGGCCAT-3 '; beta-aktin občutek, 5'GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 ", in anti-sense, 5'AGCGAGCATCCCCCAAAGTT. Vse primerji so namenjeni uporabi NCBI trobljenje in kupiti od Sangon, Peking.

Kvantitativni PCR smo izvedli z SYBR Green qPCR Kit (TAKARA, Japonska) z 20 ul reakcijskega sistema, vzpostavljenega v skladu z navodili proizvajalca. Ciljna izražanje genov smo analizirali z ustrezno realnem času qPCR začetnih oligonukleotidov (tabela 1). β-aktina je bila uporabljena za normalizacijo. V realnem času qPCR je bila izvedena na ABI7300 ciklerja (ABI, MA, ZDA) z naslednjimi pogoji: denaturacijo za 30 sekund pri 95 ° C, čemur sledi 40 ciklov denaturacijo za 5 sekund pri 95 ° C, in razširitev za 31 s pri 60 ° C. Taljenje Analiza krivulja je bila izvedena na koncu potrditi specifičnost pričakovanega produkta PCR. Relativna izraz je bila izračunana z uporabo dveh standardnih metod krivulje. Tri neodvisne vzorce smo pripravili za vsako stanje in vsak poskus smo izvedli v treh izvodih.

Western blot

Western blot smo izvedli kot je opisano zgoraj. Na kratko smo 2 x 10 ^{6 celice zberemo s srednje toka peletiramn s centrifugiranjem 5 min pri 500 g
in speremo 3-krat s PBS. Celice nato liziramo s 100 ul liznega pufra (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1.5% NP-40, 0,1% SDS in 50 ug /ml PMSF, s sveže dodano koktajl inhibitorjev proteinaza) na ledu 30 min. Lizate smo centrifugirali pri 13000 obratih na minuto za 15 minut. in koncentracija proteinov smo izmerili s pomočjo Bradford metod. Petdeset mikrogramov proteina smo ločili na 12% SDS-PAGE in prenesli v poliviniliden ditluoridne membrane. Membrane smo blokirali s 5% BSA v TBST eno uro pri sobni temperaturi, čemur sledi inkubacija z rešitvami primarna protiteles v skladu z navodili proizvajalca (β-aktinskih, 1:5000, Sigma, NAIF1, 1:1000, Santa Cruz, 14- 3-3 ε, 1:500, santa Cruz, TCP1-γ, 1:1000, Abcam; TXNRD1, 1:1000, Abcam; CyclinD1, 1:1000, CST, cdc2, 1:500, CST in p21, 1 :500, CST). Membrane smo sprali 3-krat s TBST, čemur sledi inkubacija z ustreznimi sekundarnimi protitelesi za dve uri pri sobni temperaturi. Signali so bile ugotovljene z uporabo sistema ECL kemiluminiscentnim. β-aktina je bil zaposlen kot kontrolo.}

Statistična analiza

Vse statistične analize smo izvedli s pomočjo SPSS 13.0 programske opreme (SPSS Inc., Chicago, IL, ZDA). Podatki so bili izraženi kot sredstvo ± SD. V t-test smo uporabili za statistično primerjavo. Pripadajoča vrednost P <.
0.05 je zdelo pomembno

Rezultati

transfekcirajo NAIF1 lokalizirana v jedru

Tako povratne transkripcijskih PCR in metodo Western blot eksperimentov je pokazala, da je bila NAIF1 minimalno izražen v želodcu raka celičnih linijah, MKN45, BGC823, AGS, in SGC7901; ker NAIF1 je težko odkriti, ko je bilo transfektirali v celice (Slika. 1A in B). transficirane smo fuzijski konstrukcijo z NAIF1-GFP v MKN45 in BGC823 celicah in GFP vektor smo uporabili kot kontrolo. Konfokalna mikroskopija je pokazala, da ko so celice transficirane z pEGFP-N1-NAIF1 konstrukt je zelena fluorescenca odkrita samo v jedra; Nasprotno, je zelena flurescent signala zazna celotnem celici, kadar transfektirana z GFP vektor (slika. 1C). Opazili so tudi enake rezultate v druge celične linije, kot so BGC823 (slika S1). Te ugotovitve so potrdili, da transficirane NAIF1 protein je lokalizirana v jedru.

NAIF1 povzroča zaustavitev celičnega cikla pri G1 /S fazo

Profil celičnega ciklusa želodčnih rakavih celic pod vplivom NAIF1 bila raziskana Naslednji. smo analizirali DKP-pozitivnih celic, da se zagotovi pravilno prebivalstva je bila uporabljena (Slika S2). Analiza toka citometrična pokazala, da NAIF1 povzročil bistveno spremembo v porazdelitvi celičnega cikla: povečanje celične populacije v G0 /G1 fazi in zmanjšanje v fazi S opazili v celicah prekomerno ekspresijo NAIF1 v primerjavi s celicami transfekciji s prazno vektor, oba po transfekciji 24 urah in 48 urah. Kot je prikazano na sliki. 2A, pretočna citometrija je pokazala, da so bili v fazi G0 /G1 24 ur po transfekciji približno 54% od BGC823 celic, transfektiranih s pEGFP-N1 vektorja, in 34% in 12% celic je bilo v S fazi in G2 /M fazi oz . Po drugi strani pa BGC823 celice, transfektirane z pEGFP-N1-NAIF1 konstrukt je bil določen povečanje deleža celic v G0 /G1 fazo (74%), kot tudi zmanjšanje deleža celic v S fazi (26%) in G2 /M faza (0%). Oseminštirideset ur po transfekciji je bilo približno 36% od BGC823 kontrolnih celic v G0 /G1 fazi in 59% in 5% celic v S fazi in G2 /M faze oz. V BGC823 celice transfektirane s pEGFP-N1-NAIF1 konstrukt, je bilo približno 55% celic v G0 /G1 fazi in 37% in 8% celic je bilo v S fazi in G2 /M fazo oz. V MKN45 celic 24 ur po transfekciji je bilo približno 56% celic, transfektiranih z vektorjem pEGFP-N1 v G0 /G1 fazi in 29% in 15% celic je bilo v S fazi in G2 /M fazo oz. Približno je bilo 76% MKN45 celic transfekciji s pEGFP-N1-NAIF1 konstrukta v G0 /G1 fazi, in odstotek celic v S fazi in G2 /M fazi so se znižale za 24% in 0% oz. Oseminštirideset ur po transfekciji je bilo približno 43% kontrolnih celic MKN45 v G0 /G1 fazi in 43% in 14% celic je bilo v S fazi in G2 /M fazo oz. V MKN45 celice transfektirane z pEGFP-N1-NAIF1 gradnjo, je bilo približno 56% celic v G0 /G1 fazi, in 28% in 16% celic je bilo v S fazi in G2 /M fazi, v tem zaporedju (slika. 2B). Ti rezultati jasno kažejo, da prekomerna NAIF1 inducirane ustavitev celičnega cikla v G1 /S faza želodca rakavih celic BGC823 in MKN45.

Da bi pojasnili mehanizem, s katerim NAIF1 povzročeno aretacijo celičnega ciklusa, smo preučili možne vloge cyclinD1 , p21 in cdc2 proteini, ki so pomembni pri regulaciji celičnega cikla v G1 /S fazi. Oseminštirideset ur po transfekciji smo primerjali s kontrolnimi celicami znižala stopnje izraženosti v cyclinD1 in cdc2, tako v BGC823 in MKN45 celic. Poleg tega so stopnje izraženosti p21 povečalo (slika. 2C).

Primerjalna proteomskimi analiza želodčni rak celične linije MKN45 z ali brez dodatnega izražanja NAIF1 beljakovin

proteinski profili MKN45 celice, transfektirane s pEGFP-N1-NAIF1 konstruira kot zdravljeni skupini ali z vektorjem pEGFP-N1, kot sta bila kontrolna skupina, merjeno z 2-DE 48 ur po transfekciji. Skupaj je bilo rešenih več kot 700 mest, od katerih je bilo 11 proteini > 1,5-krat različno izražena kot z analizo z Imagemaster različici 5.0. Različno izražene beljakovine lise smo izrezali iz gela in 8 proteine ​​smo identificirali s MALDI-TOF analize /TOF. Predstavnik tretirana in kontrolna skupina 2-DE gel zemljevidi so prikazani na sliki. 3A in različno izražene beljakovine vložki so označeni. Megascopic 2-DE gel slike vsaka različno izražene beljakovine vložki so prikazani na sliki. 3B in 3C. Pet od proteinov so se regulirane v zdravljeni skupini, vključno z NADH dehidrogenaze (ubikinon) Fe-S proteina 1 (NADUSF1), šaperonina vsebuje TCP1 podenoto 3 (TCP1-y), thioredoxin reduktaze 1 (TXNRD1), proteazomske 26S podenote 2 ( PSMC2) in proteasom 26S podenote 13 (PSMD13). 3 proteine ​​smo navzdol regulirano, vključno ribonukleazna zaviralec 1 (RNH1), 14-3-3 proteina epsilon izooblike (14-3-3 ε) in apolipoproteina A-I vezave na beljakovine (APOAIBP). Tabela 2 prikazuje specifične informacije o teh proteinov in njihovo raven diferencialne ekspresije.

Potrditev različno izražene beljakovine

V realnem času so bile opravljene qPCR in western-blot za preverjanje 2-DE rezultate. ravni genske ekspresije identificiranih proteinov smo analizirali s sprotnim qPCR in so skladni z rezultati 2-DE, razen ene beljakovine, 14-3-3ε (slika. 4A). Tri proteini so bili izbrani na podlagi njihove pomembnosti in verjetnih funkcij za nadaljnjo analizo zahodni blot za preverjanje rezultatov 2-DE. Rezultati kažejo, da so bili nivoji proteina ekspresijski TXNRD1 in TCP1-y v skupini NAIF1 znatno povečal v primerjavi s kontrolno skupino ( P
< 0,05), medtem ko je stopnja proteinski izraz 14-3-3ε je bistveno zmanjšal v skupini NAIF1 ( P <
0,05) (slika 4B.). Na splošno so zahodne rezultati blot so skladni z rezultati 2-DE

Pogovor

Številne študije so bile izvedene za opis gen NAIF1.; Vendar pa je malo znanega o je proteomskimi profil NAIF1 prekomerno. Namen raziskave je bil odkriti in identificirati proteine, katerih izražanje se spremeni v MKN45 celicah prekomerno ekspresijo NAIF1. Poleg tega so na voljo dokazi, da pojasni, kako NAIF1 funkcije inducira apoptozo celic in druge dejavnosti. Strategija 2-DE je bil zaposlen v tej študiji, ker je priročno metodologije in visokim izkoristkom. V celoti smo odkriti in identificirati 5 beljakovine, ki so up-urejena in 3 beljakovine, ki so navzdol urejena v MKN45 celicah prekomerno ekspresijo NAIF1 v primerjavi s kontrolno skupino. Ugotovljene proteini vključujejo številne fiziološke aktivnosti, kot so degradacija proteinov, nadzor celic redoks homeostaze, napredovanju celičnega ciklusa, ureditev citoskeletona, celičnega odziva telesa na stres, apoptoza in uravnavanje metabolizma. Profil celični cikel želodca raka celičnih linij, so raziskovali tudi BGC823 in MKN45, in naši rezultati pokazali, da je čezmerno NAIF1 lahko povzročijo aretacijo celičnega ciklusa po G1 /S fazo preko spreminjanja ravni izražanja regulacijo celičnega ciklusa beljakovin cyclinD1, cdc2 in p21 .

Rezultati zahodni s sušenjem in povratne transkripcije PCR je pokazala, da je bila NAIF1 minimalno izražen v želodcu rakavih celic. Podatki predstavljene tukaj je podobna ugotovitev Luo je v tkivih [10]. Poleg tega smo potrdili, da je NAIF1 jedrska beljakovin v želodcu raka celičnih linij MKN45 in BGC823. Ker genomsko DNA v jedru glavnem obstaja, ti podatki kažejo, da lahko NAIF1 deluje v jedru z interakcijo z genomsko DNA in nukleoprotein, da bi vplivali na izražanje genov in proteinov celovito. V ta namen smo izvedli proteomskimi analizo, da razišče proteomskimi profiliranje MKN45 celic s prekomerno ekspresijo NAIF1.

Nenormalno regulacija celičnega cikla je izjemen značilnost rakavih celic [11]. Študije so pokazale, da lahko številne majhne molekule aktiviranje kontrolnih točk celico cikla in povzročijo aretacijo cikel celic, ki omogočajo celice za popravilo napak. Vendar pa lahko neuspešni repairation vodi do apoptoze [12] - [15]. Naši rezultati kažejo, da NAIF1 povzroča aretacijo celičnega ciklusa po G1 /S fazi. Prehod iz G1 v S fazo zahteva aktiviranje montaže cyclinD-CDK4 /6 in cyclinE-cdc2 (znan tudi kot CDK1). Medtem, p21 inhibira aktivnost cdc2 in posreduje montaže in aktiviranje cyclinD-CDK4 /6 v citoplazmi, kot tudi inhibira svojo dejavnost v jedru [16]. V tej študiji, western blot analizi ugotovili, da so nivoji proteina ekspresijski cyclinD1 in cdc2 znižala, medtem ko je bila stopnja protein izražanje p21 v celicah prekomerno ekspresijo NAIF1 povečala. Ti rezultati kažejo, da je G1 /S celičnega ciklusa prijetje NAIF1 povzroča posredovana preko p21 in cyclinD1 poti. Poleg tega smo pokazali, da je 48 ur po transfekciji v celicah prekomerno ekspresijo NAIF1 kot posledica ustavitev celičnega cikla (slika S3) populacija apoptotskih celic povečala za približno 10%.

26S proteasoma konzervativna organelle v vseh evkariontske celice in je odgovorna za znotrajcelično razgradnjo beljakovin [17]. Beljakovine, ki se razgradi z 26S proteasoma so vključeni v seriji bioloških procesov, vključno z apoptozo, celični ciklus, in rasti ter regulacijo ekspresije številnih genov kar urejanja drugih procesov [18]. Motnje razgradnje beljakovin ravnovesja vodi k nastanku in razvoju raka. Tako, 26S proteasoma je privlačna tarča zdravljenje raka. Tukaj smo ugotovili, da sta bili dve podenote 26S proteazomske, PSMC2 in PSMD13 tako reguliran v MKN45 celicah prekomerno ekspresijo NAIF1. PSMC2 in PSMD13 so podenote proteasoma 19S, ki je regulativno delcev (RP) z proteasoma 26s. PSMC2 je ATPase medtem PSMD13 je ne-ATPaze. Nekateri raziskovalci menijo, da lahko zaviranje 26S proteasoma privede do apoptozo celic karcinoma in inhibitorji proteasom se lahko uporablja za zdravljenje raka [19] - [21]. Vendar pa je študija, ki jo Tan et al.
Kaže, da faktor tumorske nekroze (TNF) -α aktivira proteasoma sistem 26s največ uravnava raven izražanja 26S proteasoma podenote [22]. TNF-α je znana citokinov, ki lahko povzroči apoptozo v različnih rakavih celicah, in zdaj se uporablja v kliniki kot regionalni zdravljenje lokalno napredovalega sarkomov mehkega tkiva in metastaz melanomov za preprečevanje amputacije udov [23]. Kot TNF-a, NAIF1 ima tudi možnost, da povzroči apoptozo, kar pomeni, da se proteasoma 26S lahko sodelujejo v procesu apoptoze s NAIF1 inducirane.

Naši podatki tudi kažejo, da sta dve beljakovine, TXNRD1 in NDUFS1 up-ureja NAIF1. TXNRD1 ureja redoks stanje proteinskih tiolov v celicah sesalcev, in funkcij v obeh spodbujanju in preprečevanje raka na različne vrste karcinomov [24] - [27]. Ni bilo nobenih študij, naj preuči vlogo TXNRD1 pri raku želodca. Po našem mnenju lahko TXNRD1 sodelujejo pri zatiranju želodca geneze raka ali up-regulacijo TXNRD1 je lahko prilagodljivi mehanizem pri odzivu na oksidativnim stresom, ustvarjenega s prekomerno NAIF1. Gen NDUFS1 kodira 75 kDa Fe-S podenoto, ki je eden od sedmih mitohondrijskih podenot kompleksa I [28]. Kompleks I je največji izmed verižnih encimov dihal in pomanjkanje kompleksa I, je glavni vzrok niz prirojenih mitohondrijskih bolezni, kot Leigh sindroma [29]. Poleg tega je 75 kDa podenote kompleksa I je kaspaza substrat, ki je vključen v mitohondrijski apoptozo poti. več mitohondrijskih spremembe, povezane z apoptozo, vključno ravni ATP, proizvodnjo ROS in izgubo celovitosti plasma membrane in tako naprej [30] je potrebno kaspaze cepitev NDUFS1. Ker NAIF1 inducira apoptozo preko mitohondrijske poti [8], smo hipotezo, da je up-ureditev NDUFS1 sodeluje v procesu apoptoze s NAIF1 inducirane.

TCP1-γ je bil opredeljen kot šaperonina v evkariontskih citosolu. Predhodne raziskave so pokazale, da je TCP1-γ pomembno, izražen v tumorjih karcinomom jetrnih celic v primerjavi s seznanjenimi sosednjih brez malignih tumorskih tkivih [31], [32]. Vendar pa je razmerje med TCP1-y in raka želodca še ni znan in je potrebna nadaljnja študija.

Po drugi strani pa smo identificirali tri proteine, 14-3-3ε, RNH1 in APOAIBP, da so navzdol urejeno v MKN45 celicah prekomerno ekspresijo NAIF1. 14-3-3 je družina protein, sestavljen multifunkcionalnih proteine, ki se vežejo in moduliranje funkcije številnih celičnih proteinov. Poleg tega so sodelovali v različnih bioloških procesov, vključno z uredbo celičnega cikla kontrolnih točk, apoptoza in nadzor rasti celic [33]. Številne študije so poročali, da je 14-3-3ε izraz v pljučnega raka, raka hepatocelluar, raka dojke in vulve ploščatoceličnim karcinomom [34] povečalo - [37]. Edina izjema pri tem povečala 14-3-3ε izražanja v želodčnih tkiva raka, kjer se je zmanjšalo izraz [38]. Poleg tega so prejšnje študije pokazale, da lahko up-regulacijo 14-3-3ε preprečevanje Bad-sproži apoptozo v endotelijskih celic [39], in nesteroidna protivnetna zdravila lahko povzročijo kolorektalnega raka apoptozo celic z ukinitvijo 14-3- 3ε izraz [40]. Poleg tega histopatološka študija o katerih so poročali, da je pri 114 bolnikih s hepatocelularnim karcinomom, je bil povišan izraz 14-3-3ε značilno povezana z visokim tveganjem za metastaze in upočasnjeno preživetja [35]. Cellular poskusi potrdili, da povečana 14-3-3ε izraz povzroča migracijo karcinomom jetrnih celic in spodbuja epitelne-mezenhimskih prehod (EMT) z indukcijo Zeb-1 in Polž izraz [41]. Za zaključek, 14-3-3ε je izjemen onkogena, ki sodeluje pri razvoju več tumorjev in ima pomembno vlogo pri apoptozi in metastaz. Tukaj smo ugotovili, da je 14-3-3ε navzdol urejeno v MKN45 celicah prekomerno ekspresijo NAIF1, kar kaže, da se 14-3-3ε lahko sodelujejo v procesu apoptoze s NAIF1 inducirane. Še več, naši podatki pomeni, da poleg inducira apoptozo in celičnega ciklusa prijetja NAIF1 igrajo vlogo pri celični migraciji in metastaz. Naši rezultati kažejo, da so bile stopnje protein izraz za 14-3-3ε zmanjšal, medtem ko se je povečala za RNA. Ti rezultati kažejo, da NAIF1 uravnava raven izražanja 14-3-3ε posttranslationally. Naši podatki kažejo, raven razlika izraz 14-3-3ε so v nasprotju z Leal je [38], ki je lahko posledica razlike med celicami in tkivi, ali je mogoče pripisati pristranskosti pri izbiri vzorca.

RNH1 je citosolni protein, ki zavira RNases in tvori visoko afiniteto heterodimerov z njimi igrati sporno vlogo v angiogenezo [42]. Prišlo je do povečanja raziskavah raziskati odnos med RNH1 in rakom.

• Plos ONE: epidermalna Growth Factor-Like domene, ki vsebujejo beljakovine 7 (EGFL7) Izboljša ESPG receptor-AKT signalizacijo, epitelijskih-mezenhimskih Prehod in metastaze želodčnega raka Cells
• Plos ONE: The NOD-Like Receptor signalizacija Pathway v Helicobacter pylori okužbe in sorodnih želodca raku: primera-Control Study in Gene Expression Analyses