Ploche ONE: Nadmerná jadrovej apoptózu vyvolávajúci faktor 1 zmenil Proteomická Profil Žalúdočné Cancer ľudské bunky MKN45 a indukovaná zástavu bunkového cyklu v G1 /S fáze

abstraktné

Nuclear apoptózu vyvolávajúci faktor 1 (NAIF1) bol predtým hlásená indukcie apoptózy. Okrem toho, expresia NAIF1 významne down-regulované v ľudských nádorových tkanivách žalúdka v porovnaní so susednými normálnych tkanív. Avšak, mechanizmus, ktorým je gén NAIF1 indukuje apoptózu nie je celkom objasnený. Naše výsledky ukazujú, že NAIF1 bola minimálne exprimovaný vo všetkých testovaných bunkových línií karcinómu žalúdka. Naše dáta tiež ukazujú, že NAIF1 je lokalizovaný v jadrách buniek, ako je detekovaná monitorovaním zelenú fluorescenciu fúzneho proteínu NAIF1-GFP s použitím fluorescenčné konfokálna mikroskopia. Ďalšie porovnávacie proteomický prístup bol použitý na identifikáciu diferenciálnej expresie proteínov medzi žalúdočných nádorových bunkových línií MKN45 /NAIF1 (-) a MKN45 /NAIF1 (+). Zistili sme päť proteíny (proteazómu 26S podjednotku 2, proteazómu 26S podjednotku 13, NADH dehydrogenázy Fe-S proteín 1, chaperonin obsahujúce TCP1 podjednotku 3 a thioredoxinreduktázu 1), ktoré sú up-regulované a tri proteíny (ribonukleázovom inhibítora 1, 14-3- 3 proteín epsilon izoformy a apolipoproteín AI viažuci proteín), ktoré boli down-regulované v bunkách MKN45 nadmernú expresiou NAIF1. Tiež sme zistili, že NAIF1 by mohlo vyvolať zástavu bunkového cyklu v G1 /S fáze tým, že mení expresiu proteínov bunkového cyklu cyclinD1, cdc2 a P21. Diferenciálne exprimované proteíny identifikovanej tu sú spojené s rôznymi bunkovými programy obsahujúce bunkový cyklus, apoptózu, a regulácie prenosu signálu, a naznačujú, že NAIF1 môže byť nádorový supresor v karcinómu žalúdka. Náš výskum dokazuje, že objasňuje úlohu tom, ako funkcia NAIF1 u karcinómu žalúdka

Citácia :. Yang M, Zhong J, M Zhao, Wang J., Gu Y, X Yuan et al. (2014) Nadmerná jadrovej apoptózu vyvolávajúci faktor 1 zmenil Proteomická Profil Žalúdočné Cancer ľudské bunky MKN45 a indukovaná zástavu bunkového cyklu v G1 /S fáze. PLoS ONE 9 (6): e100216. doi: 10,1371 /journal.pone.0100216

Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatric Bambino Gesu ', Taliansko

Prijaté: 27. októbra 2013; Prijaté: 23. mája 2014; Uverejnené: 13.června 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Tento výskum bola podporovaná Národným Key základného výskumu programu Číny (2007CB914700). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

karcinóm žalúdka je jedným z najčastejších nádorových ochorení na svete, ktoré spôsobujú približne 8% a 10% ročných prípadov rakoviny a úmrtia, resp. Podľa správy o celosvetovej epidémie Svetovou zdravotníckou organizáciou, takmer milión prípadov karcinómu žalúdka a 738,000 úmrtí Odhaduje sa, že došlo v roku 2008 [1], [2]. Veľa úsilia bolo prijaté v klinickej; Avšak, mortalita pacientov s karcinómom žalúdka je stále rovnako vysoká ako 70% [2]. Jedným z dôvodov tejto vysokej úmrtnosti je, že pacienti s rakovinou žalúdka často nie sú diagnostikované až pokročilé fázy, ktorá je príliš neskoro, aby účinnú liečbu. Z toho dôvodu je tu zrejmá potreba nájsť nové biologické markery a účinnej stratégie pre včasnú diagnózu a liečbu rakoviny žalúdka.

proteomiky bol použitý v mnohých oblastiach výskumu, vrátane výskumu rakoviny. Bežné vzorky v proteomické analýzy pre výskum rakoviny zahŕňajú tkanív a krvi u pacientov s nádorovým ochorením, rovnako ako nádorových bunkových línií z rôznych prostredí alebo rôznych ošetrenie [3] - [6]. Tieto proteomické analýzy boli použité k objavovaniu vznik a vývoj rakoviny alebo hľadať diagnostických biomarkerov. Výsledky, ktoré sme získané proteomických metód nielen vďaka priamej regulácie transkripčný úrovni, ale tiež sa odráža posttranslační modifikácie proteínov, [3], [7]. Preto môžeme analyzovať aj expresie a regulácia proteínu s proteomických analýz. Napriek mnohým nové techniky, 2-rozmerný elektroforéza v spojení s hmotnostnej spektrometrie zostal najpoužívanejšie metódu pre proteomické analýzy.

Ľudský gén kódujúci nukleárnu apoptózu indukujúce faktor 1 (NAIF1) je lokalizovaný na chromozóme 9q34.11 , NAIF1 kóduje proteín s Myb
-ako doménu na svojom N-koncovej oblasti [8], [9]. Predchádzajúce štúdie ukázali, že nadmerná expresia NAIF1 v ľudských nádorových bunkových línií HeLa a MKN45 indukuje apoptózu [8], [10]. . Navyše Luo et al
zistili, že NAIF1 je výrazne vyjadrená v normálnej žalúdočnej tkanive, zatiaľ čo jeho expresie je down-regulovaná alebo stratené v žalúdočných rakovinových tkanivách ( P <
0,001). Okrem toho NAIF1 výraz bol vyšší u dobre diferencovaných ( P
= 0,004) ako u moderately- alebo zle diferencovaného karcinómu žalúdka [10]. Avšak role NAIF1 v regulácii bunkovej expresné proteín profil je známy.

V tejto štúdii sme použili proteomickou technológie založené na 2-rozmerné elektroforézu v kombinácii s hmotnostnej spektrometrie MALDI-TOF na identifikáciu proteínov, spojených s biologické funkcie NAIF1. Expresné proteín profily žalúdočné rakovina bunkové línie, MKN45 s alebo bez NAIF1 nadmernou expresiou boli analyzované a porovnávané s použitím 24 cm pH 3-10 NL rozsah imobilizovaný pH gradientu (IPG) prúžky. Pre validáciu tohto údaja, sme merali hladiny expresie RNA všetkých odlišne exprimovaných proteínov a tri proteíny boli ďalej overená metódou Western blot. Naše výsledky ukazujú, že NAIF1 indukuje zástavu bunkového cyklu v G1 /S fáze reguláciu hladiny expresie cyclinD1, cdc2 a p21 proteínu. Výsledky našej štúdie môže viesť k lepšiemu pochopeniu toho, ako NAIF1 pracuje v indukcii apoptózy a tiež môže vrhnúť svetlo na diagnostiku a liečbu rakoviny žalúdka v budúcnosti.

Materiály a metódy

bunková kultúra a transfekcia

ľudských nádorových bunkových línií žalúdočné MKN45, BGC823, AGS a SGC7901 boli získané z nádorových buniek banky čínskej Academic lekárskych vied a kultivované v kvapalnom Dulbeccova minimálnym esenciálnym médiu (DMEM) doplnenom 10% tepelne inaktivované fetálne hovädzie sérum (FBS), 100 IU /ml penicilínu, 100 ug /ml streptomycínu pri 37 ° C vo zvlhčenej 5% CO _{2 atmosfére. DNA transfekcia bola vykonaná s použitím X-tremeGENE HP DNA transfekčního činidla (Roche, Švajčiarsko) podľa inštrukcií výrobcu.}

expresné plazmidy

expresné plazmidy pEGFP-N1-NAIF1, ktorý exprimuje NAIF1-GFP fúzny proteín, a pEGFP-N1, ktorá exprimuje zelený fluorescenčný proteín (GFP), bol láskavo poskytnutý Dr. Qing Luo [10].

bunkového cyklu distribúcia analýza

Exponenciálne rastúce bunky boli transfekovány vektorom pEGFP-N1 alebo pEGFP-N1-NAIF1 plazmidu. Bunky boli zozbierané po 24 h alebo 48 h po transfekciu a 1 x 10 ^{6 bunky boli dvakrát premyté fyziologickým roztokom pufrovaným fosforečnanom (PBS) a fixované 4% paraformaldehydom pri teplote 4 ° C po dobu 1 hodiny. Po odstredení, bunkové pelety boli resuspendované v farbiacim roztoku (0,05 mg /ml propidium jodidu (PI), 0,2 mg /ml RNáza, a 0,1% Triton X-100) pri teplote 4 ° C počas 15 min v tme. Analýza prietokovou cytometriou na GFP a PI sa vykonáva za použitia analyzátora BD LSR II buniek (BD, San Jose, CA, USA). PI fluorescencie bola meraná medzi pozitívne populácie buniek GFP a distribúcia bunkových cyklov boli analyzované pomocou softvéru ModFit LT3.2. Tri oddelené vzorky boli pripravené a všetky testy boli vykonané v troch opakovaniach.}

Kvantifikácia apoptózy

Kvantifikácia apoptózy bola vykonaná s použitím PE annexinu V apoptózy Detection Kit I (BD). Stručne povedané, BGC823 alebo MKN45 bunky boli transfekovány vektorom pEGFP-N1 alebo pEGFP-N1-NAIF1 plazmidu. Po 24 h alebo 48 h po transfekciu, boli bunky zozbierané, premyté studeným PBS, dvakrát a potom sa resuspendujú väzbovým pufrom (10 mM HEPES /hydroxid sodný (pH 7,4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl _{2) , Bunky boli resuspendované boli inkubované s fykoerythrinem (PE) konjugovanou annexinu V (AV) a 7-amino-aktinomycín (7-AAD), a potom sa meria pomocou prietokovej cytometrie s použitím analyzátora buniek BD LSR II. Štyri populácie odlišné buniek by mohli byť detekované v dot-plot: životaschopné bunky (AV ^{- /7-AAD -), skoré fázy apoptotické bunky (AV + /7-AAD - ), neskoré fázy apoptotické bunky (AV + /7-AAD +) a nekrotické bunky (AV - /7-AAD +). Minimálne 10000 GFP pozitívnych buniek bolo počítané na vzorku a dáta bola označená ako percento apoptotických buniek (AV + /7-AAD - a AV + /7-AAD + ) medzi celkovým buniek. Tri nezávislé vzoriek prebiehala príprava a všetky testy boli opakované trikrát.}}

konfokálna skenovanie

Štyridsať osem hodín po transfekciu, boli bunky trikrát premyté PBS a fixované 4% paraformaldehydom po dobu 15 min. pri izbovej teplote. Pre zvýšenie permeability bunkovej membrány, boli bunky inkubované s 0,5% Triton X-100, nasledovala inkubácia s 4 ', 6-diamidínov-2-fenylindolu (DAPI), aby škvrny jadier. Bunková distribúcia NAIF1 bola analyzovaná sledovaním zelenej fluorescencie fúzneho proteínu NAIF1-GFP s použitím Leica Microsystems GmbH Heidelberg mikroskopu.

proteínového prípravku pre 2-DE

pre každú vzorku, 5 x 10 ^{6 bunky boli odobraté a lyžovanie v 1 ml lyzačného pufra (7 M močovina, 2 M tiomočoviny, 2% CHAPS, 20 mM DL-dithiothreitolu (DTT), 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 30 mM fluoridu sodného, ​​a 0,25 mg /ml RNaseA) po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti, a potom sa odstredí pri teplote 4 ° C počas 30 minút. pri 12000 otáčkach za minútu. Supernatant bol prenesený do novej skúmavky a zahustí sa s 0,1 M NH _{4COOH. Lyzačný pufor sa pridá do konečného objemu 800 ul a koncentrácia proteínu bola stanovená použitím testu Bradford (Tiangen, Beijing, Čína).}}

Dvojrozmerná elektroforéza

Dvojrozmerná elektroforéza bola vykonaná, ako bolo opísané skôr [5]. Stručne povedané, 1 mg proteínov sa zriedi 450 ul pufru (s rehydratačný 7 M močoviny, 2 M tiomočoviny, 2% CHAPS, a 20 mM DTT). IPG prúžky (IPG, 24 cm, pH 3-10, NL, GE Limit.) Boli rehydratovaný s rehydratovaných vzorkami počas 18 hodín pri teplote miestnosti. Proteíny boli podrobené izoelektrické zaostrovanie sa Ettan IPGphorIII (GE, CT, USA) postupne po dobu 1 hodiny pri 100 ° C v, 1 h pri 250 V, 1 hodina pri 500 V, 1 hodina pri 1000 V, 1 hodina pri 3000 V, 1 h pri 5000 v, 2 hodiny pri 8000 v, a 6 hodín pri 8000 v, aby sa celkom 80 KVH. Po izoelektrické zaostrovanie, IPG prúžky boli do rovnovážneho stavu do rovnováhy pufrom I (6 M močovina, 150 mM Tris-HCl (pH 8,8), 30% glycerol, 2% SDS, 1% DTT) po dobu 15 min. nasleduje druhá inkubácie s iným vyrovnávacej pamäte II (6 M močovina, 150 mM Tris-HCl (pH 8,8), 30% glycerol, 2% SDS, 2,5% jodacetamid) po dobu 15 min. Druhá dimenzia SDS-PAGE bola vykonaná s 12,5% SDS-PAGE géloch s použitím Ettan Dalt SIX vertikálne systémy (GE).

farbenie Gél a analýza obrazu

SDS-PAGE gély boli fixované v fixačným pufri (10% CH _{3COOH, 40% C 2 H 5OH, a 50% DDH 2O) počas 30 minút. Gély boli potom premyté v DDH 2O po dobu 10 minút. 3 krát a zafarbené Coomassie blue G-250.}

Tieto gély boli naskenované pomocou obrazového snímača pomocou MagicScan software pre vyhodnotenie vzory mieste. bol použitý softvér ImageMaster platiny (verzia 5.0), pre analýzu gélu obrázky. Škvŕn, ktoré boli pozorované ako na ovládacom gélu a NAIF1 gélu boli analyzované a intenzita každého miesta bolo vyčíslené pomocou výpočtu objemu bodového po normalizácii na obrázok gélu. Kvantitatívna analýza obrazu gélu (tri opakovania /vzorka) boli odobraté a škvrny, štatisticky významné rozdiely (t-test, * P Hotel &0,05). Boli vyrezané a štiepené pre identifikáciu

Protein identifikácia

rozdielne exprimovaných proteínové škvrny boli získané a de-morený v 50 mM NH _{4HCO 3 /acetonitril (50/50) a sušia sa vo vákuu odstreďovaním. Kusy gélu sa potom rozštiepi pôsobením 10 ng /ml trypsínu (Promega, WI, USA) v 50 mM NH 4HCO 3 pufri pri teplote 37 ° C cez noc. Trypsín kvapalina bola prenesená do čistej skúmavky, zriedi sa 100 ul 60% acetonitrilu /0,1% kyseliny trifluóroctovej, a spracuje ultrazvukom počas 15 minút, trikrát. Všetky získané kvapalina sa oddelí a suší sa vo vákuu a uložia sa pri teplote -80 ° C. Eluovanej peptidy boli analyzované za použitia Bruker Ultraflex MALDI-TOF /TOF vybavený zdrojom Scout BGI-Peking. Výsledky hmotnostné spektrum boli v kontraste proti cicavčích sekvencií z (neredundantní) databáz NCBInr pre peptidové hromadnú identifikáciu odtlačky prstov.}

Izolácia RNA, RT a Real-time PCR Q

Celková RNA bola extrahuje TRIzolu činidlá (Invitrogen) podľa protokolu výrobcu. cDNA bola syntetizovaná reverznej transkripciou za použitia 1 ug celkovej RNA pomocou oligo (dT) _{18 primery a M-Mulva reverznej transkriptázy (TAKARA).}

reverznej transkripčný PCR priméry pre NAIF1 a β-aktínu boli nasledujúcim spôsobom: NAIF1 zmysel, 5'AGCCACGGTCACCCTGACACA-3 ', a anti-sense, 5'CGTGTCTGCATGCTGGGCCAT-3'; beta-aktínu zmysel, 5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 ', a anti-sense, 5'AGCGAGCATCCCCCAAAGTT. Všetky primery boli navrhnuté s použitím NCBI výbuch a zakúpený od Sangon, Beijing.

Kvantitatívne PCR bola vykonaná s SYBR Green qPCR Kit (TAKARA, Japonsko) s reakčným systémom 20 ul zriadeného v súlade s pokynmi výrobcu. Expresia cieľového génu bola analyzovaná za použitia vhodnej real-time qPCR primérov (tabuľka 1). β-aktínu bol použitý pre normalizáciu. V reálnom čase qPCR bola vykonaná na ABI7300 cyklovačom (ABI, MA, USA) za nasledovných podmienok: denaturácia 30 s pri 95 ° C, nasledovalo 40 cyklov denaturácie po dobu 5 s pri 95 ° C, a rozšírenie pre 31 s pri 60 ° C. Teplota topenia: analýza krivky bola vykonaná na konci pre overenie špecificity očakávaného produktu PCR. Relatívna expresia bola vypočítaná s použitím dvoch štandardných metód krivky. Tri nezávislé vzorky boli pripravené pre každú podmienku a každý experiment bol vykonaný v troch opakovaniach.

Western Blotting

Western blot bola vykonaná, ako bolo popísané skôr. Stručne, 2 x 10 ^{6 bunky boli zozbierané s toku média, centrifugovány po dobu 5 minút pri 500 g
, a 3 krát premyté PBS. Bunky boli potom lyžovanie 100 ul lyzačného pufra (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,5% NP-40, 0,1% SDS, a 50 ug /ml PMSF, čerstvo pridaného inhibítora proteinázy kokteil) na ľade po dobu 30 minút. Lyzáty boli odstredovanie pri 13000 otáčkach za minútu po dobu 15 minút. a koncentrácia proteínu bola meraná s použitím metódy Bradford. Päťdesiat mikrogramov bielkoviny sa oddelia na 12% SDS-PAGE a prenesené na polyvinylidendifluoridovou membránu. Membrány boli blokované 5% BSA v TBST po dobu jednej hodiny pri izbovej teplote s následnou inkubáciou s primárnou protilátkou riešenie v súlade s pokynmi výrobcu (β-aktínu, 1: 5000, Sigma, NAIF1, 1: 1000, Santa Cruz; 14- 3-3 ε, 1: 500, Santa Cruz, TCP1-γ, 1: 1000, abca; TXNRD1, 1: 1000, abca; CyclinD1, 1: 1000, CST; cdc2, 1: 500, CST a p21, 1 : 500, CST). Membrány boli premyté 3 krát s TBST, s následnou inkubáciou so zodpovedajúcimi sekundárnymi protilátkami po dobu dvoch hodín pri teplote miestnosti. Signály boli detekované za použitia systému ECL chemiluminiscenciu. β-aktínu bol použitý ako kontrola.}

Štatistická analýza

Všetky štatistické analýzy boli vykonané pomocou SPSS softvér 13,0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Dáta bola vyjadrená ako priemer ± SD. Študenta t-test bol použitý pre štatistické porovnanie. Pridruženou hodnotu P <.
0,05 bola považovaná za významnú

Výsledky

prenesené NAIF1 lokalizovaný v jadre

ako reverznej transkripcii PCR a western blot experimentov, preukázané, že NAIF1 bola minimálne exprimovaný v žalúdočnej rakovinové bunkové línie, MKN45, BGC823, AGS, a SGC7901; keďže, NAIF1 sa ľahko zistiť, kedy bol transfekován do buniek (obr. 1A a B). transfekovány sme fúzny konštrukcie NAIF1-GFP do MKN45 a BGC823 bunky a GFP vektor bol použitý ako kontrola. Konfokálna mikroskopia ukázala, že, keď boli bunky transfekovány s pEGFP-N1-NAIF1 konštruktu, zelená fluorescencia bola detekovaná iba v jadrách; naopak, zelená flurescent signál bol detekovaný v celej bunke, keď transfekovány s vektorom GFP (Obr. 1C). Rovnaké výsledky boli tiež pozorované v iných bunkových líniách, ako sú BGC823 (obr S1). Tieto zistenia potvrdila, že transfekované NAIF1 proteín je lokalizovaný v jadre.

NAIF1 indukované bunkového cyklu v G1 /S fáze

Profil bunkového cyklu buniek karcinómu žalúdka pôsobením NAIF1 bola skúmaná Ďalšie. GFP-pozitívne bunky boli analyzované, aby sa zabezpečilo správne populácie bol použitý (obr S2). Analýza prietokovou cytometriou ukázala, že NAIF1 indukuje významnú zmenu v distribúcii bunkového cyklu: zvýšenie populácie buniek v G0 /G1 fáze a pokles vo fáze S bol pozorovaný u buniek s nadmernou expresiou NAIF1 v porovnaní s bunkami transfekovanými prázdnou vektora, a to ako po transfekciu 24 hodín a 48 hodín. Ako je znázornené na obrázku. 2A, prietoková cytometria ukázala, že 24 hodín po transfekciu sa približne 54% BGC823 buniek transfekciou pEGFP-N1 vektora boli vo fáze G0 /G1, a 34% a 12% buniek bolo vo fáze S a G2 /M fáze, v uvedenom poradí , Na druhej strane, v BGC823 buniek transfekciou s pEGFP-N1-NAIF1 konštruktu došlo k definitívnej zvýšenie percenta buniek v G0 /G1 fáze (74%), ako aj zníženie percenta buniek v S-fáze (26%) a G2 /M fáze (0%). Štyridsať osem hodín po transfekciu sa približne 36% z BGC823 kontrolných buniek boli v G0 /G1 fáze, a 59% až 5% z buniek v S fáze a G2 /M fáze, resp. V BGC823 buniek transfekciou s pEGFP-N1-NAIF1 konštruktu, približne 55% buniek bolo v G0 /G1 fáze, a 37% a 8% buniek bolo vo fáze S a G2 /M fáze, v uvedenom poradí. V bunkách MKN45, 24 h po transfekciu, približne 56% buniek transfekciou vektorom pEGFP-N1 bol v G0 /G1 fáze, a 29% a 15% buniek bolo vo fáze S a G2 /M fáze, v uvedenom poradí. Približne 76% buniek transfekciou MKN45 s pEGFP-N1-NAIF1 konštruktu boli v G0 /G1 fáze, a percentuálny podiel buniek v S-fáze a G2 /M fáza bola znížená na 24% a 0%, v tomto poradí. Štyridsať osem hodín po transfekciu sa približne 43% kontrolných buniek MKN45 boli v G0 /G1 fáze, a 43% a 14% buniek bolo vo fáze S a G2 /M fáze, v uvedenom poradí. V MKN45 buniek transfekciou s pEGFP-N1-NAIF1 konštruktu, približne 56% buniek bolo v G0 /G1 fáze, a 28% a 16% buniek bolo vo fáze S a G2 /M fáze, v danom poradí (obr. 2B). Tieto výsledky jasne ukazujú, že nadmerná expresia NAIF1 indukované zastavenie bunkového cyklu v G1 /S fáze žalúdočné rakovinové bunky BGC823 a MKN45.

Na objasnenie mechanizmus, ktorým NAIF1 indukované zastavenie bunkového cyklu, sme skúmali možné role cyclinD1 , p21 a cdc2 proteíny, ktoré sú dôležité v regulácii bunkového cyklu v G1 /S fáze. Štyridsať osem hodín po transfekciu sa expresné hladiny cyclinD1 a cdc2 boli znížené v porovnaní s kontrolnými bunkami, a to ako v BGC823 a MKN45 buniek. Navyše, expresné hladiny p21 boli zvýšené (obr. 2C).

Porovnávacie proteomické analýzy žalúdočné rakovina bunkové línie MKN45 s alebo bez ďalších expresie proteínu NAIF1

Proteínové profily MKN45 bunky transfekované s pEGFP-N1-NAIF1 konštruktov ako liečené skupiny alebo s komplexom pEGFP-N1 vektora ako kontrolná skupina boli merané pomocou 2-DE 48 hodín po transfekciu. Spolu viac ako 700 miest boli vyriešené, z ktorých 11 bolo proteíny > 1,5krát rozdielne exprimované ako bolo stanovené analýzou s ImageMaster verzie 5.0. Diferenciálne exprimované proteínové škvrny boli vyrezané z gélu a 8 proteíny boli identifikované MALDI-TOF /TOF. Reprezentatívny pokusná a kontrolná skupina 2-DE gélu mapy sú uvedené na obrázku. 3A a rozdielne exprimovaný proteín škvrny sú označené. Megascopic 2-DE gélové obrázky na každej z odlišne exprimovaných proteínových škvŕn sú znázornené na Obr. 3B a 3C. Päť proteínov bola up-regulovaná u liečenej skupiny vrátane NADH dehydrogenázy (ubichinon) Fe-S proteínu 1 (NADUSF1), chaperonin obsahujúce TCP1 subjednotku 3 (TCP1-y), thioredoxin reduktázy 1 (TXNRD1), proteazómu 26S podjednotku 2 ( PSMC2) a proteasomu 26S podjednotka 13 (PSMD13). 3 proteíny boli down-regulované, vrátane inhibítora ribonukleázy 1 (RNH1), proteínu 14-3-3 epsilon izoformy (14-3-3 epsilon) a apolipoproteínu A-I väzbou proteínu (APOAIBP). Tabuľka 2 ukazuje konkrétne informácie o týchto proteínov a ich úroveň rozdielnu expresiu.

Overenie rozdielne exprimované proteíny

Real-time qPCR a western blotting vykonaných na overenie 2-DE výsledky. hladiny génovej expresie identifikovaných proteínov boli analyzované v reálnom čase qPCR a sú v súlade s výsledkami 2-DE, s výnimkou jedného proteínu, 14-3-3ε (obr. 4A). Tri proteíny boli vybrané na základe ich významu a možných funkcií pre ďalšiu analýzu westernovým prenosom na overenie výsledkov 2-DE. Výsledky ukazujú, že hladiny expresie proteínu TXNRD1 a TCP1-y boli významne zvýšila v skupine NAIF1 v porovnaní s kontrolnou skupinou ( P Hotel &0,05), zatiaľ čo expresia proteínu úroveň 14-3-3ε bol významne znížený v skupine NAIF1 ( P <
0,05) (Obrázok 4B) .. Celkovo výsledky Western blot sú v súlade s výsledkom 2-DE

Diskusia

Niekoľko štúdií boli vykonané popisovať gén NAIF1 .; Avšak, len málo je známe o proteomická profil NAIF1 je nadmerne vystavený. Cieľom tejto štúdie bolo zistiť a identifikáciu proteínov, ktorých expresia sa mení v bunkách MKN45 s nadmernou expresiou NAIF1. Ďalej je preukázané, aby vysvetliť, ako NAIF1 funkcie vyvolávajúce apoptózu a ďalšie aktivity. Stratégia 2-DE bol použitý v tejto štúdii kvôli svojej výhodnej metodiky a vysokou účinnosťou. Celkom, a našli sme identifikovali 5 proteíny, ktoré boli up-regulované a 3 proteínov, ktoré boli down-regulované MKN45 buniek s nadmernou expresiou NAIF1 v porovnaní s kontrolnou skupinou. Zistené proteíny zahŕňajú celý rad fyziologických aktivít, ako je degradácia proteínov, kontrola bunkového redox homeostázy, progresiu bunkového cyklu, regulácia cytoskeletu, bunkovej odpovede na stres, apoptózy a regulácia metabolizmu. Profil bunkového cyklu žalúdočných bunkových línií karcinómu, BGC823 a MKN45 sa tiež skúmala, a naše výsledky ukázali, že nadmerná expresia NAIF1 môžu vyvolať zástavu bunkového cyklu v G1 /S fáze prostredníctvom zmenu úrovne expresie regulačných proteínov bunkového cyklu cyclinD1, cdc2 a P21 .

výsledky western blot a reverznej transkripcii PCR preukázané, že NAIF1 bola minimálne exprimovaný v rakovinových bunkách žalúdka. Údaje tu uvedené sú analogické s zistenia Luo je v tkanivách [10]. Navyše sme potvrdili, že NAIF1 je jadrový proteín v bunkových línií karcinómu žalúdka a MKN45 BGC823. Vzhľadom k tomu, genomická DNA existuje prevažne v jadre, tieto údaje naznačujú, že NAIF1 môžu fungovať v jadre interakcií s genómovej DNA a nukleoproteínov s cieľom ovplyvniť expresiu génov a proteínov komplexne. Z tohto dôvodu sme vykonali analýzu proteomickou vyšetrovať proteomickou profilovanie MKN45 buniek s nadmernou expresiou NAIF1.

Abnormálne regulácie bunkového cyklu je pozoruhodným rysom nádorových buniek [11]. Štúdie preukázali, že mnohé malé molekuly môžu aktivovať kontrolné body bunkového cyklu a indukujú zastavenie bunkového cyklu, ktoré umožňujú bunky pre opravu defektov. Avšak, neúspešný opravy sa môžu viesť k apoptóze [12] - [15]. Naše výsledky ukazujú, že NAIF1 indukuje zástavu bunkového cyklu v G1 /S fáze. Prechod z G1 do S fázy, vyžaduje aktiváciu montáže cyclinD-CDK4 /6 a cyklin-cdc2 (tiež známy ako CDK1). Medzitým, p21 inhibuje aktivitu cdc2 a sprostredkováva montáž a aktiváciu cyclinD-CDK4 /6 v cytoplazme, ako aj inhibíciu svoju činnosť v jadre [16]. V tejto štúdii, western blot analýzy zistené, že došlo k zníženiu hladiny expresie proteínu cyclinD1 a cdc2, zatiaľ čo expresia proteínu hladina p21 bola zvýšená v bunkách s nadmernou expresiou NAIF1. Tieto výsledky naznačujú, že G1 /S bunkového cyklu indukované NAIF1 je sprostredkovaná p21 a cyclinD1 dráhy. Navyše sme preukázali, že 48 hodín po transfekciu, populácia apoptotických buniek vzrástla približne 10% buniek s nadmernou expresiou v NAIF1 v dôsledku zástavy bunkového cyklu (Obr S3).

26S proteazómu je konzervatívny vo všetkých organela eukaryotické bunky a je zodpovedný za intracelulárnej degradácie proteínov [17]. Proteíny, ktoré sú degradované 26S proteazómu sú zapojené v rade biologických procesov, vrátane apoptózy, bunkového cyklu a rast a reguláciu expresie mnohých génov, ktoré zase regulovať ďalšie procesy [18]. Poruchy degradácia proteínu rovnováhy vedie k vzniku a rozvoju rakoviny. Tak, 26S proteazómu je atraktívny cieľ terapia rakoviny. Tu sme zistili, že dve jednotky 26S proteazómu, PSMC2 a PSMD13, boli obaja up-regulované v bunkách MKN45 s nadmernou expresiou NAIF1. PSMC2 a PSMD13 sú podjednotky proteazómu 19S, čo je regulačná častíc (RP) proteazómu 26S. PSMC2 je ATPázy, zatiaľ čo PSMD13 je non-ATPázy. Niektorí výskumníci sa domnievajú, že inhibícia 26S proteazómu môže viesť k apoptóze buniek karcinómu, a inhibítory proteasomu môžu byť použité pre liečbu rakoviny [19] - [21]. Avšak, štúdie Tan et al.
Naznačuje, že tumor nekrotizujúci faktor (TNF) -α aktivuje proteazómu systém 26s až na regulovanie hladiny expresie 26S proteazómu podjednotky [22]. TNF-α je dobre známy cytokín, ktorý môže indukovať apoptózu v rade nádorových buniek, a teraz sa používa v klinickej praxi ako regionálne liečbe lokálne pokročilého sarkómy mäkkých tkanív a metastázovaniu melanómov, aby sa zabránilo amputácie končatiny [23]. Ako je TNF-a, NAIF1 má tiež schopnosť indukovať apoptózu, čo znamená, že proteazóm 26S môže byť zapojený do procesu apoptózy indukovanej NAIF1.

Naše dáta tiež ukazujú, že dva proteíny, TXNRD1 a NDUFS1, sú up-regulované NAIF1. TXNRD1 reguluje redox stav proteínových tioly v cicavčích bunkách, a funkcie v oboch podpore a prevencii rakoviny v rôznych druhoch nádorov [24] - [27]. Neboli vykonané žiadne štúdie, ktoré skúmajú úlohu TXNRD1 v rakoviny žalúdka. Podľa nášho názoru, TXNRD1 sa môžu podieľať na potlačenie vzniku rakoviny žalúdka alebo up-regulácia TXNRD1 môže byť adaptívne mechanizmus, v reakcii na oxidačný stres vytvorené zvýšenou expresiou NAIF1. Gen NDUFS1 kóduje 75 kDa Fe-S podjednotku, ktorá je jedným zo siedmich mitochondriálnych podjednotky komplexu I [28]. Komplex Aj je najväčší z enzýmov respiračného reťazca a nedostatok komplexu Aj je hlavnou príčinou mnohých vrodených mitochondriálnych ochorení, ako je syndróm Leigh [29]. Okrem toho je 75 kDa podjednotky komplexu I je kaspázy substrát, ktorý sa podieľa na mitochondriálnej apoptózy dráhy. po dobu niekoľkých mitochondriálnych zmeny spojené s apoptózy, vrátane úrovní ATP produkcie ROS a strate integrity plazmatické membrány a tak ďalej [30] je potrebná kaspázy štiepenie NDUFS1. Vzhľadom k tomu, NAIF1 vyvoláva apoptózu prostredníctvom mitochondriálnej dráhy [8], môžeme predpokladať, že up-regulácia NDUFS1 sa podieľa na procese apoptózy indukovanej NAIF1.

TCP1-γ bola identifikovaná ako chaperonin v eukaryotických cytosolu. Predchádzajúce výskumy bolo zistené, že TCP1-γ je významný vyjadrená v nádoroch hepatocelulárneho karcinómu v porovnaní s párových susednými nemalígna nádorového tkaniva [31], [32]. Avšak, vzťah medzi TCP1-gama a rakoviny žalúdka je stále neznámy a je potrebné ďalšie štúdie.

Na druhú stranu sme identifikovali tri proteíny, 14-3-3ε, RNH1 a APOAIBP, ktoré boli down regulované MKN45 buniek s nadmernou expresiou NAIF1. 14-3-3 je rodina proteín pozostávajúci z multifunkčných proteínov, ktoré sa viažu na a modulujú funkcie širokej škály bunkových proteínov. Ďalej sa podieľa na rôznych biologických procesov, vrátane regulácie bunkového cyklu kontrolného bodu, apoptózy a riadenie bunkového rastu [33]. Niektoré štúdie uvádzajú, že 14-3-3ε expresia je zvýšená u rakoviny pľúc, rakoviny, hepatocelulárny rakoviny prsníka a vulvy spinocelulárneho karcinómu [34] - [37]. Jedinou výnimkou z tohto zvýšeného 14-3-3ε výrazu je v žalúdočných rakovinových tkanív, kde je výraz znížil [38]. Okrem toho, predchádzajúce štúdie ukázali, že up-regulácia 14-3-3ε môže zabrániť Bad-vyvolalo apoptózu endotelových buniek [39], a nesteroidné protizápalové lieky môžu indukovať apoptózu buniek karcinómu hrubého čreva a potlačením 14-3- 3ε výraz [40]. Okrem toho histologické štúdia uvádza, že v 114 pacientov s hepatocelulárnym karcinómom, zvýšená expresia 14-3-3ε bola významne spojené s vysokým rizikom metastáz a zníženej prežitie [35]. Bunkové experimenty potvrdili, že zvýšená 14-3-3ε výraz vyvoláva migráciu hepatocelulárny karcinóm a podporuje epitelu-mezenchymálnych prechodu (EMT) navodením Zeb-1 a Slimák vyjadrenie [41]. K záveru, 14-3-3ε je pozoruhodný onkogén, ktorý sa podieľa na vývoji niekoľkých nádorov a hrá dôležitú úlohu v apoptóze a metastáz. Tu sme zistili, že 14-3-3ε je down-regulovaná v bunkách MKN45 s nadmernou expresiou NAIF1, čo naznačuje, že 14-3-3ε môžu byť zapojené do procesu apoptózy vyvolanej NAIF1. Navyše naše údaje znamená, že okrem indukcie apoptózy a bunkového cyklu, NAIF1 môže hrať úlohu v migrácii a metastáz buniek. Naše výsledky ukazujú, že došlo k zníženiu hladiny expresie proteínu 14-3-3ε, zatiaľ čo hladiny RNA bola zvýšená. Tieto výsledky ukazujú, že NAIF1 reguluje hladiny expresie 14-3-3ε posttranslačně. Naše dáta ukazujúci hladiny diferenciálnej expresie 14-3-3ε sú v rozpore s Leal to [38], ktoré môžu byť v dôsledku rozdielu medzi bunkami a tkanivami, alebo môže byť pripísané k vychýleniu výberu vzorky.

RNH1 je cytosolický proteín, ktorý inhibuje RNázy a tvoria heterodiméry s vysokou afinitou s nimi hrať kontroverzné úlohu v angiogenézu [42]. Došlo k nárastu výskumných štúdií skúmať vzťah medzi RNH1 a rakoviny.

• Ploche ONE: epidermálneho rastového faktora-podobná doména obsahujúca proteín 7 (EGFL7) Zvyšuje receptora EGF-Akt signalizáciu, epitelové, mezenchýme prechod, a metastázy karcinómu žalúd…
• Ploche ONE: NOD-like receptora Signalizácia Pathway v infekcie Helicobacter pylori a pridružených rakoviny žalúdka: Prípadová-Control Study a génová expresia Analyses