PLOS ONE: N-terminal Polypeptide de Annexin A2 Diminue Infection de Mycoplasma hyorhinis aux cellules de cancer gastrique

Résumé

infection à mycoplasmes chez les humains et sa contamination dans les cultures cellulaires sont des problèmes dans le monde entier. Les médicaments actuellement disponibles pour prévenir ou traiter une infection à mycoplasme souffrent d'une faible sensibilité, une forte résistance et une forte toxicité. Nos travaux antérieurs ont montré que Mycoplasma hyorhinis
( M
. hyorhinis
) l'infection a été médiée par l'interaction entre p37 de M
. hyorhinis
et Annexin A2 (ANXA2) des cellules hôtes, mais la valeur de translation de ce mécanisme était inconnu. Ici, nous avons synthétisé la N-terminale du polypeptide ANXA2 (A2PP) et constaté que A2PP pourrait diminuer l'infection de M
. hyorhinis
aux cellules de cancer gastrique et le bloc M
. hyorhinis
migration cellulaire induite par l'infection. De plus, nous avons constaté que A2PP pourrait réduire M
. hyorhinis
contamination des cellules de passage. En outre, par rapport aux antibiotiques commerciaux couramment utilisés dans la culture cellulaire pour empêcher M
. infection hyorhinis
, A2PP a démontré une plus grande efficacité, mais une faible toxicité sur la croissance cellulaire. Ainsi, notre étude pour la première fois révélé le potentiel de A2PP pour le traitement et la prévention de la M
. hyorhinis
infection

Citation:. Yuan S, Qu L, Shou C (2016) N-terminal Polypeptide de Annexin A2 Diminue Infection de Mycoplasma hyorhinis
à des cellules de cancer gastrique . PLoS ONE 11 (1): e0147776. doi: 10.1371 /journal.pone.0147776

Editeur: Gernot Zissel, Universitätsklinikum Freiburg, ALLEMAGNE

Reçu le 16 Octobre 2015; Accepté 7 Janvier 2016; Publié le 26 Janvier, 2016

Droit d'auteur: © 2016 Yuan et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données:. Tous pertinents les données sont dans le papier. les données de biopuces a été déposé dans NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (adhésion no.GSE73777)

Financement:. Financé par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81572532). http://www.nsfc.gov.cn/publish/portal1/. SCC a reçu le financement. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

mycoplasmes pathogènes, y compris Mycoplasma pneumoniae ( M
. pneumoniae
), mycoplasmes hyorhinis ( M
. hyorhinis
), par voie orale mycoplasmes ( M
.
orale) et Mycoplasma genitalium ( M
. genitalium
), appartiennent à mollicutes de classe, ce qui est le plus petit salon des micro-organismes dans la nature et peut reproduire de façon indépendante [1-2]. De nombreuses études ont montré que l'infection par ces mycoplasmes a été associée au développement de la tumeur [3-8]. M
.
provoque orale anomalie chromosomique dans les cellules diploïdes humaines et induit la transformation cellulaire [6]. L'infection par le M
. hyorhinis
ou M
. genitalium
pourrait augmenter la migration et l'invasivité des cellules épithéliales prostatiques [3]. M
. hyorhinis
infection a été liée à l'arthrite, serositis, l'infertilité et le cancer de l'homme [9-12].

En outre, la contamination par des mycoplasmes en culture cellulaire est un problème grave et le taux de cellules de passage infectées par des mycoplasmes est élevé. La culture cellulaire est largement utilisé dans les sciences de la vie, comme dans la recherche fondamentale, la recherche clinique, le développement et la production de produits biologiques, ainsi que dans le domaine de la production biopharmaceutique et de vaccins. Pour empêcher les cellules de la contamination microbienne est essentielle pour assurer la qualité de la recherche. La contamination par les mycoplasmes est le problème le plus fréquent dans la culture cellulaire avec une incidence de 30% à 60% [1]. Il a été montré que quatre espèces de mycoplasmes représentent plus de 95% de l'infection dans la culture cellulaire, y compris M
.
orale, mycoplasmes arginine ( M
. arginini
), M
. hyorhinis
et Levin pas Acholeplasma ( A
. laidlawii
) [13,14,15,16]. En raison de la petite taille, les mycoplasmes est à peine à être trouvé sous le microscope optique et est facilement ignorée par les chercheurs. Au cours des dernières années, de nombreux antibiotiques utilisés pour le traitement des mycoplasmes a entraîné à plusieurs reprises dans l'émergence de la résistance des mycoplasmes. Pour ces raisons, il est impératif de développer de nouveaux agents pour la prévention ou la diminution de l'infection à mycoplasme.

Nos travaux antérieurs ont montré que M
. infection hyorhinis
dépend de l'interaction de p37 (protéine majeure de la membrane de M
. hyorhinis
) et ANXA2 hôte par l'intermédiaire de leurs domaines N-terminal. Nous avons également trouvé un anticorps polyclonaux à p37 pourrait bloquer l'infection de M
. hyorhinis
et diminution M
. hyorhinis
-promoted migration des cellules de cancer gastrique [17]. Sur la base de ces découvertes, nous avons recueilli une hypothèse selon laquelle le peptide synthétisé conformément à la séquence d'acides aminés de la ANXA2 région N-terminale (à partir de 1 ^{er au 30 e aa, ici nous avons nommé ce peptide A2PP), pourrait bloquer M
. hyorhinis
infection via sa compétition avec ANXA2 et peut-être utilisé comme un médicament pour prévenir M
. hyorhinis
infection en culture cellulaire. Dans cette étude, nous avons testé cette hypothèse et également comparé les effets de A2PP avec d'autres médicaments dans la prévention de M
. hyorhinis
infection.}

Matériel et méthodes

AGS gastrique lignée cellulaire de cancer de la culture cellulaire a été de l'American Type Culture Collection (ATCC). BGC823 lignée cellulaire de cancer gastrique a été établi par l'hôpital populaire de l'Université de Pékin et a été acheté auprès de Cell Culture Center de l'Académie chinoise des sciences médicales (Beijing, Chine). AGS et BGC823 cellules ont été cultivées dans du RPMI-1640 complété 10% de sérum de veau foetal obtenu à partir de Invitrogen (Carlssbab, CA, USA). test de Mycoplasma a été mis en œuvre avant chaque nouvelle expérience par amplification par PCR M
. hyorhinis p37
.

Mycoplasma Propagation et co-culture

propagation de Mycoplasma et co-culture a été réalisée comme indiqué précédemment [17,18,19].

Les anticorps et les réactifs

anticorps monoclonal anti-p37 PD4 a été généré et caractérisé précédemment [5,20,21]. anticorps anti-p37 polyclonaux a été obtenu à partir de immunisant lapin avec GST-p37 protéine de fusion suivant le protocole standard. Anti-EGFR et anti-phospho-EGFR a été acheté auprès de Cell Signaling Technology (CST, États-Unis). Anti-ANXA2 était de Novus biotechnologie (Novus biotechnologie, États-Unis). Anti-phospho-ANXA2 était de Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA). A2PP (1 ^{er au 30 e aa) et divers peptides A2PP tronqués, y compris A2PP-Nd4 (5 e à 30 e aa), A2PP-ND8 (9 e à 30 e aa), A2PP-ND12 (13 e à 30 e aa), A2PP-ND16 (17 e à 30 e aa), A2PP-Cd4 (1 er au 26 e aa), A2PP-CD8 (1 er au 22 e aa), A2PP-Cd12 (1 er à 18 e aa), A2PP- CD16 (1 er à 14 e aa), conjointement avec des peptides témoins aléatoires (CONP) ont été synthétisés par Sbsbio (Beijing, Chine). Antimicrobiens mycoplasmes I (MYCO I) et mycoplasmes II (MYCO II) ont été achetés chez M & C GENE TECHNOLOGY (Beijing, Chine). Ciprofloxacine (CIP) a été de Double-Crane Pharm (Beijing, Chine).}

Détection de M
. hyorhinis
par PCR quantitative (qPCR)

ADN a été extrait de AGS ou BGC823 cellules après M
. hyorhinis
une infection par un tampon d'ADN de lyse (50 mM de Tris pH 8,5, 1 mM d'EDTA, 0,5% de Tween-20 et 200 mg /l de protéinase K) selon le protocole standard. qPCR a été réalisée avec 30 ng d'ADN et SYBR Green PCR en temps réel 2 x kit de prémélange (Takara, Otsu, Japon) en utilisant un système à partir de l'étape ABI (Foster City, CA, USA). Les programmes de réaction et p37
amorces spécifique de (avant: 5'-TATCTCATTGACCTTGACTAAC-3 'inverse: 5'-ATTTTCGCCAATAGCATTTG-3') ont été signalés précédemment [22]. Pour comparer M
. hyorhinis
niveaux d'ADN dans des cellules, GAPDH
(forward: 5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 ', inverse: 5'-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3') a été amplifié en tant que témoin et les données ont été analysées à l'aide le ^{-ΔΔCt méthode 2. Les amorces ont été synthétisés par Sangon (Shanghai, Chine).}

Western blot

Les cellules ont été récoltées à partir de la boîte de culture avec 2 x tampon de chargement SDS. gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et Western blot ont été réalisées comme décrit précédemment [23].

Cellule ELISA

96 puits ont été ensemencées avec des cellules (1 x 10 ^{4 /bien), suivie d'un traitement de peptides indiqués et infection de M
. hyorhinis
pendant 24 heures. Les cellules ont été immobilisés avec 0,05% de glutaraldéhyde pendant 10 min, puis basé sur les cellules ELISA a été effectué comme décrit précédemment [24].}

Solid-Phase Test de liaison et Pull-Down Assay

recombinant GST-p37 et protéines GST ont été produites et purifiées comme décrit précédemment [17]. GST-p37 et de la GST ont été dilués dans un tampon (0,1 M Na _{2CO 3, NaHCO 0,1M 3, pH 9,6) et enrobé dans des plaques 96 puits à 4 ° C pendant une nuit. Les plaques ont été lavées par du PBS trois fois et bloqués par 5% de lait écrémé /PBS à température ambiante (TA) pendant 2 heures. Après un lavage avec du PBS, ont indiqué des concentrations de biotine conjuguée à A2PP (synthétisé par Sbsbio) ont été ajoutés et mis en incubation à température ambiante pendant 2 h. Après lavage avec PBST 3 fois, conjuguée à la streptavidine HRP (Baltimore Pike, West Grove, PA, USA) a été ajouté et incubé à température ambiante pendant 30 min. Après le développement de couleur avec Ortho-phénylènediamine (Sigma), la densité optique à 490 nm (DO490) a été enregistré avec un lecteur de microplaques (Bio-rad 550). Pour l'essai de pull-down, 100 ng GST-p37 ou GST protéine a été co-incubés avec 20 pM biotine-A2PP et streptavidine perles (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA) dans un tampon de liaison (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, 150 mM de NaCl, 0,5% de NP-40, DTT 0,5 mM, PMSF 1 mM, et 1 x inhibiteurs de la protéase complète) à 4 ° C pendant une nuit. Les précipités ont été lavés avec du tampon de liaison pour quatre fois et analysées par Western blot.}

Co-immunoprécipitation

M
. hyorhinis
cellules infectées (BGC823 ou AGS) ont été homogénéisés dans un tampon de lyse (50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 0,5 mM de DTT, 1 mM de PMSF et 1 × les inhibiteurs de la protéase complète) à 4 ° C pendant 10 min. Après 12, 000 g de centrifugation pendant 10 min à 4 ° C, les surnageants ont été récupérés. Des lysats de protéines (500 ug) incubées avec 20 uM ou A2PP coNP, 1 ng de billes anti ANXA2 ainsi que la protéine G sépharose (GE Healthcare) à 4 ° C pendant une nuit. IgG pré-immune (1 pg) a été utilisé comme témoin. des perles précipitées ont été lavées avec du tampon de lyse pendant quatre fois, on élue dans 2 x tampon de charge, bouillies et analysées par Western Blot.

immunofluorescence

Les cellules ont été ensemencées sur des lamelles couvre-objet et cultivées pendant une nuit. Le lendemain, les cellules ont été traitées avec les peptides indiqués et infectés par M
. hyorhinis
pendant 24 heures. Ensuite, les cellules ont été lavées avec du PBS glacé pour trois fois, fixées dans du paraformaldehyde à 4% pendant 15 min à température ambiante. Après le blocage pendant 1 heure dans 5% de BSA /PBS, les cellules ont été incubées avec les anticorps indiqués à température ambiante pendant 1 h. Ensuite, les cellules ont été lavées 3 fois à nouveau avec du PBST et incubées avec des anticorps secondaires ou FITC marqué TRITC pendant 30 min à température ambiante. Après lavage avec du PBS et contre-coloration avec du DAPI, les cellules ont été montés sur 50% de glycérol /PBS. Un microscope confocal ZEISS LSM780 (ZEISS Microsystems, Oberkochen, Allemagne) a été utilisé pour observer la localisation des protéines indiquées.

chambre de migration cellulaire Assay

Transwell avec 8,0 um membranes de pores (Corning, NY, USA) a été utilisé dans la détermination de la migration cellulaire. La chambre de fond a été rempli avec 800 pi de milieu contenant 10% de FBS comme chimiotactique. Les cellules ont été remises en suspension dans un milieu sans sérum contenant M
. hyorhinis
ainsi A2PP ou coNP, puis ont été soigneusement transférés sur la chambre supérieure de chaque appareil Transwell à une densité de 2 x 10 ^{5 cellules /mL (120 pi /chambre). On a laissé les cellules migrer pendant 24 heures à 37 ° C. La surface supérieure de chaque membrane a été débarrassé des cellules avec un coton-tige. Les cellules ont pénétré sur la face inférieure de la membrane ont été fixées dans du methanol froid, colorées avec 0,1% de cristal violet et comptés dans neuf champs microscopiques choisis au hasard par puits. On a préparé chaque échantillon dans les chambres triples et chaque expérience a été répétée pendant au moins 3 fois.}

cellules cancéreuses gastriques de prolifération cellulaire Assay ont été ensemencées dans des plaques de culture de 96 puits à une densité de 5 x 10 ^{3/100 ul /puits en triple, et ont été traités avec des réactifs indiqués. La prolifération des cellules a été quantifiée par la confluence des cellules avec un imageur CloneSelect (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).}

Microarray Analyse et Real-Time RT-PCR

AGS et BGC823 cellules ( 1 × 10 ^{6 par 10 cm 2 plaque) ont été traités avec A2PP, CIP, MYCO I et II MYCO pendant 24 heures, lavées avec du PBS, et récoltées dans le réactif Trizol. Les échantillons d'ARN ont été examinés dans OE Biotechnology (Shanghai, Chine) en utilisant Affymetrix GeneChip ® PrimeView ™ humain Tableau Gene Expression. les données de biopuces a été déposé dans NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (adhésion no.GSE73777). Les données brutes a été enregistré en utilisant Affymetrix GeneChip Command Console (version 4.0, Affymetrix). Ensuite, le logiciel Genespring (version 12.5, Agilent Technologies) a été utilisé pour terminer l'analyse de base avec les données brutes. Pour commencer, les données brutes a été normalisée avec l'algorithme de retour. gènes différentiellement exprimés ont ensuite été identifiés par le changement de pliage. Le seuil fixé pour les gènes en amont et en bas réglementés était un facteur de variation ≥ 2,0. Ensuite, GO et l'analyse KEGG ont été appliqués pour sélectionner des gènes qui ont trait au cycle cellulaire et l'apoptose des cellules. En temps réel RT-PCR a été utilisée pour valider les résultats de microarray et réalisée conformément aux instructions du fabricant (SYBR, TOYOBO). niveaux de gènes apparentés d'expression ont été normalisés par GAPDH
et 2 -ΔΔCT a été utilisé pour calculer l'expression relative des gènes. Les amorces pour en temps réel RT-PCR ( ATF
, avant, 5'-GAGTGGCGACAGGATAGAGC-3 ', inverse, 5'-TTTAGCCTCCCTCCCTTAGC-3'; DDIT3
, avant, 5 ' -GCGCATGAAGGAGAAAGAAC-3 ', inverse, 5'-ACCATTCGGTCAATCAGAGC-3'; CEBPB
, avant, 5'-AGCGACGAGTACAAGATCCG-3 ', inverse, 5'-AGCTGCTCCACCTTCTTCTG-3') ont été synthétisés par Sangon <. br>}

Analyse statistique

Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± écart-type. Les différences ont été analysées par ANOVA en utilisant SPSS 11.0 logiciel et P < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Les données de biopuces a été déposé dans NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (no. GSE73777)
Microarray Numéro d'accession.

Résultats

A2PP n'a aucun effet sur la viabilité ou de la migration des cellules cancéreuses gastriques

afin d'évaluer le rôle du domaine N-terminal de ANXA2 dans M
. hyorhinis
une infection, d'une part on a synthétisé des peptides correspondant à A2PP N-terminale de ANXA2 (figure 1A). A2PP marqué à la biotine a été montré pour interagir spécifiquement avec la GST-p37 dans l'essai de liaison en phase solide (figure 1B) et le dosage pull-down (figure 1C). Nous avons remarqué que A2PP n'a pas d'incidence sur la morphologie des AGS et BGC823 cellules (Fig 1D). En outre, dans des concentrations inférieures à 20 uM, A2PP n'a pas inhibé la prolifération cellulaire (figure 1E), ce qui suggère que A2PP présente une toxicité minimale pour les cellules. EGFR a été impliquée dans la régulation de la phosphorylation ANXA2 [17,25,26], alors que A2PP n'a eu aucun effet sur les phosphorylations ou les taux de protéine d'EGFR et ANXA2 [figure 2A]. En outre, A2PP n'a eu aucun effet sur la migration des cellules AGS et BGC823 (figures 2B et 2C). Localisation cellulaire de ANXA2 est régulée par sa phosphorylation, qui est critique pour sa fonction [17,27,28]. Nous avons trouvé que A2PP n'a pas changé la localisation subcellulaire de ANXA2 endogène (figure 2D). Ces résultats indiquent que A2PP seul a aucun effet sur les phénotypes malins ou la signalisation EGFR-ANXA2 de cellules de cancer gastrique.

A2PP Diminutions M
. hyorhinis
Infection

Nos travaux antérieurs ont montré que N-terminale de médie ANXA2 M
. hyorhinis
infection [17]. Comme le montre le résultat de la cellule test ELISA, nous avons constaté que M
. hyorhinis
infection a été bloqué par A2PP d'une manière dose-dépendante dans les cellules BGC823 et AGS, mais les cellules coNP traitées étaient encore très infectés par M
. hyorhinis
(figure 3A). Ces résultats ont été soutenus par des analyses qPCR (figure 3B). Cohérente, A2PP a également diminué les taux de protéine p37 de la protéine dans l'analyse par Western Blot (figure 3C et 3D). Pendant ce temps, les niveaux de phophos-AXNA2 et phophos-EGFR dans les cellules infectées ont été régulés à la baisse par traitement avec A2PP (figure 3C et 3E), tandis que les niveaux totaux de AXNA2 et EGFR étaient relativement stables (figure 3C). Dans l'analyse d'immunofluorescence, A2PP a inhibé M
. hyorhinis
accumulation de p37 et co-localisation entre p37 et ANXA2 (figure 4A) induite par l'infection. Dans le test de co-immunoprécipitation avec des lysats de protéines de M
. cellules hyorhinis
infectés, A2PP diminué l'interaction entre p37 et ANXA2 (figure 4B). Ensemble, ces preuves ont soutenu l'idée que A2PP pourrait diminuer M
. hyorhinis
infection et confirmé notre découverte précédente que la N-terminale de ANXA2 est nécessaire pour la médiation M
. hyorhinis
infection [17].

A2PP Supprime M
. hyorhinis
Migration induite

Nos études antérieures ont suggéré que M
. hyorhinis
infection pourrait favoriser la migration des cellules de cancer gastrique [17, 23]. Dans cette étude, nous avons remarqué que M
. hyorhinis
-promoted la migration des cellules de cancer gastrique n'a pas été affectée par coNP, mais était dose-dépendante inhibée par A2PP (figure 5A et 5B). Ces résultats suggèrent que A2PP inhibée M
. hyorhinis
migration induite, qui a été associée à sa capacité à réduire phosphorylations d'infection promu de l'EGFR et ANXA2 (Fig 3C et 3E).

A2PP A Motif essentielles pour une diminution M
. hyorhinis
Infection

Pour caractériser le motif critique de A2PP, nous avons cherché à déterminer si divers peptides tronqués de A2PP (figure 6A) pourrait réduire M
. hyorhinis
infection. Dans l'analyse qPCR, A2PP et peptides tronqués A2PP-ND4, ND8, ND12, CD4, CD8 et CD12 réduits M
. hyorhinis
infection dans les cellules de cancer gastrique, mais A2PP-ND16 et A2PP-CD16 n'a pas réussi à diminuer M
. hyorhinis
infection (figure 6B). motif similaire d'inhibition a été obtenue à partir de test Western blot (Fig 6C). Ces résultats suggèrent l'existence d'un motif spécifique de A2PP est essentiel pour sa capacité à réduire les M
. hyorhinis
infection. Pour cartographier davantage les séquences de base de ce motif potentiel, nous avons synthétisé les deux peptides correspondant à 11 ^{e -20 e aa (appelé comme A2PP-10aa) et 13 e -18 e aa (appelé comme A2PP-6AA) (Fig 7A). En test qPCR, les deux peptides pourraient diminuer M
. hyorhinis
infection (Fig 7B), qui a été soutenue par un dosage Western blot (Fig 7C). En particulier, les effets inhibiteurs de A2PP-10aa étaient meilleures que celles des A2PP-6aa, mais les effets de ces deux peptides sont moins robustes que celles du A2PP (figure 7B et 7C). Thesefore, les séquences centrales (11 e -20 e) de A2PP pourrait être le motif essentiel pour inhiber M
. hyorhinis
infection.}

Comparatif de A2PP avec d'autres médicaments dans la prévention de M
. hyorhinis
Infection

M
. hyorhinis
était l'une des principales sources de la culture cellulaire [13,14,15] de pollution. La meilleure façon d'éliminer M
. infection hyorhinis
est de jeter les cellules rapidement et stériliser tous les vaisseaux contactés, mais certaines cellules infectées ne pourraient être remplacés dans plusieurs cas. Par conséquent, il est impératif d'utiliser des approches spécifiques d'antimicrobiens pour prévenir ou éliminer M
. hyorhinis
infection. Il y a eu différents agents antimicrobiens pour la prévention M
. hyorhinis
d'infecter. Par exemple, la ciprofloxacine (CIP) pourrait éradiquer M
. hyorhinis
dans une concentration appropriée [29]. Deux composants antimicrobiens nommés comme mycoplasmes I (MYCO I) et mycoplasmes II (MYCO II) pourraient réduire M
. hyorhinis
infection en bloquant la synthèse des protéines et des acides nucléiques. Toutefois, certaines préoccupations telles que la faible sensibilité, une forte résistance et de haute toxicité peuvent limiter leurs applications en culture cellulaire. Sur la base de ces considérations, nous pensons qu'il est nécessaire de comparer l'efficacité de A2PP, CIP, MYCO I et MYCO II dans la prévention de M
. hyorhinis
infection. Par Western blot et analyses qPCR, nous avons constaté que l'effet inhibiteur du A2PP sur M
. hyorhinis
infection était similaire à celle de MYCO I, mais il était mieux que ceux du CIP et MYCO II (Fig 8A et 8B). Fait intéressant, nous avons constaté que A2PP pourrait également éliminer efficacement le M
. hyorhinis
infection dans les cellules fortement infectées dans le processus de passages de P _{1 à P 3 (Fig 8C et 8D). En outre, par rapport à MYCO I et II MYCO, A2PP avait moins d'effet inhibiteur sur la prolifération des cellules (Fig 9A). Pour explorer les mécanismes de A2PP, CIP, MYCO I et les effets de MYCO II sur la prolifération des cellules, nous avons procédé à l'analyse des microréseaux et projeté un sous-ensemble de gènes exprimés de manière différentielle dans A2PP, CIP, MYCO I et II MYCO cellules traitées. L'analyse quantitative RT-PCR a montré une expression accrue de gènes liés à l'apoptose ( ATF5
, DDIT3
, CEBPB
) par MYCO I et traitement MYCO II, mais peu de changements ont été observée dans A2PP et les groupes CIP (Fig 9B). Ces résultats indiquent que A2PP a moins de toxicité et un meilleur potentiel de prévention dans le blocage M
. hyorhinis
infection dans les cellules cultivées.}

Discussion

infection Mycoplasma et la contamination sont encore répandus aujourd'hui et apportent des risques considérables pour les patients et la qualité de la recherche. Au cours des dernières années, plusieurs études ont suggéré que l'infection à mycoplasme était également associé à la tumorigenèse [3-8]. l'infection par Mycoplasma pourrait causer des dommages de l'ADN, affectent l'expression génique, et de perturber le point de contrôle du cycle cellulaire et la réponse apoptotique [30]. M
. hyorhinis
a été trouvé dans 56% des cancers gastriques, tissus 55,1% des cancers du côlon et 39,7% des cancers du sein [20]. En outre, les tests sérologiques ont montré que 36% l'hyperplasie bénigne de la prostate (HBP) et 52% des tissus du cancer de la prostate ont été M
. hyorhinis
positif [4]. Ces études suggèrent une association possible entre M
. hyorhinis
infection et l'apparition de tumeurs [4,20]. De plus, dans le processus de culture cellulaire, les sources de contamination les plus courants sont les mycoplasmes, bactéries et moisissures, mais le taux de mycoplasmes de contamination est relativement plus élevée [13]. Les résultats des différents groupes ont montré que le taux de contamination par des mycoplasmes variait de 15 à 80%, parfois même atteint 100% [15,31]. Une analyse de séquences d'ADN à partir de 1000 génomes projet impliquait que 7% des échantillons étaient contaminés par des mycoplasmes [32]. Cependant, la prévention de l'infection à mycoplasme et la contamination est difficile. Tout d'abord, en raison de pléomorphe, la plasticité, la filtrabilité et la solubilité facile, mycoplasmes pourraient passer à travers la membrane de microfiltration facilement, les rendant existent sur la surface de la cellule hôte ou à endocytose par les cellules [1,13,33]. En second lieu, les mycoplasmes manque parois cellulaires, ce qui les rend insensibles aux antibiotiques qui inhibent la synthèse de la paroi cellulaire, tels que la pénicilline. antimicrobiens efficaces existent, mais leurs applications continues en culture cellulaire est pas recommandée en raison de la toxicité pour les cellules. Enfin, le mycoplasme est une bactérie atypique, provoquant difficulities dans le diagnostic correct [34].

De nombreux médicaments anti-mycoplasmes ont été développés, tels que l'érythromycine, Leucomycin, roxithromycine, ofloxacine et la ciprofloxacine. Cependant, les effets indésirables, la toxicité et la résistance apportent toujours des problèmes de réduction de la pollution [10,11,35-38]. Par ailleurs, l'administration continue de ces antibiotiques ne pouvait pas éliminer complètement les mycoplasmes pour un ou même plusieurs semaines [39,40]. Par conséquent, il est important de trouver de nouveaux moyens qui permettent d'éliminer l'infection ou la contamination par des mycoplasmes de manière efficace et rapide. La solution à ce but peut probablement être trouvée par la caractérisation des mécanismes moléculaires sous-jacents l'infection à mycoplasme.

Notre étude antérieure a montré que l'interaction de la protéine P37 avec AXNA2 médiée M
. hyorhinis
infection [17]. Dans cette étude, nous avons tout d'abord synthétisé le polypeptide N-terminal de ANXA2 (A2PP) et validé son interaction spécifique avec la protéine GST-p37 dans la liaison de la phase solide et des essais streptavidine pull-down. Inspiré par cette interaction, nous nous demandions si A2PP pourrait antagoniser infection de M
. hyorhinis
. Nous avons constaté que A2PP, dans une concentration appropriée (20 uM), a diminué M
. hyorhinis
infection, la migration de l'infection promu inhibée, et réduit l'infection provoquée les phosphorylations de l'EGFR et ANXA2 dans les cellules de cancer gastrique. Ces effets ont été associés à une diminution de l'interaction entre p37 et ANXA2. Il convient de noter que seul A2PP présentait des effets minimes sur la prolifération des cellules et la phosphorylation de l'EGFR et ANXA2, ce qui suggère que A2PP est susceptible d'être un réactif utile pour réduire M
. hyorhinis
infection. Cette notion a été soutenue par des comparaisons de A2PP de et les effets des antibiotiques commerciaux sur la prolifération cellulaire et M
. hyorhinis
infection, qui a montré que A2PP avait en effet moins de toxicité pour les cellules, mais une forte capacité de contrer l'infection.

Malgré cela A2PP, un polypeptide de 30 aa, pourrait diminuer M
. infection hyorhinis
efficacement, nous avons encore besoin de comprendre si les formes tronquées de A2PP pourraient atteindre anti semblables M
. hyorhinis
capacité. En utilisant plusieurs peptides tronqués de A2PP, nous avons constaté que les séquences centrales (11 ^{e -20 e) de A2PP pourrait être le motif essentiel pour inhiber M
. hyorhinis
infection. Cependant, les effets inhibiteurs de peptides tronqués ne sont toujours pas aussi forte que celle de la pleine longueur A2PP, ce qui suggère que les séquences adjacentes sont essentielles pour maintenir une bonne structure à la réalisation efficace de liaison avec p37. D'autres études sont nécessaires pour trouver les effets de la modification et /ou la mutation de ce motif sur l'inhibition de M
. hyorhinis
infection}

Remerciements

Nous remercions et reconnaissons avec gratitude Lin Meng, le Dr Zhihua Tian (tous de l'Université de Pékin Cancer Hospital & Institut). Pour fournir des réactifs critiques ou l'assistance technique.

• PLOS ONE: Nicotine Inhibe Cisplatin-apoptose induite par l'intermédiaire de régulation α5-nAChR /AKT Signalisation dans Human Cancer gastrique Cells
• PLOS ONE: faible incidence de Synchrone ou métachrones Tumeurs après Endoscopic Dissection pour le cancer sous-muqueuse gastrique précoce avec indifférencié Histology