Catecholamin opregulerer MMP-7-ekspression ved aktivering AP-1 og STAT3 i gastrisk cancer

catecholamin opregulerer MMP-7-ekspression ved aktivering AP-1 og STAT3 i gastrisk cancer
Abstract
Baggrund
stress, angst og depression kan forårsage komplekse fysiologiske og neuroendokrine ændringer, hvilket resulterer i øget niveau af stress relaterede hormon catecholamin, som kan udgøre en primær mekanisme, hvormed fysiologiske faktorer indvirkning genekspression i tumorer. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi virkningerne af catecholamin stimulering på MMP-7-ekspression i gastriske cancerceller og belyst de molekylære mekanismer i opregulering af MMP-7 niveau ved catecholamin gennem en adrenerg signalvej.
Resultater
Øget MMP-7-ekspression blev identificeret ved både mRNA og protein niveauer i de gastrisk cancer celler som reaktion på isoproterenol stimulation. β2-AR antigonist effektivt ophævet isoproterenol-induceret MMP-7-ekspression. Aktiveringen af ​​STAT3 og AP-1 blev fremtrædende induceret af isoproterenol stimulering og AP-1 udviste en større effekt end STAT3 i isoproterenol-induceret MMP-7-ekspression. Mutagenese af tre STAT3 bindingssteder i MMP-7 promotoren ikke undertrykke transaktivering af MMP-7 promotor og silencing STAT3 ekspression var ikke effektiv til at forhindre isoproterenol-induceret MMP-7-ekspression. Imidlertid isoproterenol-induceret MMP-7 promotoraktiviteter blev helt forsvundet, når AP-1-sted blev muteret. STAT3 og c-Jun kunne interagere fysisk og binder til AP-1-stedet, implicerer, at samspillet mellem begge transkriptionelle faktorer på AP-1-stedet er ansvarlig for isoproterenol-stimulerede MMP-7-ekspression i gastriske cancerceller. Ekspressionen af ​​MMP-7 i gastrisk cancer væv fandtes at være på stedet, hvor β2-AR blev overudtrykt og niveauerne af MMP-7 og β2-AR var den højeste i metastatisk locus af mavekræft.
Konklusioner
opregulering af MMP-7-ekspression gennem β2-AR-medierede signalvej er involveret i invasion og metastase af mavekræft.
Baggrund
mavekræft er den næsthyppigste førende årsag til cancerrelateret død, med omkring 700 000 dødsfald hvert år [1, 2]. En af de vigtige faktorer i patogenesen af ​​mavecancer er kronisk infektion med Helicobacter pylori
[3]. Men de fleste inficerede individer ikke udvikle malignitet og resultatet af infektionen afhænger af værten, miljømæssige og andre faktorer [4]. Der er stigende dokumentation rolle psykisk stress i mavekræft debut og udvikling [5]. Flere epidemiologiske undersøgelser har vist, at psykiske eller adfærdsmæssige stressfaktorer kan fremskynde udviklingen af ​​mavekræft [6, 7]. Den præcise mekanisme, hvorved psykisk stress virker i gastrisk cancer progression er uklar.
Stress starter en reaktion af hypothalamus-hypofyse-binyre-aksen (HPA), hvilket resulterer i øget catecholamin plan [8, 9]. Flere undersøgelser har vist, at stimulering af catecholamin forstyrrer bio-adfærd af tumorceller direkte, hovedsagelig gennem p2-adrenerge receptorer (β2-AR) -medieret signalvejen [10-14]. Nylige observationer peger på en potentiel mekanisme for progressionen af ​​ovarie-, nasopharyngeale og pancreascancer indikerer, at catecholamin kan modulere ekspressionen af ​​matrixmetalloproteinase (MMP) -2 og MMP-9 ved stroma og tumorceller [15-17]. Det rejser et interessant spørgsmål, at psykologisk stress kan spille en rolle i udviklingen og progressionen af ​​mavekræft ved at modulere ekspression af MMP gennem β2-AR medierede signalvej.
Akkumulerede linjer af beviser viser, at MMP-7 er involveret i invasion og metastaser af gastrisk cancer [18-24]. MMP-7 er den mindste kendte medlem af MMP familien og besidder den højeste ekstracellulære matrix (ECM) -degradative aktivitet mod en række forskellige ECM komponenter, herunder elastin, gelatine, type IV-collagen, fibronektin, vitronectin, laminin, entactin, aggrecan og proteoglycaner blandt de MMP'er [25, 26]. Det er også i stand til at udløse aktivering af en MMP kaskade [27]. En unik egenskab ved MMP-7 er dens begrænsede ekspression overvejende epitelceller fra kirtelvæv, herunder normale mamma, lever, bugspytkirtel, prostata og peribronchial kirtler [28].
Det har vist sig, at MMP-7 overudtrykkes i invasive cancere i fordøjelsesorganerne, såsom øsofageal [29], gastrisk [30], pancreascancer [31, 32], kolorektal [33-35], lever [36] og andre organer. Ekspressionsniveauet af MMP-7 er signifikant associeret med transformationen af ​​tumorceller, fænotyper af aggressive cancere og tumorudviklingsstadie [37], især i tumorer i mave-tarmkanalen. Overekspressionen af ​​MMP-7 er ofte identificeret i præmaligne gastriske læsioner og mest gastriske carcinomer [18-21, 24, 38]. En positiv korrelation af MMP-7 niveau med tumorinvasion af mavevæggen, lymfeknudemetastase, peritoneal udbredelse og overlevelse mavecancerpatienter er blevet dokumenteret i adskillige undersøgelser [23]. MMP-7 er blevet anerkendt som en vigtig mediator for kræft progression og betragtes som en uafhængig prognostisk markør for primær mavekræft. Imidlertid er de mulige molekylære mekanismer af MMP-7 overekspression i gastrisk cancer, er stadig stort set uudforsket.
I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi virkningerne af catecholamin stimulering på MMP-7-ekspression i gastrisk cancer cellelinjer og belyst de molekylære mekanismer i opreguleringen af ​​MMP-7 niveau ved catecholamin gennem en adrenerg signalvej.
Resultater Salg Isoproterenol stimulering opregulerer ekspressionen af ​​MMP-7
det blev vist, at ekspressionen af ​​MMP-9 i æggestokkene cancer blev signifikant forøget i tumorassocierede makrofager i patienter med forhøjede depressive symptomer [15] og catecholamin potenserede LPS-induceret ekspression af MMP'er i humane monocytter [39]. For at undersøge, om catecholaminreceptorer forbinder med ekspressionen af ​​MMP-7 i gastriske cancerceller, vi først inspiceres virkningerne af β-AR agonist isoproterenol på transkriptionen af ​​MMP-7-genet i gastrisk cancer cellelinjer HGC-27 og MGC-803 . Doserne af catecholamin anvendt i denne undersøgelse blev udvalgt til at afspejle de fysiologiske betingelser i dette hormon i tumorer [40, 41]. Semi-kvantitativ og real-time PCR-analyser viste, at MMP-7-ekspression på transkriptionelt niveau var lavt i gastriske cancercellelinier. Når cellerne blev udsat for 10 uM isoproterenol i serumfrie medier i 12 timer blev MMP-7 mRNA-niveauer forøges bemærkelsesværdigt i begge cellelinier (fig. 1A og 1B). For at bestemme, om den øgede niveau af MMP-7 mRNA fører til en lignende stigning i produktionen protein, MMP-7-ekspression i HGC-27 og MGC-803-celler blev analyseret ved Western blot. Som vist i fig. 1C, isoproterenol stimulering resulterede i en signifikant opregulering af MMP-7-ekspression i HGC-27 og MGC-803 celler. β2-AR, som formidler de fleste af virkningerne af catecholamin, er blevet identificeret i bryst- og ovariecancer celler [11, 13]. For at tydeliggøre betydningen af ​​β2-AR-medieret signalering i MMP-7-ekspression, vi udnyttet en β-AR-antagonist propranolol og selektiv β2-AR-antagonist ICI-118,551 at teste om kan inhiberes virkningen af ​​isoproterenol på MMP-7-ekspression. Vores data viser, at behandling med propranolol og ICI-118,551 effektivt blokeret isoproterenol-stimulerede MMP-7-ekspression (fig. 1D, øvre panel). Vi undersøgte dernæst, om β2-AR udtrykkes i gastriske cancerceller. Dataene viste, at ekspression af β2-AR var påviselig i tre gastriske cancer cellelinjer, herunder HGC-27, MGC-803 og MKN-45 (fig. 1D, nedre panel). Disse data indikerede, at isoproterenol stimulerede produktionen af ​​MMP-7 i gastrisk cancer cellelinjer og at opregulering af MMP-7-ekspression med isoproterenol blev hovedsageligt udløst af β2-AR medieret signalering. Figur 1 Isoproterenol stimulering opregulerer ekspressionen af ​​MMP-7. A og B, HGC-27 og MGC-803 celler blev inkuberet natten over i serumfrit medium og derefter behandlet med 2 eller 10 pM isoproterenol hhv. Ekspressionen af ​​MMP-7 mRNA blev analyseret ved RT-PCR (A) og real-time PCR (B). C, HGC-27-celler blev stimuleret med 0, 1 eller 2 pM isoproterenol og MGC-803 celler med 0, 5 og 10 uM isoproterenol efter serum sult. Ekspressionen af ​​MMP-7-protein blev analyseret ved Western-blot. D, MGC-803-celler blev behandlet med 10 pM propranolol eller 1 uM ICI-118,551 i 1 time og derefter med 10 pM isoproterenol. MMP-7-ekspression blev analyseret ved Western blot (øvre panel); ekspressionen af ​​β2-AR i MGC-803, MKN-45 og HGC-27-celler blev påvist ved Western blot (nederste panel).
Isoproterenol opregulerer MMP-7 promotoraktivitet og aktiverer STAT3 og AP-1
at udforske de molekylære mekanismer, som catecholamin opregulerer MMP-7 udtryk, vi først bestemmes, hvis isoproterenol stimulation direkte kan påvirke MMP-7 promotor-aktivitet. Vi konstruerede et plasmid PMMP-7 indeholdende et luciferasereportergen styret af en 340 bp MMP-7-promotorfragment (-296 - +44) (fig 2A.). MGC-803 celler blev transficeret med PMMP-7 og virkningen af ​​isoproterenol på MMP-7-promotor-aktivitet blev vurderet ved luciferaseassays. Som vist i fig. 2B, efter isoproterenol stimulation i 1 time begyndte luciferaseaktiviteter at stige og gradvist forøget. Ved 6 timer efter eksponering, viste MMP-7 promotoraktiviteter en over fordobling sammenlignet med den ustimulerede kontrolceller, hvilket antyder, at isoproterenol stimulering kunne direkte inducere transaktivering af MMP-7 promotoren. Figur 2 Isoproterenol opregulerer MMP-7 promotoraktivitet og aktiverer STAT3 og AP-1. A, skematisk fremstilling af plasmidet PMMP-7 indeholdende et luciferasereportergen styret af en 340 bp MMP-7-promotorfragment. SBE, STAT3 sted; ABE, AP-1 site. B, MGC-803-celler blev co-transficeret med PMMP-7 og pRL-TK. Efter transfektion i 48 timer blev cellerne inkuberet i serumfrit medium i yderligere 24 timer og derefter stimuleret med 10 pM isoproterenol i 0, 1, 2, 3, 6 eller 9 timer hhv. MMP-7 promotoraktiviteter blev vurderet ved luciferaseassays. C og D, blev MGC-803-celler behandlet med 10 pM propranolol i 1 time og derefter med 10 pM isoproterenol i 0, 15, 30, 60, 120 eller 180 min. Phosphorylering af STAT3 og c-Jun blev analyseret ved Western blot med anti-phosphor-STAT3 og anti-phosphor-c-Jun kanin polyklonale antistoffer. ISO, isoproterenol.
I vores tidligere undersøgelse [42, 43], identificerede vi en AP-1-bindingssted på positionen -67 til -61 og tre STAT3 bindingssteder på positionerne -137 til -122, -168 til -159 og -255 til -245 i MMP-7 promotoren (fig. 2A). Vi viste også, at AP-1 og STAT3 bundet til AP-1 og en af ​​STAT3 (-137 til -122) sites, positivt regulerer MMP-7 transkription. En nylig undersøgelse viste, at catecholamin har potentiale til at aktivere STAT3. For at undersøge om catecholamin stimulerer MMP-7 transkription via aktivering af STAT3 og AP-1, analyserede vi phosphoryleringen af ​​STAT3 og c-Jun. Fig. 2C viste, at isoproterenol forårsagede phosphorylering af STAT3 efter 30 min stimulering og nåede et højdepunkt på 2 timer. Selv aktiveringen af ​​c-Jun var langsom, initieret ved 60 minutter blev en maksimal phosphorylering gennemføres på 2 timer samt (fig. 2D). Det betød, at isoproterenol stimulation frembragte en β2-AR-medierede signal, der udløste aktivering af STAT3 og AP-1.
STAT3 element i MMP-7-promotoren er ikke påkrævet, og STAT3 ikke tilstrækkelig til isoproterenol-induceret MMP-7-ekspression
for at afgøre, om de STAT3 elementer er funktionelle i isoproterenol-induceret MMP-7 gentranskription, vi først påtog mutagenese af tre STAT3 sites gennem mutere de centrale-sekvenser af STAT3 sites baseret på PMMP-7 (fig. 3A) og konstrueret plasmidet PMMP-7ms. Plasmidet blev transficeret i MGC-803 celler. Efter transfektion i 48 timer blev cellerne inkuberet i serumfrit medium natten over og derefter stimuleret med 10 uM af isoproterenol i 6 timer. Vi bemærkede overraskende, at mutation af alle tre STAT3-bindingssteder havde nogen fremtrædende virkning på transaktivering af MMP-7 promotoren. Som vist i fig. 3B luciferaseaktiviteter blev gradvist forøget, og nærmede sig en top ved 6 timer efter eksponering. Resultatet var meget lig den, der observeres i cellerne transficeret med vildtype MMP-7 promotoren. At identificere rolle STAT3 i denne begivenhed, blev HGC-27 og MGC-803-celler transficeret med pGeneSuppressor udtrykker shRNA målrettet STAT3 og HGC-27 /STAT3-sh og MGC-803 /STAT3-sh celler etableret. Fig. 3C viste, at ekspressionen af ​​STAT3 effektivt undertrykt i begge celler. I overensstemmelse med ovennævnte data, isoproterenol-induceret MMP-7 promoter aktiviteter syntes ikke at blive væsentligt forringet i MGC-803 /STAT3-sh celler (fig. 3D). Endvidere blev isoproterenol-induceret MMP-7-ekspression i både mRNA og protein niveauer ikke vigtigere påvirket af lyddæmpende STAT3 ekspression som påvist ved RT-PCR, real-time PCR og Western blot (fig. 3E, F og 3G). Resultaterne antydede, at STAT3 element i MMP-7 promotoren ikke kræves og STAT3 ikke tilstrækkelig til isoproterenol-induceret MMP-7-ekspression. Figur 3 STAT3 element i MMP-7-promotoren er ikke påkrævet, og STAT3 ikke tilstrækkelig til isoproterenol-induceret MMP-7-ekspression. A, skematisk fremstilling af plasmidet PMMP-7ms indeholdende tre muterede STAT3-steder ved positionerne -255 til -245, -168 til -159 og -137 til -122. B, MGC-803-celler blev co-transficeret med PMMP-7ms og pRL-TK, udsultet, og derefter stimuleret med 10 pM isoproterenol i 0, 1, 2, 3, 6 eller 9 timer hhv. MMP-7 promotoraktiviteter blev vurderet ved luciferaseassays. C, HGC-27 og MGC-803 celler blev stabilt transficeret med pGeneSuppressor udtrykker STAT3 shRNA. Ekspressionen af ​​STAT3 blev analyseret ved Western blot i HGC-27 /STAT3-sh og MGC-803 /STAT3-SH-celler. D, MMP-7 promotoraktiviteter blev analyseret i MGC-803 /STAT3-SH-celler efter stimulering med 10 pM isoproterenol i 0, 1, 2, 3, 6 eller 9 timer hhv. E til G, HGC-27 /STAT3-sh og MGC-803 /STAT3-SH-celler blev stimuleret med 2 uM eller 10 pM isoproterenol hhv. Ekspressionen af ​​MMP-7 blev analyseret ved RT-PCR (E), real-time PCR (F) og Western blot (G).
AP-1 spiller en kritisk rolle i isoproterenol-induceret MMP-7-ekspression
ovenstående data var uventet, eftersom STAT3 kunne aktiveres af isoproterenol stimulation. Desuden i vores tidligere undersøgelse [42, 43], demonstrerede vi, at STAT3 og AP-1 deltog i reguleringen Her2 signalering medieret MMP-7-ekspression i brystcancerceller. Vi derefter forsøgt at undersøge, om AP-1 påvirkninger isoproterenol-induceret MMP-7-ekspression. MGC-803 celler blev transficeret med plasmidet PMMP-7mA indeholdende et muteret AP-1-sted i position -67 til -61 i MMP-7 promotor og luciferaseaktiviteter målt (fig. 4A). Overraskende blev isoproterenol-induceret MMP-7 promotoraktiviteter helt forsvundet på alle tidspunkter (fig. 4B), hvilket antyder, at AP-1-stedet var afgørende isoproterenol-induceret MMP-7-ekspression. Figur 4 AP-1 spiller en kritisk rolle i isoproterenol-induceret MMP-7-ekspression. A, skematisk fremstilling af plasmidet PMMP-7mA indeholdende et muteret AP-1-sted i position -67 til -61. B, MGC-803-celler blev co-transficeret med PMMP-7mA og pRL-TK, udsultet og derefter stimuleret med 10 pM isoproterenol i 0, 1, 2, 3, 6 eller 9 timer hhv. MMP-7 promotoraktiviteter blev vurderet ved luciferaseassays. C, MGC-803 celler co-transficeret med TAM67, PMMP-7 og pRL-TK blev induceret med 10 pM isoproterenol. MMP-7 promotoraktiviteter blev analyseret ved luciferaseassays. D, MGC-803-celler der stabilt udtrykker shRNA målretning c-Jun (MGC-803 /c-Jun-sh) blev etableret og c-Jun-ekspression blev analyseret ved Western-blot. E, MMP-7 promotoraktiviteter blev analyseret i MGC-803 /c-Jun-SH-celler efter stimulering med 10 pM isoproterenol i 0, 1, 2, 3, 6 eller 9 timer hhv. F, MMP-7-ekspression blev analyseret i MGC-803 /c-Jun-SH-celler efter stimulering med 0, 2 eller 10 pM isoproterenol hhv. G, de plasmider, der udtrykker c-Jun og STAT3C blev transficeret ind MGC-803 /c-Jun-SH-celler, hhv. MMP-7 promotoraktiviteter blev analyseret ved luciferaseassays.
At bekræfte isoproterenol-induceret MMP-7-ekspression kontrolleres af AP-1, derefter undersøgt vi, om transaktivering af MMP-7 promotoren induceret af isoproterenol kunne inhiberes af en dominerende negativ c-Jun-mutant TAM67, som mangler c-Jun 5'-transaktiverende domæne, men besidder en funktionel c-Jun-leucin-zipper og DNA-bindende domæne. Efter transient transfektion med TAM67 ind MGC-803 celler, blev isoproterenol-induceret transaktivering af MMP-7 promotoren analyseret ved luciferaseassays. Som vist i fig. 4C, ekspressionen af ​​den dominante negative c-Jun udviste en iøjnefaldende afdæmpende virkning på MMP-7 promotoraktiviteter. For yderligere at verificere den kritiske rolle, AP-1 testede vi, om blokering endogent udtrykte c-Jun kan inhibere ekspressionen af ​​MMP-7. De MGC-803 /c-Jun-SH-celler blev etableret (fig. 4D) og MMP-7 promotoraktiviteter analyseret ved luciferaseassays. Dataene i fig. 4E viste, at aktiviteterne af MMP-7-promotoren påfaldende blev reduceret med knock-down af c-Jun-ekspression. Western blot-analyse viste også, at isoprotereol-induceret MMP-7-ekspression blev markant reduceret i MGC-803 /c-Jun-SH-celler, hvorimod en i det væsentlige stor mængde MMP-7-protein blev påvist i de parentale celler efter isoproterenol stimulation (Fig. 4F). Især overekspressionen af ​​exogent c-Jun dramatisk restaureret MMP-7 promotoraktiviteter i MGC-803 /c-Jun-SH-celler, men konstitutivt aktiveret STAT3 mutant STAT3C kun minimalt aktiverede MMP-7-promotor, når c-Jun-ekspression blev stille (Fig . 4G). Disse data beviste at AP-1 domineret isoproterenol-induceret MMP-7-ekspression.
C-Jun og STAT3 synergistisk regulerer MMP-7-ekspression i respons på isoproterenol stimulering
samarbejde af Stat3 og c-Jun i reguleringen forskellige gentransskription er blevet rapporteret. Vores tidligere undersøgelse viser, at aktiveringen af ​​MMP-9-promotor er afhængig af interaktionen mellem Stat3 og AP-1 [44]. Som nævnt ovenfor isoproterenol stimulering inducerede aktivering af STAT3 og AP-1 samtidigt. Vi spekulerede at Stat3 og AP-1 synergistisk kan deltage i reguleringen af ​​isoproterenol-stimuleret MMP-7-ekspression. Det er blevet anført, at AP-1 samarbejder med STAT3 i interleukin 6-induceret transaktivering af IL-6 responselement i fravær af direkte AP-1 DNA binding [45]. Det fik os til at teste den mulige kooperativ binding af AP-1 /STAT3 til AP-1 stedet.
At afgøre, om der STAT3 og AP-1 kan rekrutteres til AP-1 stedet i MMP-7 promotor in vivo blev MGC-803-celler stimuleret med 10 uM isoproterenol i 0, 2,5 eller 4 t. Kromatin DNA /nukleare proteinkomplekser blev fremstillet og binding af STAT3 og c-Jun til AP-1-sted blev analyseret ved chip assays. PCR-produktet er valgt til amplifikation strækker sig fra -76 til 165 region huser AP-1-stedet i MMP-7 promotoren. Den immunpræcipitation med anti-STAT3 og anti-c-Jun-antistoffer efterfulgt af PCR gav et forventet 241 bp band fra fældningsmidler efter isoproterenol stimulering i 2,5 timer. De intensiteter af disse bånd blev svækket efter 4 timer. I modsætning hertil i ustimulerede kontrolceller ingen binding af STAT3 på denne side blev observeret, og bindingen af ​​c-Jun næppe detekterbar. Ingen bånd blev amplificeret ved immunfældning under anvendelse af kanin-IgG (fig. 5A). Dataene blev bekræftet ved real-time PCR (fig. 5B). Disse data viste, at sammenslutningen af ​​STAT3 og c-Jun med MMP-7 promotor in vivo
var specifikke, og at isoproterenol stimulering induceret binding af STAT3 /c-Jun til AP-1 element. Figur 5 c-Jun og STAT3 synergistisk regulerer MMP-7-ekspression. A og B, blev MGC-803-celler stimuleret med 10 uM isoproterenol i 0, 2,5 eller 4 t. Kromatin DNA /protein-komplekser nukleare fremstillet. Binding af STAT3 og c-Jun til AP-1-sted blev analyseret ved immunfældning med anti-STAT3 og anti-AP-1-antistoffer efterfulgt af PCR (A) og real-time PCR (B). C, MGC-803-celler blev behandlet med 10 pM isoproterenol til 0 eller 2,5 t. Den nukleare ekstrakt blev forberedt med en Nuclear-Cytosol Extraction Kit. β-tubulin og AP-2α blev analyseret ved Western blot at undersøge adskillelsen af ​​cytoplasmatiske og nukleare proteiner. C, cytosoliske proteiner; N, kerneproteiner. D, 200 ug kerneekstrakterne blev inkuberet ved 4 ° C i 4 timer med de biotinylerede oligonukleotider indeholdende AP-1 konsensussekvensen tidligere koblet til Dynabeads M-280 i nærvær eller fravær af en, fem eller 15 gange så stor mængde af den dobbelte -stranded oligonucleotid konkurrenter. Inkubation af de nukleare proteiner med de dobbeltstrengede oligonukleotider indeholdende en muteret AP-1-sted (Mut oligo) eller ikke-specifikke dobbeltstrengede oligonukleotider (NS Oligo) blev anvendt som kontroller. Protein /DNA-komplekser blev separeret med en Dynal magnet, og underkastet SDS-PAGE. STAT3 og c-Jun blev påvist ved Western blot med anti-STAT3 og anti-c-Jun-antistoffer. E og F, MGC-803-celler blev co-transficeret med plasmiderne PMMP-7mA og pCDNA3.1 /c-Jun eller STAT3C og luciferaseaktiviteter blev analyseret.
Til yderligere karakterisering af interaktionen af ​​STAT3 /c-Jun med AP-1-sted, udførte vi en DNA affinitet udfældning assay. Efter MGC-803-celler blev behandlet med isoproterenol i 2,5 timer blev kerneekstrakt fremstillet og dets kvalitet blev vurderet (fig. 5C). De biotinylerede oligonukleotider svarende til -74 til -52 region af MMP-7 promotor blev inkuberet med 200 ug af de nukleare uddrag pull-down-analyser. De streptavidin-coatede magnetiske perler blev anvendt til at udfælde biotinmærkede dobbeltstrengede oligonukleotider og associerede DNA-bindende proteiner. Bindingen af ​​kerneproteiner til de biotinylerede oligonukleotider blev analyseret i nærvær af én, fem eller 15 gange så stor mængde dobbeltstrenget oligonukleotid konkurrenter indeholdende AP-1 konsensussekvenser. Inkubation af de nukleare proteiner med de dobbeltstrengede oligonukleotider indeholdende et muteret AP-1-stedet eller ikke-specifikke dobbeltstrengede oligonukleotider blev anvendt som kontroller. De resulterende DNA-proteinkomplekser blev opløst ved SDS-PAGE, efterfulgt af Western blot med anti-c-Jun og anti-STAT3 antistoffer. Associering af begge transkriptionelle faktorer med oligonukleotider indeholdende AP-1 konsensussekvenser klart kunne påvises i de nukleare ekstrakter fra isoproterenol-stimulerede celler, men ikke fra ustimulerede celler. Konkurrence med femten gange så stor mængde af konkurrenterne fuldstændig ophævede dannelsen af ​​de biotinylerede DNA /protein-komplekser (fig. 5D). Ingen binding af c-Jun og STAT3 til enten blev detekteret oligonukleotiderne indeholdende et muteret AP-1-stedet eller ikke-specifikke oligonukleotider (fig. 5D). Dette eksperiment giver in vitro-beviser til at bekræfte, at STAT3 og c-Jun, under catecholamin stimulation, kan fysisk interagere og binde sig til AP-1 stedet for at opnå transaktivering af MMP-7-genet i gastrisk kræftceller.
Vi viste, at isoproterenol -inducerede MMP-7 promotor aktivering blev ikke forstyrret af mutagenese af kerne-sekvenserne af alle tre STAT3 sites, hvilket antyder, at STAT3 elementer ikke kan handle i isoproterenol-induceret MMP-7 gentranskription i gastriske cancerceller. For yderligere at verificere rolle AP-1 element, plasmidet PMMP-7mA blev cotransficeret ind MGC-803 celler med enten pCDNA3.1 /c-Jun eller STAT3C hhv. Interessant mutationen af ​​AP-1-bindingssted grundigt blokeret aktiveringen af ​​MMP-7-promotoren i de transficerede celler overudtrykker enten c-Jun eller STAT3C (fig. 5E og 5F), hvilket viser, at AP-1-stedet er et vigtigt regulatorisk element og den synergistiske regulering af isoproterenol-induceret MMP-7-ekspression ved STAT3 og AP-1 er afhængig af dette element.
β2-AR og MMP-7 blev colocalized i gastrisk cancer væv
overekspression af MMP-7 var ofte på invasiv forsiden af ​​human gastrisk cancer og er direkte forbundet med prognosen hos patienter med gastrisk cancer. For at undersøge korrelationen af ​​β2-AR niveau med MMP-7-ekspression i human gastrisk cancer, vi samlet fem mavekræft vævsprøver og analyseret udtryk for β2-AR og MMP-7 ved immunhistokemisk mærkning. Interessant nok stærk ekspression af β2-AR og MMP-7 opstået ved den samme region af tumorvæv (fig. 6A), hvilket tyder på et intimt forhold mellem MMP-7 og β2-AR. For yderligere at undersøge rollen af ​​MMP-7 og β2-AR i metastase af gastrisk cancer, analyserede vi ekspressionen MMP-7 og p-AR'er i kræft, peri-kræft og metastatiske væv fra en patient med mavekræft. Som vist i fig. 6B, ekspressionen af ​​β1-AR, β2-AR og MMP-7 på proteinniveau var højere i kræftvæv end i peri-cancrøse væv. Imidlertid blev den højeste ekspression af dem fundet i metastatiske væv. Desuden blev MMP-7 mRNA overudtrykkes også i de metastatiske væv (fig. 6C). Disse data kraftigt indebære en tæt forbindelse mellem MMP-7, β2-AR og metastase af mavekræft. Figur 6 β2-AR og MMP-7 blev overudtrykt i gastrisk cancer væv. A blev fem gastrisk cancer vævsprøver opsamlet. Ekspressionen af ​​β2-AR og MMP-7 blev analyseret ved immunohistokemi. B, ekspressionen af ​​MMP-7, blev β1-AR og β2-AR i kræft, peri-kræft og metastatiske væv analyseret ved Western-blot. C, niveauet af MMP-7 mRNA i de cancerøse, peri-kræft og metastatiske væv blev analyseret ved real-time PCR.
Diskussion
Den foreliggende undersøgelse var baseret på den hypotese, at psykosociale stress kan være en prædisponerende faktor i gastrisk cancer. Stress, angst og depression kan forårsage komplekse fysiologiske og neuroendokrine ændringer, der påvirker flere systemer, herunder fordøjelsessystemet. De kræftpatienter oplever ofte betydelig følelsesmæssig nød. Associeringen af ​​fysiologisk stress med elevation af mavesyresekretion og mavepine har længe været bemærket [46, 47]. Det er blevet rapporteret, at kronisk stress kan forværre mavesår. I en nylig populationsbaseret undersøgelse indskrevet 2014 forsøgspersoner blev stress betragtes som den mest magtfulde risikofaktor for mavekræft [48]. Resultaterne fra eksperimentelle undersøgelser tyder på, at øget aktivitet af det sympatiske nervesystem kan udgøre en primær mekanisme, ved hvilken fysiologiske faktorer indvirkning genekspression i tumorer [49]. Til dato har de fleste studier, der undersøger de mekanismer der forbinder stress og kræft progression været relateret til indirekte virkninger gennem immunosuppression [8]. I flere nylige undersøgelser, blev stress relaterede proteiner og veje knyttet direkte til den adfærdsmæssige ændring af maligne celler [10-17]. Men der er en mangel på data, der afgrænser de molekylære mekanismer, der er involveret.
I den foreliggende undersøgelse identificerede vi øget MMP-7-ekspression i de gastriske cancercellelinier som reaktion på stimulering af stressrelaterede hormon catecholamin. Det anslås, at koncentrationen af ​​catecholamin kunne være flere end 100 gange højere i tumormikromiljøet end i normale væv og cirkulerende plasma. MMP-7 er enestående i sin begrænsede ekspression i tumorceller, hvilket indikerer, at MMP-7-ekspression er i en tumor-associeret mode. Vi bemærkede, at isoproterenol stimulation markant opreguleret MMP-7 udtryk på både mRNA og protein niveauer i mavens kræftceller. β2-AR antigonist effektivt ophævet isoproterenol-induceret MMP-7-ekspression opregulering, hvilket antyder, at β2-AR-medierede pathway er involveret i processen.
MMP-7-ekspression styres stramt på niveauet for transkription. Vores tidligere undersøgelse viste at heregulin-β-induceret MMP-7-ekspression blev reguleret af HER2-medieret STAT3 og AP-1-aktivering i humane brystcancercellelinier [42, 43]. Vi identificerede også de funktionelle AP-1 og STAT3-bindingssteder i den første 350 bp af transkriptionsstartsitet i human MMP-7 promotoren [42, 43]. En anden undersøgelse viste, at FGF-2 direkte kunne opregulere MMP-7-genekspression i humane tumorcellelinier og navleveneendotelceller gennem AP-1 og STAT3 [50]. Akkumulerende beviser støtter kraftigt, at STAT3 fungerer som en central regulerende node, som flere onkogene signalveje konvergerer [51]. Aberrant aktivering af STAT3 har vist sig at spille en kritisk rolle i gastrisk cancerudvikling [52, 53]. En nylig undersøgelse og vores data afdækket sammenslutningen af ​​catacholamine med STAT3 aktivering i æggestokkene og brystkræft celler [12, 13]. I den foreliggende undersøgelse, vi demonstreret, at isoproterenol stimulation tydeligt induceret aktivering af STAT3 i gastriske cancerceller, implicerer, at catecholamin kan fremskynde ondartet udvikling af gastrisk cancer. Vores offentliggjorte data viste sig også, at isoproterenol stimulerede ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9 i gastriske cancerceller primært gennem aktivering STAT3. i denne undersøgelse, fandt vi imidlertid, at AP-1 udviste en større effekt end STAT3 i isoproterenol-induceret MMP-7 gentranskription og STAT3 elementer var ikke-funktionel, som silencing STAT3 ekspression ikke var effektive i forebyggelsen isoproterenol-induceret MMP- 7 ekspression og mutagenese af tre STAT3 bindingssteder undladt at undertrykke transaktivering af MMP-7-promotoren som reaktion på isoproterenol induktion. I modsætning hertil AP-1-stedet og c-Jun styret denne proces. Interessant nok blev STAT3 og c-Jun sig at binde til det indre AP-1-stedet i MMP-7 promotoren samtidig, implicerer, at samspillet mellem begge transkriptionelle faktorer ved et bindingssted er ansvarlig for isoproterenol-stimulerede MMP-7-ekspression i gastrisk cancer celler. No.

Sequences

P1
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACC-3'
P2
5'-CCCAAGCTTTGCCGTCCAGAGACAATTG-3'
P3
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACCTATGAGAGCAGTCATTTGACGCTGGCAAAA-3'
P4
5'-CATTGTGTGCTCCCTGCCACTAACGATGTAATACTT-3'
P5
5'-TTGTCTTTCAAAGGATT-3'
P6
5'-TACTTCCTCGTCCTAGCCAATGCAAAATAACACATAC-3'
P7
5' 3'
P8
5'-GAAAACACTCAAACGAGTGACCTATTTCCACAT-3'
P9
5'-TTTCTTTTTAGAGTCTACAG-3'
P10
5'-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3'
P11
5'-GTGAGCATCTCCTCCGAGAC-3'
P12
5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'
P13
5'-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'
P14
5'-ACACATACTTTCAAAGTTCTGTAGACTCT-3'
P15
5'-ACGGTGAGTCGCATAGCT-3'

• Proteomisk ændring i gastic adenokarcinomer fra japanske patienter
• En patient med mavekræft med peritoneal carcinomatose behandlet med intraperitoneal kemoterapi, der overlevede mere end 5 år modtager gentagne laparoskopisk undersøgelser: en case-rapport