PLOS Genetics: mutations germinales dans MAP3K6 sont associés à Cancer

familiale gastrique

Résumé

Le cancer gastrique est parmi les principales causes de décès liés au cancer dans le monde entier. Alors que les formes héréditaires de cancer gastrique sont relativement rares, l'identification des gènes responsables de ces cas peuvent éclairer le diagnostic et le traitement pour les deux cas héréditaires et sporadiques de cancer gastrique. Des mutations du gène E-cadhérine, CDH1
, représentent 40% de la forme la plus commune de cancer gastrique familial (FGC), le cancer gastrique héréditaire diffuse (HDGC). Les gènes responsables des formes restantes de FGC sont actuellement inconnus. Ici, nous avons examiné une grande famille de Maritime Canada avec FGC sans mutations
CDH1, et identifié une variante germinale (de p.P946L) dans mitogen-activated protein kinase kinase kinase 6 de codage ( MAP3K6
) . Sur la base de la conservation, prédit pathogénicité et un rôle connu du gène dans la prédisposition au cancer, MAP3K6
a été considéré comme un candidat fort et a été étudié plus loin. Projection d'un 115 individus non apparentés supplémentaires avec non CDH1
FGC identifié le p.P946L MAP3K6 de la variante, ainsi que quatre variantes de codage supplémentaires dans MAP3K6
(p. F849Sfs * 142, p.P958T, et p.D200Y p.V207G). Une deuxième variante frappé somatique (de p.H506Y) était présent dans l'ADN obtenu à partir de l'un des échantillons de tumeurs, et la preuve de l'ADN hyperméthylation dans le gène MAP3K6 de a été observée dans l'ADN de la tumeur d'une autre personne touchée. Ces résultats, ainsi que des preuves antérieures de modèles de souris qui MAP3K6
agit comme un suppresseur de tumeur, et des études montrant la présence de mutations somatiques dans MAP3K6
dans les cancers gastriques non héréditaires et cellule de cancer gastrique lignes, pointe vers MAP3K6
variantes comme un facteur prédisposant pour FGC.

Auteur Résumé

Les mutations génétiques sous-jacents impliqués dans 60% des cas de cancer gastrique hérités restent inconnus. Nous présentons ici un grand pedigree étendu avec le cancer gastrique familial et une association dans une partie de la famille avec une mutation dans MAP3K6
. La conservation, prédit pathogénicité de la variante, la distribution tissulaire, et la fonction connue de MAP3K6
fait ce un candidat solide qui justifiait une enquête plus approfondie. Examen d'un 115 proposants indépendants supplémentaires identifié des mutations supplémentaires dans MAP3K6
, y compris une mutation tronquant

Citation:. Gaston D, Hansford S, Oliveira C, Nightingale M, H Pinheiro, Macgillivray C, et al. (2014) germinale Mutations dans MAP3K6
sont associés à cancer gastrique familial. PLoS Genet 10 (10): e1004669. doi: 10.1371 /journal.pgen.1004669

Editeur: Marshall S. Horwitz, Université de Washington, États-Unis d'Amérique

Reçu 3 Mars 2014; Accepté le 14 Août 2014; Publié le 23 Octobre, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Gaston et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce qui suit les agences ont fourni des fonds pour ce projet: Génome Canada, Génome Atlantique, Fondation Nova Scotia Health Research, en Nouvelle-Écosse pour la recherche et l'innovation Trust, Dalhousie Faculté de médecine, Dalhousie Département d'ophtalmologie, Santé Canada, le Centre de recherche et développement de médicaments, Capital District Health Autorité, IWK Health Centre Foundation, Fonds de recherche en santé de la capitale, et Le COMPETE /FEDER Fondation pour la science et la technologie (FCT), Projets Ref. FCT PTDC /SAU-GMG /110785/2009 et Post-doc subvention SFRH /BPD /79499/2011 à HP "financiados pas ambito ne Programa Operacional Temático Factores de Competitividade (COMPETE) e comparticipado pelo fundo Comunitário Europeu FEDER." MES est pris en charge par le CHU Ste-Justine Centre de Recherche. Les auteurs tiennent à souligner la contribution de: la plate-forme de séquençage du génome du Québec à haut débit; et Sónia Sousa et José Carlos Machado de l'Unité IPATIMUP Diagnostics, Porto, Portugal. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est la deuxième cause de décès liés au cancer dans le monde entier avec 738.000 décès par an [1]. Le traitement primaire consiste en une résection chirurgicale de la tumeur et peut être suivie d'une chimiothérapie et /ou radiothérapie. Les taux de survie à 5 ans après résection chirurgicale sont élevés si la maladie est détectée tôt (71% pour le stade 1A), cependant, ils tombent rapidement lorsque le diagnostic est fait à des stades ultérieurs (46% stade IIA, 20% de stade IIIA, 4% au stade IV) (la base de données SEER de l'Institut national du cancer, Octobre 2013). Malheureusement, parce que les premiers symptômes de cancer de l'estomac ressemblent d'autres maladies, la détection ne se produit pas souvent jusqu'à des stades avancés ont déjà été atteints [2]

Classiquement, le cancer gastrique a été divisé en deux types:. Intestinal et diffus [ ,,,0],3]. La forme intestinale se produit spontanément et est le plus souvent chez les personnes âgées, alors que la forme diffuse se produit souvent chez les sujets jeunes et peut être associée à des antécédents familiaux de cancer gastrique. Les populations ayant une prévalence plus élevée de infection
Helicobacter pylori chronique ont tendance à avoir des charges plus élevées de cancer gastrique [4]. La majorité des cancers gastriques (90%) sont sporadiques, mais environ 10% présentent le regroupement familial [5]. Seulement 1% à 3% sont causés par un syndrome héréditaire, par opposition à des facteurs environnementaux tels que les pratiques alimentaires partagées [5]. La forme familiale le mieux établi du cancer gastrique est un cancer gastrique héréditaire diffus (HDGC [MIM ​​137215]), où environ 40% des cas sont attribués à des mutations germinales dans le gène codant pour E-cadhérine, CDH1
[6 ] - [9].

Nous avons constaté une grande famille de Maritime Canada avec une histoire de cancer gastrique familial (FGC) affichant un mode autosomique dominant apparent de l'héritage, mais ne portant aucune des variantes dans la région codante du gène CDH1 de. Alors que la famille affiche de nombreuses caractéristiques typiques de HDGC, il y avait la diversité dans la présentation clinique au sein de la famille ainsi que d'un âge avancé de début, donc nous avons choisi de faire simplement référence à la condition que FGC sur HDGC plus rigoureusement définie. cartographie génomique des régions héritées partagées entre les membres de la famille touchés, suivis par séquençage exome, a conduit à l'identification d'une variante d'un seul nucléotide germinale (SNV) en mitogen-activated protein kinase kinase kinase 6 ( MAP3K6
, ASK2
, MAPKKK6
, MEKK6
, ENSG00000142733), un gène codant pour un membre de la famille de la protéine kinase sérine /thréonine. Plusieurs in silico
méthodes prédit la SNV dans MAP3K6 être dommageable pour la protéine, et les études précédentes avec MAP3K6
souris déficientes [10], ainsi que l'apparition de mutations dans ce gène dans les tumeurs cancéreuses gastriques primaires et des lignées cellulaires de cancer gastrique [11], sont compatibles avec des mutations dans le MAP3K6
gène étant la mutation causale. Le séquençage de l'ADN isolé directement à partir d'un échantillon de tumeur fixe d'un individu démontré la présence d'un de novo
deuxième hit variante dans MAP3K6
. Projection d'un 115 échantillons supplémentaires sans rapport FGC, également négatif pour les mutations
CDH1, a révélé cinq personnes avec quatre SNVs supplémentaires dans MAP3K6
qui ont également été prévu pour être pathogènes, ainsi que d'un individu sans rapport avec le SNV identifié dans la famille de Maritime Canada. L'âge de début varie entre MAP3K6
transporteurs SNV dans les cinq familles, et on n'a pas développé un cancer, même à un stade tardif de la vie, ce qui suggère une pénétrance incomplète. Ce rapport est le premier d'un cancer héréditaire résultant de SNVs dans MAP3K6
.
de

Résultats cliniques et évaluation Pathologique

Nous avons constaté un grand maritime canadien famille d'origine européenne dans le cadre de l'évaluation clinique de routine à la clinique du cancer héréditaire dans le cadre du service maritime de génétique médicale au Centre de santé IWK à Halifax, Nouvelle-Écosse, Canada (figure 1). Saliva, le sang, ou (FFPE) échantillons de paraffine fixés au formol ont été obtenus à partir de 6 membres de la famille atteints de cancer gastrique, ainsi que 27 parents non affectés, et un individu marié-in. Aucune consanguinité était soupçonné dans ce pedigree.

Le proband, touché individuel 1884, a été diagnostiqué avec un cancer gastrique métastatique et a subi une gastrectomie totale à l'âge de 51. L'examen anatomopathologique a révélé un adénocarcinome peu différencié survenant dans l'antre de l'estomac dans un fond de la métaplasie intestinale et la gastrite chronique. La tumeur était composée d'une feuille de cellules en bague à cachet (figure 2C et D). Le carcinome pénétré à travers toute l'épaisseur de la musculeuse impliquant la couche séreuse. Aucune preuve de H. pylori
a été vu.

tante maternelle de la proband, individuelle 1826, a été diagnostiqué avec cancer de l'estomac à 80 ans et a subi une gastrectomie partielle. L'examen anatomopathologique a révélé un adénocarcinome modérément à peu différencié envahissant dans la musculeuse (figure 2A). La tumeur a été constitué en majorité de nids de cohésion de cellules néoplasiques avec formation glandulaire occasionnelle. Les cellules tumorales avec des formes cellulaires de bague à chaton ont été observés dans des zones pleines (figure 2B). La muqueuse gastrique adjacente à la tumeur a montré une métaplasie intestinale focale sans preuve de H. pylori
.

A 76 une biopsie de l'estomac d'une autre tante maternelle à la proband, individuelle 1841 ans, a été signalé à avoir un adénocarcinome modérément différencié avec la formation glandulaire. H.
pylori a été identifié dans l'arrière-plan muqueuse gastrique. Une petite section de biopsie était disponible pour un nouvel examen. Bien que cet échantillon était trop petit pour une classification complète, il a montré des nids cohésifs de cellules néoplasiques avec de petits foyers de formation glandulaire en accord avec un adénocarcinome peu différencié. Il y avait des cellules tumorales dans l'échantillon montrant cytoplasme clair, mais ceux-ci ne pouvaient pas être définitivement classées comme cellules en bague chevalière.

Une biopsie de l'estomac à 82 l'âge du patient 1844, la mère de l'proband, a montré un adénocarcinome peu différencié avec chevalières anneau de fonctions. La muqueuse de fond a montré la preuve de H. pylori
et métaplasie intestinale inégale.

Patient 1845, un premier cousin une fois enlevé le propositus, a été diagnostiqué à l'âge de 59 ans avec un carcinome indifférencié sans caractéristiques d'anneau sigillaire. La tumeur a été associée à une dense lymphoïde infiltrat et a été mieux classé que le carcinome lympho. H. pylori
n'a pas été vu dans la muqueuse normale adjacente. La tumeur était positive pour deux variantes introniques dans CDH1
qui sont tous deux devraient être bénignes (NM_004360.3: c.688-83G > A et c.2439 + 52G > A)
<. p> Patient 2447, un troisième cousin, a été diagnostiquée à 44 ans avec un adénocarcinome peu différencié sans caractéristiques de cellules annulaires chevalière. La muqueuse gastrique adjacente a montré une vaste métaplasie intestinale. Il n'y avait aucune preuve de H. pylori
.

Après la projection d'un panel de 115 proposants avec CDH1
cancer gastrique familial non, une autre famille du Portugal a été ajouté à notre étude (figure 3A). Individuel II-6 a été diagnostiqué avec un cancer gastrique à 62 ans, ayant un adénocarcinome peu différencié de l'estomac et la présence de cellules en bague chevalière. l'analyse immunohistochimique a montré une coloration membraneuse positive de E-cadhérine dans les cellules néoplasiques (figure 3C), y compris les cellules bague chevalière (figure 3B). Les personnes liées I-4, II-1 et II-7 ont été diagnostiqués avec un cancer gastrique (détails histologiques inconnus) à 53 ans, 62 et 52 respectivement. Les quatre individus dans le pedigree portugais sont morts de la maladie dans les 5 ans suivant le diagnostic de cette famille. Dans la famille canadienne Maritime, 1884, 1844 et 1841 sont morts de la maladie dans l'année du diagnostic.

Le cancer gastrique décrit pour les patients 1845 et 2447 avait pas chevalières observé et a été diagnostiqué à un âge moyen plus tôt ( 52 contre 72, bien que le proband a été diagnostiquée à 51 ans). Sur la base des différences dans l'histologie, en particulier le manque de cellules annulaires chevalières en 1845 et 2447 par rapport aux autres personnes concernées, il est possible que la maladie dans ces deux individus représente une condition distincte. Alternativement, il est possible que la famille affiche un motif phénotypique plus complexe étant entraîné par deux (ou plusieurs) gènes.

Cartographie moléculaire et l'exclusion des gènes connus et candidats

Bien que 30-40% des cas de HDGC sont attribuables à des mutations dans CDH1
, aucune mutation dans les exons codant pour des protéines de CDH1
ont été trouvés chez les individus atteints de la famille canadienne Maritime. Pour identifier les loci pathogènes dans cette famille, haute densité SNP-génotypage en utilisant des réseaux Illumina a été réalisée sur cinq personnes concernées: la mère de l'proband (1844), deux tantes maternelles touchées (1826 et 1841), et deux cousins ​​éloignés (1845 et 2447) ainsi que plusieurs individus apparentés sans incidence rapportée d'un cancer dont le statut d'affection a été traitée comme inconnu (1907, 1924, 1821, et 1822). Pour tous les individus, à l'exception de 1845 données de génotypage était disponible à 2,5 millions de marqueurs. Individuel 1845 avaient déjà été génotypés à une densité de 660K, et n'a pas pu être ré-génotypés à la densité plus élevée. Aucun ADN génotypage des SNP a été obtenu à partir de l'échantillon de FFPE du proband (1884). L'utilisation de ces données, nous avons procédé à la fois non-paramétrique et analyse de liaison paramétrique utilisant Merlin [12]. Compte tenu de la fin de l'âge d'apparition dans de nombreux membres de la famille touchés, la pénétrance dans le pedigree Maritime est inconnue. Afin d'être conservateur dans l'identification des régions génomiques d'intérêt, deux modèles dominants de pénétrance (50% et 99% pénétrance) en utilisant les personnes touchées 1826, 1841, 1844 et 2447 (et les individus de 1907, 1924, 1821 et 1822 avec le statut d'affection inconnue ) ont été utilisées. des régions génomiques identifiées dans l'analyse de liaison paramétrique ont été généralement cohérents entre eux quel que soit le paramètre choisi pénétrance (tableau 1). L'analyse a été répétée avec individuelle 2447 traitée comme inconnu pour analyser tout le pedigree réduit où 2447 et 1845 ont été traités comme phénocopies potentiels (tableau 2). Cela a entraîné la baisse des scores de LOD globale pour toutes les régions identifiées, ainsi que de plus en plus grandes régions en moyenne, englobant une plus grande partie du génome.

Nous avons également effectué liaison non-paramétrique (NPL), une méthode avec moins d'hypothèses sous-jacentes sur le modèle d'héritage sous-jacent, à l'aide de personnes touchées 1826, 1841, 1844 et 2447 (pedigree-large) ou avec la suppression de 2447 comme un phénocopies potentiel en les spécifiant d'être de statut inconnu (sous-pedigree). intervalles génomiques Pedigree à l'échelle étaient pour la plupart compatibles avec ceux identifiés en utilisant les deux modèles paramétriques (tableau 3). Exclusion de 2447 a donné lieu à un score inférieur global maximum (1.204), qui a été trouvé sur plusieurs intervalles à travers le génome (tableau 3).

intervalles génomiques identifiés de cette manière ont été utilisés pour filtrer les données de séquençage de l'exome pour identifier les mutations pathogènes potentiels. Pour être large dans l'identification des mutations causales possibles, à la fois dans le cas de pedigree large et sous-pédigrée les intervalles de la paramétrique respective et des analyses non paramétriques ont été combinées. Pour le pedigree large analyse ce fut l'union des intervalles décrits dans le tableau 1, ainsi que les intervalles appropriés dans le tableau 3 (y compris 2447) et pour l'analyse de sous-pédigrée l'union des intervalles trouvés dans le tableau 2 avec des intervalles appropriés dans le tableau 3 ( excluant 2447).

Whole exome séquençage

Nous avons ensuite effectué le séquençage exome sur deux des tantes maternelles affectées à la proband (1826 et 1841) et la troisième cousine touchée (2447). Nous les avons priorisées et filtrées variantes en fonction de leur fréquence parmi les populations européennes descente (< 2% et un filtre plus strict à < 1%) à partir de 1000 jeux de données Génomes et Exome projet de séquençage ainsi que d'autres exomes séquencés dans le même fournisseur de séquençage, localisation dans une région génomique d'intérêt, et la conséquence fonctionnelle de la mutation (modification de la séquence ou un site d'épissage d'au moins une protéine codant pour la transcription codant pour la protéine). Des variantes d'intérêt ont ensuite été séquencés par séquençage Sanger dans d'autres personnes concernées. filtration Variant en fonction des intervalles génomiques a été effectuée séparément pour chaque hypothèse (l'ensemble du pedigree et réduit pedigree) (tableaux S1 et S2). En plus de l'identification et la filtration des variants génétiques, nous avons évalué la profondeur de la couverture des exons (définies par l'ensemble de consensus CDS) à l'intérieur des régions génomiques d'intérêt et à travers les résultats individuels de séquençage de l'exome séquençage. En outre, nous avons cherché des variantes potentiellement partagées qui ont été «masqués» par des problèmes de couverture. Pour toutes les variantes observées dans une ou plusieurs exomes, si aucune variante n'a été observée dans le exome (s) restant, nous avons évalué si cela était dû à une faible couverture ou de couverture lacunes dans l'exon. Pour les variantes où cela était vrai, nous filtré en utilisant des critères standards (comme ci-dessus). L'utilisation de ces critères de filtrage, plusieurs variantes à faible MAF et potentiellement avoir un effet au niveau codant pour la protéine ont été observées dans les régions génomiques pedigree à l'échelle d'intérêt qui avaient été identifiés par analyse de liaison paramétrique; cependant, aucun n'a été présent dans toutes les personnes touchées. En outre aucune variante "masqués" candidats ont été identifiés par les mêmes critères.

Nous avons envisagé la possibilité que les individus 1845 et 2447 ont une condition clinique distincte, et a examiné les variantes communes parmi les proband et sa famille immédiate. En utilisant les mêmes critères de filtrage comme ci-dessus, mais en utilisant seulement les exomes des particuliers 1826 et 1841, un total de 127 variantes ont été identifiées. filtrage strict pour les variants rares (MAF < 1%) a réduit ce nombre à 85 (Tableau S2). Un sous-ensemble de ces variantes, sur la base d'une combinaison de facteurs (mutations dans COSMIC [13], a prédit effet de la mutation, la conservation de l'acide aminé codé, revue de la littérature, les modes d'expression connus dans les tissus et les tumeurs normales, les phénotypes de maladie associé à la gène) ont été séquencés pour le suivi dans le propositus et leur mère. Une variante dans MAP3K6
(CHR1, NM_004672) était d'un intérêt particulier. Une mutation identifiée dans MAP3K6
(. C [2837C > T]; [=], p.P946L) a été considéré comme un candidat solide basé sur les associations connues d'autres MAP kinases avec le cancer, et plusieurs publications élucidant une rôle MAP3K6 dans la tumorigenèse [10], [11], [14], [15]. Cette variante a été rapporté précédemment (rs141787524) avec une fréquence mineure de l'allèle de 0,7% dans le projet 1000 Genomes (groupe de descendance européenne) et une fréquence de 0,4% dans la population européenne-américaine (Exome Variant Server (NHLBI GO Projet Exome Sequencing ( ESP):. http://evs.gs.washington.edu/EVS [Consulté Octobre, 2013]) Il a été considéré comme une variante hétérozygote 11 (de 1532) d'autres exomes séquencées au Centre d'innovation Génome Québec, ce qui correspond à un MAF de 0,36%.

Cette SNV était présente dans quatre personnes touchées dans la famille Maritime (1884, 1826, 1844, 1841), dont trois ont clairement montré la présence de cellules en bague chevalière. Seule une petite biopsie de poinçon était disponible pour la tante maternelle, 1841, donc nous ne sommes pas en mesure de confirmer définitivement la présence ou l'absence de cellules en bague chevalière. le MAP3K6
SNV était également présent dans cinq des 27 parents actuellement indemnes échantillonnées, et il n'a pas été présent dans le marié en relatif. l'un des transporteurs a été homozygotes pour la SNV et était âgé de plus de 80 ans sans cancer rapporté. Bien qu'aucune consanguinité a été signalé dans la famille, et aucune preuve de la variation du nombre de copies a été observée dans les données de génotype SNP, cet individu était également homozygote pour une région de 10 Mb englobant le locus. Les transporteurs restants étaient âgés de 33 à 51, et que l'âge d'apparition du cancer a été généralement plus tard, leur statut a été considéré comme «inconnu». Les deux individus, 1845 et 2447, avec le cancer gastrique phénotypiquement distinctes ont été négatifs pour le MAP3K6
SNV.

somatique variantes dans la tumeur

Nous avons ensuite utilisé l'ADN isolé à partir une section tumoraux de l'échantillon FFPE des personnes touchées MAP3K6
SNV support 1884 (le proband) pour dépister les SNVs somatiques supplémentaires ou la perte d'hétérozygotie (LOH) au sein de la tumeur elle-même. En plus de la variante de p.P946L, nous avons identifié un roman SNV dans le gène MAP3K6 de à la position c [1516C > T]. Conduisant à une p.H506Y de changement d'acide aminé (tableau 4), et ont pu pour en déduire que la SNV a été somatique acquise sur la base de données de séquence du conjoint et des enfants.

Vérification dans les affaires FGC Unrelated

Nous avons examiné des échantillons d'ADN provenant de 115 individus un FGC indépendants supplémentaires à l'aide d'un multiplexé ciblé prochain essai de séquençage de nouvelle génération. Les échantillons provenaient de familles non apparentées qui répondaient aux critères internationaux gastrique consortium de liaison du cancer (IGCLC) pour héréditaire diffuse le cancer gastrique (106), mais avaient déjà testé négatif pour la mutation du CDH1
locus, ou cancer gastrique intestinal familial. Dans cette cohorte, nous avons identifié cinq SNVs hétérozygotes supplémentaires dans le MAP3K6
gène (tableau 4): a. Tronquant SNV (. C [2544delC], p.F849Sfs * 142), trois SNVs faux-sens (c [2872C > A], p.P958T;. c [598G > T], p.D200Y; et c [620T >. G], p.V207G), et une autre personne avec le p.P946L (c [2837C >. T] ) variante, précédemment trouvé dans la famille Maritime (figure 4). Des mutations dans MAP3K6
ont été découverts dans les personnes répondant aux critères d'un cancer gastrique diffus (106). L'individu dans ce roman cohorte de patients portant la variante de p.P946L est considéré comme sans rapport avec la famille Maritime.

La SNV tronquant a été observée chez un individu portugais avec des antécédents familiaux de cancer de l'estomac (figure 3A). Bien que ce SNV a un identificateur de dbSNP (de rs34008139), aucune fréquence de la population a été associée à partir soit 1000 Genomes ou des projets de serveur Exome Variant. Cette SNV a également été rapporté dans la base de données Cosmique (état somatique /germinale non spécifié) [13] dans un échantillon de cancer du gros intestin. L'examen histologique de la tumeur du proband a montré un cancer gastrique peu différencié avec des cellules de bague chevalière, conservant E-cadhérine expression de la protéine à la membrane cellulaire (figure 3B et 3C).

La variante p.D200Y a été trouvé dans proposants de deux familles non apparentées, et a été observé au sein de la cohorte des génomes 1000 (de rs41291098), mais il est aussi rare avec une fréquence de l'allèle mineur (CRG) de 0,4% dans les deux 1000 génomes et Exome Sequencing Project européens groupes de descendance. La variante de p.P958T (de rs75893867) n'a pas MAF rapporté soit 1000 Genomes ou Exome séquençage des ensembles de données de descente du projet européen, et n'a été identifié dans les 1000 Genomes parmi la cohorte japonaise à une fréquence de 2,2%. Cependant, il a été identifié dans Cosmique (COSM99077) comme une mutation somatique à partir d'un patient atteint de cancer de l'estomac. La variante de p.V207G a été identifiée dans le projet de séquençage Exome dataset European-American avec un CRG de 0,01%. Il n'a pas été identifié parmi les groupes européens ou européens descente dans les 1000 Genomes, mais a été observée dans d'autres groupes de population à une gamme de fréquences des allèles mineurs.

Avec MAP3K6
, 50 gènes supplémentaires auparavant suggéré d'être impliqués dans le risque de maladie du tractus gastro-intestinal supérieur ont été séquencés pour cette cohorte à l'aide d'un test à base de panneau personnalisé (manuscrit soumis). Les gènes de l'écran à base de MiSeq personnalisés ont été choisis en fonction de revue de la littérature, ainsi que des gènes d'intérêt dans des projets collaboratifs. Dans les cas où MAP3K6
variantes de faux-sens ont été identifiés, pas d'autres variantes de candidats ont été trouvés.

Second-Hit analyse dans la tumeur de

le tissu FFPE de tumeur du portugais famille était disponible pour le proband de la famille portugaise portant les p.F849Sfs * 142 germinale tronquant mutation. Les mutations somatiques ont été exclus dans les limites complètes de codage de séquence et intron-exon de MAP3K6
dans la tumeur du proband. Manque de LOH au MAP3K6
gène pourrait également être déduite dans cette tumeur, à la fois de type sauvage et des allèles mutants ont pu être identifiés sur le site germinale de mutation (complémentaire Figure S2). Nous avons donc cherché des mécanismes d'inactivation alternatives putatifs. Hyperméthylation des îlots CpG dans les promoteurs des gènes et des régions régulatrices est un phénomène commun conduisant à l'expression génique diminué dans le cancer [16]. MAP3K6 de la réglementation par le promoteur hypermethylation a été décrit pour l'os humain cellules souches mésenchymateuses de la moelle [17], même si une corrélation hypermethylation et l'expression du gène n'a pas été établie. Nous avons cherché MAP3K6
îlots CpG [18] et a trouvé deux îlots CpG, une à la région du promoteur et un autre englobant exon 10 et une partie de l'intron en aval (Figure 5 et Figure complémentaire S1). L'île aval CpG (CpG island 2) est à proximité d'un site hypersensible à la DNase prédit au port promoteur associé caractéristiques (fonction réglementaire Ensembl ID ENSR00000533270, Figure 5). Nous l'ADN traité au bisulfite de: lymphocytes du sang périphérique du PROBAND (PBL); la tumeur du propositus; quatre échantillons différents normaux de contrôle de l'estomac, et; gastriques sept lignées de cellules cancéreuses. Pour l'îlot CpG du promoteur (CpG island 1), aucune hyperméthylation a été détectée en utilisant deux jeux d'amorces différentes (figure 5 et Suppl. Figure S1). En ce qui concerne CpG île 2, nous avons observé la méthylation complète de l'ADN tumoral et aucune méthylation de l'ADN PBL. Chose intéressante, l'analyse de méthylation au niveau îlot CpG 2 dans la muqueuse gastrique normale à partir de contrôle affiché un schéma de méthylation partielle. En ligne avec le résultat obtenu pour l'ADN de la tumeur, les sept lignées cellulaires de cancer gastrique affichées en plein méthylation (Figure 5 et Suppl. Figure S1).

pathogénicité de SNVs dans MAP3K6

Nous avons appliqué une variété de in silico
méthodes pour prédire la pathogénicité des SNVs missense observées. Bien qu'il n'y ait pas de consensus complet dans tous les programmes (tableau 5), tous les SNVs étaient considérés comme nuisibles par au moins un programme, et à l'exception p.V207G et p.P958T, les quatre autres variantes décrites dans ce rapport ont été prédit être délétère par au moins 3 des 7 méthodes. En outre, le Evod [19] prédiction de consensus (basé sur une combinaison équilibrée de l'Evod, PolyPhen2 [20], et SIFT [21] scores) a indiqué que trois des variantes (p.D200Y, p.V207G, p.H506Y ) étaient nuisibles ou susceptibles d'être délétères. Les deux autres variantes, p.P946L et p.P958T, ont été prédites à probablement des changements neutres bien qu'ils aient été évolutionnaire ultra-conservés et bien conservée (selon Evod classification des taux d'évolution), respectivement; tandis que seulement une des trois autres variantes (p.D200Y) a été considérée comme bien conservée, et les deux autres sont moins conservées. Comme (i) MAP3K6
tronquant variante a été trouvée, (ii) il y avait un deuxième touché variante identifiée dans la personne pour laquelle le tissu FFPE a été examiné, et (iii) tous les programmes testés sont conçus pour prédire la pathogénicité basée sur la perte de la fonction, il est probable que les variantes décrites conduisent à une diminution de la fonction ou d'un phénotype négatif dominant.

Discussion

nous présentons ici la première preuve que les mutations germinales MAP3K6
sont liés au cancer héréditaire. Quatre individus avec un cancer de l'estomac d'une famille canadienne Maritime ont été trouvés pour réaliser une variante hétérozygote dans le gène MAP3K6
, conduisant à un changement p.P946L d'acides aminés. Cette variante de la lignée germinale, situé sur le chromosome 1, a été identifiée dans deux des trois échantillons de Exome et était situé dans une région identifiée par analyse paramétrique et non-paramétrique de liaison au sein de la sous-pedigree (1845 et 2447 traités comme état de la maladie "inconnue") . L'importance de la MAP3K6 de la variante a été soutenue par l'identification d'un deuxième touché mutation somatique dans le MAP3K6
gène à p.H506Y présent dans l'ADN isolé directement à partir d'une section tumoraux d'un patient échantillon FFPE. Deux individus du pedigree avec cancer de l'estomac, mais avec quelques différences phénotypiques n'a pas effectué la mutation; cependant, aucune des variantes de candidats ont été identifiés partagés entre toutes les personnes touchées au sein de toute région identifiée, par liaison paramétrique menées pedigree entier.

Dépistage des familles FGC supplémentaires ont révélé cinq autres MAP3K6
mutations, y compris un mutation p.F849Sfs * 142 germinale observé dans le proband portugais, qui devrait conduire à une protéine troncature. Après exclusion des mutations somatiques et LOH, un mécanisme potentiel de deuxième coup a été trouvé via
hypermethylation sur une île intragenic CpG à proximité d'un élément régulateur promoteur associé prédit (DNAse I site hypersensible). La pertinence de la méthylation à ce la région du gène de MAP3K6 n'a pas pu être déterminée en termes d'impact sur l'expression des gènes, néanmoins la possibilité d'agir comme un possible deuxième frappé inactivation mécanisme (partielle ou totale) est élevée, en raison de les résultats obtenus dans les lignes de l'estomac et de cellules cancéreuses normales. Si oui, cela pourrait bien représenter un autre exemple du concept de plus en plus reconnu que méthylation de l'ADN dans le corps du gène est pas seulement un témoin passif de la transcription génique, mais est activement impliquée dans plusieurs processus de régulation des gènes [22], ce qui justifie une enquête plus approfondie. analyse histopathologique de l'individu de la famille portugaise portant cette mutation tronquant sélectionnée cellules chevalière dans le cadre du phénotype tumoral, ainsi que la plupart des individus de la sous-pedigree Maritime (sauf 1841, où le statut de chevalière n'a pas été concluante en raison du manque de matériel suffisant).

Bien que MAP3K6 de les mutations ont pas déjà été identifiés dans le cancer héréditaire, il y a un nombre croissant de preuves que MAP3K6
a un rôle important dans la pathogenèse du cancer . Chez la souris, où MAP3K6
est normalement exprimé dans le tissu gastrique et de la peau, la perte de MAP3K6
chez les souris knock-out homozygotes a été trouvé pour augmenter la susceptibilité au cancer de la peau induite [10]. Les souris ne développent un cancer spontanément; Cependant, une induction chimique effectuée en présence d'un stimulus inflammatoire a conduit à un plus grand nombre de tumeurs de la peau dans l'élément MAP3K6
souris déficientes que chez les animaux témoins. Le nombre de tumeurs dans hétérozygote ( MAP3K6
^{+/-) des souris, ainsi que leur taille, était intermédiaire entre le type sauvage et des souris knock-out, ce qui suggère un rôle pour MAP3K6
dosage dans ses effets [10].}

• PLOS ONE: comparatif Proteomics analyse des cellules souches du cancer gastrique
• PLOS ONE: Diminué Core-fucosylation Contribue à malignité dans le cancer gastrique