Plos ONE: N-Terminal polipeptid aneksina A2 Zmanjša Okužba Mycoplasma hyorhinis do želodca raka celice

Povzetek

okužba Mycoplasma v humani in njegova kontaminacija v celičnih kulturah so problemi v svetu. Zdravila so trenutno na voljo za preprečevanje ali zdravljenje okužbe Mycoplasma trpijo zaradi nizke občutljivosti, močan odpor in visoke toksičnosti. Naše prejšnje delo, je pokazala, da je Mycoplasma hyorhinis
( M
. hyorhinis
) okužba je bila posredovana interakcija med P37 s M
. hyorhinis
in aneksin A2 (ANXA2) gostiteljskih celic, vendar translacijski vrednost tega mehanizma je bil znan. Tukaj, smo sintetizirali N-terminala ANXA2 polipeptidom (A2PP) in ugotovili, da lahko A2PP zmanjša infekcijo M
. hyorhinis
do želodca rakavih celic in blok M
. hyorhinis
migracije Okužba inducirane celic. Poleg tega smo ugotovili, da bi lahko A2PP zmanjšanje M
. hyorhinis
kontaminacija prehodnih celic. Še več, v primerjavi s komercialnimi antibiotikov, ki se običajno uporabljajo v celični kulturi, da se prepreči M
. hyorhinis
okužba, A2PP pokazala večjo učinkovitost, ampak nizko toksičnost na rast celic. Tako, naša študija je prvič pokazala potencial A2PP je za zdravljenje in preprečevanje M
. hyorhinis
okužba

Navedba. Yuan S, Qu L, Shou C (2016) N-Terminal polipeptid aneksina A2 Zmanjša okužba Mycoplasma hyorhinis
do želodca raka celice . PLoS ONE 11 (1): e0147776. doi: 10,1371 /journal.pone.0147776

Urednik: Gernot Zissel, Universitatsklinikum Freiburg, Nemčija

Prejeto: 16. oktober 2015; Sprejeto: 7. januar 2016; Objavljeno: 26. januar 2016

Copyright: © 2016 Yuan et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

razpoložljivost podatkov. Vse ustrezne podatki so v papirju. Podatki mikromrež je bil deponiran v NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (pristopno no.GSE73777)

Financiranje:. National Natural Science Foundation Kitajske (81572532) Stvarno. http://www.nsfc.gov.cn/publish/portal1/. SCC prejel sredstva. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da niso konkurenčni interesi obstajajo

Uvod

Patogeni mikoplazme, vključno z Mycoplasma pneumoniae ( M
. pneumoniae
), mikoplazma hyorhinis ( M
. hyorhinis
), ustni mikoplazma ( M
. orale
) in Mycoplasma genitalium ( M
. genitalium
), spadajo v razred mollicutes, ki je najmanjša mikroorganizem živi v naravi in ​​lahko dvojnik neodvisno [1-2]. Številne študije so pokazale, da je bila okužba s temi mikoplazem, povezane z razvojem tumor [3-8]. M
. orale
povzroča kromosomske nenormalnosti v diploidnih celic človeških in povzroča transformacijo celic [6]. Okužba z M
. hyorhinis
ali M
. genitalium
lahko poveča migracije in invazivnosti prostate epitelijskih celic [3]. M
. hyorhinis
okužba je bila povezana z artritisom, serositis, neplodnostjo in rakom človeških [9-12].

Poleg tega, kontaminacija mikoplazme v celični kulturi je resen problem in stopnja prehodnih celic okuženi z mikoplazme je visoka. Celična kultura se pogosto uporablja v bioloških ved, kot na osnovne raziskave, preskušanja raziskave kliničnega, razvojem in proizvodnjo bioloških izdelkov, kot tudi na področju biofarmacevtskih in cepiv proizvodnje. Preprečevanje celice iz mikrobne kontaminacije, je ključnega pomena, da se zagotovi kakovost raziskav. Onesnaženje z mikoplazma je najbolj pogosta težava v celični kulturi z incidenco 30% -60% [1]. Pokazalo se je, da so štiri vrste mikoplazem predstavljajo več kot 95% okužbe v celični kulturi, vključno s M
. orale
, arginin mikoplazme ( M
. arginini
), M
. hyorhinis
in Levin je ne Acholeplasma ( A
. laidlawii
) [13,14,15,16]. Zaradi majhnosti, mikoplazme je komaj mogoče najti pod svetlobnim mikroskopom in se enostavno ignorira raziskovalci. V zadnjih letih so številni antibiotiki, ki se uporabljajo za zdravljenje mikoplazmami večkrat povzročila nastanek odpornosti mikoplazmami. Zaradi tega je nujno, da razvoj novih zdravil za preprečevanje ali zmanjševanje okužbe Mycoplasma.

Naše prejšnje delo je pokazala, da je M
. hyorhinis
okužbe je odvisna od interakcije P37 (velikega membranskega proteina M
. hyorhinis
) in gostitelj ANXA2 s svojimi N-terminal domene. Našli smo tudi poliklonsko protitelo do P37 lahko blokirajo okužbo M
. hyorhinis
in zmanjšanje M
. hyorhinis
-promoted migracija želodčne celice raka [17]. Na podlagi teh odkritij, smo zbrali s hipotezo, da je peptid sintetiziramo po zaporedju amino kislin ANXA2 N-mejnemu območju (od 1 ^{st do 30 th aa, tu poimenovali ta peptid kot A2PP) lahko blokira M
. hyorhinis
okužba prek konkurence s ANXA2 in morda se uporablja kot zdravilo za preprečevanje M
. hyorhinis
okužba v celični kulturi. V tej študiji smo testirali to hipotezo in primerjali učinke A2PP z drugimi zdravili pri preprečevanju M
. hyorhinis
okužbe.}

Materiali in metode

celični kulturi

AGS želodčnega raka celična linija je od American Type Culture Collection (ATCC). BGC823 želodčni rak celično linijo je bila ustanovljena z Peking University ljudske bolnišnici in je bila kupljena od Cell Culture Center kitajske akademije medicinskih znanosti (Peking, Kitajska). AGS in BGC823 celice smo gojili v mediju RPMI-1640 dopolnjenem 10% fetalnega telečjega seruma, pridobljenega iz Invitrogen (Carlssbab, CA, ZDA). Test Mycoplasma je bil izveden pred vsakim novim poskusom, ki ga pomnoževanje M
. hyorhinis P37
.

Mycoplasma Razmnoževanje in Co-Culture

razmnoževanje Mycoplasma in co-kultura je bila izvedena, kot smo že poročali [17,18,19].

protitelesa in reagenti

Anti-P37 monoklonsko protitelo PD4 je bil ustvarjen in poprej označili [5,20,21]. Poliklonalni anti-P37 protitelesa smo dobili od imunizacijo zajca z GST-P37 fuzijski protein po standardnem protokolu. Anti-EGFR in anti-fosfo-EGFR je bila kupljena od signalizacijo med celicami tehnologijo (CST, ZDA). Anti-ANXA2 je od Novus biotehnologijo (Novus biotehnologijo, ZDA). Anti-fosfo-ANXA2 je iz Santa Cruz (Santa Cruz, CA, ZDA). A2PP (1 ^{st 30 th aa) in različne skrajšanih A2PP peptidi, vključno A2PP-Nd4 (5 th do 30 th aa), A2PP-ND8 (9 th do 30 th aa), A2PP-Nd12 (13 rd do 30. th aa), A2PP-Nd16 (17 th do 30 th aa), A2PP-CD4 (1 st na 26 th aa), A2PP-CD8 (1 st do 22 nd aa), A2PP-Cd12 (1 st do 18 th aa), A2PP- CD16 (1 st do 14 th aa), skupaj z naključnimi kontrolnimi peptidi (ConP) smo sintetizirali Sbsbio (Peking, Kitajska). Protimikrobna mikoplazma I (MYCO I) in mikoplazma II (MYCO II) so bile kupljene od M & C genske tehnologije (Peking, Kitajska). Ciprofloksacin (CIP) je bil iz Double-Žerjav Pharm (Peking, Kitajska).}

Odkrivanje M
. hyorhinis
s kvantitativnim PCR (qPCR)

DNA je bila vzeta iz AGS ali BGC823 celic po M
. hyorhinis
infekcija z DNK liznega pufra (50 mM Tris pH 8,5, 1 mM EDTA, 0,5% Tween-20 in 200 mg /L proteinaze K) po standardnem protokolu. qPCR je bila izvedena s 30 ng DNA in SYBR Green Real-time PCR 2 × premiks kit (Takara, Otsu, Japonska) z uporabo koraku sistem od ABI (Foster City, CA, ZDA). Reakcijski programi in P37
-specifična primerji (terminski: 5'-TATCTCATTGACCTTGACTAAC-3 'povratne: 5'-ATTTTCGCCAATAGCATTTG-3'), ki so bili prej [22] poročajo. Za primerjavo M
. hyorhinis
ravni DNA v celicah, GAPDH
(naprej: 5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 ', povratne: 5'-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3') je bila dopolnjena kot kontrolo in podatke smo analizirali s pomočjo z 2 ^{-ΔΔCt metoda. Temeljni premazi smo sintetizirali Sangon (Shanghai, Kitajska).}

Western blot

Celice so bile pridelane iz kulture jed z 2 x SDS pufra. Poliakrilamidni gel elektroforeza (SDS-PAGE) in Western blot smo izvedli kot je opisano prej [23].

Cell ELISA

96-dobro smo zasejali s celicami (1 × 10 ^{4 /vdolbinico), čemur sledi obdelavo navedenih peptidov in okužba M
. hyorhinis
za 24 ur. Celice smo imobilizirali z 0,05% glutaraldehid za 10 minut, nato pa celica ELISA je bila izvedena, kot je opisano prej [24].}

Solid-Phase Test vezave in spustnem Vsebnost

rekombinantni GST-P37 in GST proteini so nastali, in čistimo, kot je prej opisano, [17]. GST-P37 in GST smo razredčili v pufru (0,1 M Na _{2CO 3, 0,1 M NaHCO 3, PH 9,6) in prevleko iz 96-vodnjakov ploščah pri 4 ° C preko noči. Plošče smo sprali s PBS trikrat in blokira 5% posnetega mleka /PBS pri sobni temperaturi (RT) 2 uri. Po spiranju s PBS, je navedeno dodamo koncentracije biotina konjugiranih A2PP (s Sbsbio sintetiziranega) in inkubiramo pri sobni temperaturi 2 uri. Po spiranju s PBST 3-krat, streptavidina, konjugiranega HO (Baltimore Pike, West Grove, PA, ZDA) je bila dodana in inkubirana pri sobni temperaturi za 30 minut. Po razvijanju barve z Ortho-fenilendiamin (Sigma), optično gostoto pri 490 nm (OD490) je bil posnet z bralnikom Microplate (Bio-Rad 550). Pri spustnem testu je bil 100 ng GST-P37 ali GST protein co-inkubirali z 20 um biotin-A2PP in Streptavidin kroglice (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, ZDA) v vezavo pufru (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCI, 0,5% NP-40, 0,5 mM DTT, 1 mM PMSF in 1 x kompletni inhibitorji proteaz) pri 4 ° C preko noči. Usedline speremo z zavezujočim pufrom za štirikrat in analizirali z metodo Western blot.}

Co-imuno

M
. hyorhinis
okužene celice (BGC823 ali AGS) smo homogenizirali v liznega pufra (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 1 mM PMSF in 1 x kompletni proteaznih inhibitorjev) pri 4 ° C za 10 minut. Po 12, 000 g centrifugiranjem 10 minut pri 4 ° C, smo pobrali supernatante. Beljakovinski lizati (500 ug) inkubiranih pri 20 uM A2PP ali ConP, 1 mikrogramov anti-ANXA2 plus protein G Sepharose kroglice (GE Healthcare) pri 4 ° C čez noč. Predhodno imunski IgG (1 ug) je bila uporabljena kot kontrolo. Izpadle kroglice speremo z liznega pufra za štirikrat, eluiran v 2 x pufra, kuhano in analiziramo z Western blotting-om.

imunofluoroscenca

Celice smo zasejali v coverslips in kultivirane preko noči. Naslednji dan smo celice obdelali z navedenimi peptidov okužene z M
. hyorhinis
za 24 ur. Nato smo celice izprali z ledeno mrzlo PBS trikrat, določene v 4% paraformaldehida v 15 min pri sobni temperaturi. Po blokiranje 1 uro pri 5% BSA /PBS, smo celice inkubirali z navedenimi protitelesi pri sobni temperaturi za 1 uro. Naslednji smo celice izprali 3-krat spet s PBST in inkubirali s FITC ali TRITC označeni sekundarnih protiteles 30 minut pri sobni temperaturi. Po spiranju s PBS in counterstaining z DAPI smo celice nameščen na 50% glicerola /PBS. Objektiv ZEISS LSM780 konfokalna mikroskop (ZEISS Microsystems, Oberkochen, Nemčija) smo uporabili za opazovanje lokalizacijo navedenih proteinov.

Cell migracije Vsebnost

Transwell komora z 8,0 mikrometrov por membrane (Corning, NY, ZDA) je bil uporabljen v celične migracije testom. Dno komora je napolnjena s 800 xl medij, ki vsebuje 10% FBS kot chemoattractant. Celice smo resuspendirali v mediju brez seruma, ki vsebuje M
. hyorhinis
plus A2PP ali ConP, nato smo previdno prenese na zgornjo komoro vsakega aparata Transwell z gostoto 2 x 10 ^{5 celic /ml (120 ml /komora). Celice pustimo, da migrirajo 24 ur pri 37 ° C. Vrhnja površina vsakega membrane bilo očiščeno celic z bombažno krpico. Celice prodrli na spodnji strani membrane so bile določene v hladnim metanolom, obarvamo z 0,1% kristal vijoličnim in šteje v devetih naključno izbranih mikroskopskih poljih na jamico. Vsak vzorec smo pripravili na trojnih komorah in vsak poskus smo ponovili vsaj 3-krat.}

celično proliferacijo testu

želodcu rakave celice smo zasejali v gojitvenih ploščah s 96 vdolbinami pri gostoti 5 x 10 ^{3/100 ml /tudi v treh izvodih, in so bili zdravljeni z označenimi reagentov. Proliferacijo celic so količinsko ob sotočju celic z CloneSelect Imager (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ZDA).}

Mikromrežni Analiza in Real-Time RT-PCR

AGS in BGC823 celice ( 1 x 10 ^{6 na 10 cm 2 plate) so bili zdravljeni z A2PP, CIP, MYCO I in MYCO II za 24 ur, speremo s PBS in pridelani v TRIzola reagenta. Vzorce RNA so bili pregledani v OE biotehnologije (Shanghai, Kitajska), s pomočjo Affymetrix GeneChip ® PrimeView ™ humani Gene Expression Array. Podatki mikromrež je bil deponiran v NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (pristopni no.GSE73777). Raw so bili shranjeni podatki s pomočjo Affymetrix GeneChip ukaz konzole (različica 4.0, Affymetrix). Dalje, Genespring programske opreme (različica 12.5, Agilent Technologies) je bil zaposlen do konca osnovno analizo z neobdelanih podatkov. Za začetek je bilo neobdelanih podatkov normaliziral z RMA algoritem. Diferencialno izraženi geni so nato opredeljeni z kratno spremembo. Prag, določen za gor in dol reguliranih genov je kratna sprememba ≥ 2,0. Potem, GO in kegg analizo so bili uporabljeni za izbiro iz genov, ki se nanašajo na celični cikel in celične apoptoze. Real-time RT-PCR smo uporabili za potrditev rezultatov mikromrež in izvedena v skladu z navodili proizvajalcev (SYBR, TOYOBO). stopnje izraženosti sorodnih genov smo normalizirali s GAPDH
in 2 -ΔΔCT je bila uporabljena za izračun relativne genske ekspresije. Primerji za realnem času RT-PCR ( ATF
, naprej, 5'-GAGTGGCGACAGGATAGAGC-3 ', obratno, 5'-TTTAGCCTCCCTCCCTTAGC-3'; DDIT3
, naprej, 5 ' -GCGCATGAAGGAGAAAGAAC-3 ', obratno, 5'-ACCATTCGGTCAATCAGAGC-3'; CEBPB
, naprej, 5'-AGCGACGAGTACAAGATCCG-3 ', obratno, 5'-AGCTGCTCCACCTTCTTCTG-3') smo sintetizirali Sangon <. br>}

Statistična analiza

Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SD. Razlike so bili analizirani z ANOVA pomočjo SPSS 11.0 programske opreme in P < 0.05 smo imeli za statistično značilne.

mikromrež pristopno številko

podatki Mikromrežni je deponiran v NCBI Gene Expression Omnibus (GSO) (pristop št. GSE73777).

Rezultati

A2PP nima vpliva na sposobnost preživetja ali migracije celic želodca raka

da bi ocenili vlogo ANXA2 je N-terminalni domeni v M
. hyorhinis
okužbo, smo najprej sintetiziramo A2PP peptid, ki ustreza N-terminalu ANXA2 (slika 1A). Biotin označeni A2PP je bil prikazan na specifično interakcijo z GST-P37 v trdnem vezavo fazo testa (slika 1B) in spustni testnem (slika 1C). Opazili smo, da A2PP ni vplivala na morfologijo AGS in BGC823 celic (slika 1D). Poleg tega, v koncentracijah manj kot 20 um, A2PP ni zaviral proliferacijo celic (slika 1E), kar kaže, da ima A2PP minimalno toksičnost za celice. EGFR je domnevno vpleten v regulacijo ANXA2 fosforilacijo [17,25,26], medtem ko je A2PP učinkov na phosphorylations ali ravni beljakovin EGFR in ANXA2 [Slika 2A]. Poleg tega je imel A2PP ne vpliva na migracijo AGS in BGC823 celic (slika 2B in 2C). Cellular lokalizacija ANXA2 ureja svoje fosforilacije, ki je ključnega pomena za njeno delovanje [17,27,28]. Našli smo A2PP ni spremenila subceličnih lokalizacijo endogenega ANXA2 (slika 2D). Ti rezultati kažejo, da ima sam A2PP ne vpliva na maligni fenotipi ali EGFR-ANXA2 signalizacijo želodca rakavih celic.

A2PP Zmanjšanja M
. hyorhinis
Okužba

Naše prejšnje delo je pokazala, da N-terminal ANXA2 posreduje M
. hyorhinis
okužba [17]. Kot je razvidno iz rezultata celic ELISA, smo ugotovili, da je M
. hyorhinis
okužba je blokirala A2PP na način, ki je odvisen od odmerka v BGC823 in AGS celic, vendar ConP-obdelane celice so še vedno zelo okuženi z M
. hyorhinis
(slika 3A). Ti rezultati so bili podprti s qPCR teste (slika 3b). Dosledno, A2PP znižala tudi raven beljakovin za P37 beljakovin v blot analizo Western (slika 3C in 3D). Medtem, ravni phophos-AXNA2 in phophos-EGFR v okuženih celicah pa so navzdol urejeno z obdelavo s A2PP (slika 3C in 3E), medtem ko je bila skupna stopnja AXNA2 in EGFR relativno stabilen (slika 3C). Pri analizi imunofluorescenčnim je A2PP ugotovili, da zavira M
. hyorhinis
okužba povzroča kopičenje P37 in co-lokalizacija med P37 in ANXA2 (slika 4A). V co-imuno testom z beljakovinskimi lizatov iz M
. Hyorhinis PODJETJA
okužene celice, A2PP zmanjšala interakcijo med P37 in ANXA2 (slika 4B). Skupaj ti dokazi podprl zamisel, da bi A2PP zmanjšanje M
. hyorhinis
okužba in potrdili naše prejšnje odkritje, da so potrebne N-terminal ANXA2 za posredovanje M
. hyorhinis
okužba [17].

A2PP zavira M
. hyorhinis
inducirano migracije

Naše predhodne študije kažejo, da je M
. hyorhinis
okužba lahko spodbujajo migracijo želodčnih rakavih celic [17, 23]. V tej študiji smo ugotovili, da je M
. hyorhinis
-promoted migracija želodčnih rakavih celic je ne ConP prizadela, vendar je bila v odvisnosti od odmerka zavira A2PP (slika 5A in 5B). Ti rezultati kažejo, da A2PP zaviral M
. hyorhinis
inducirano migracijo, ki je bila povezana z njegovo sposobnost, da zmanjša, okužbe napredoval phosphorylations EGFR in ANXA2 (slika 3C in 3E).

A2PP je Essential motiv Zmanjšanje M
. hyorhinis
Okužba

Za opredelitev kritične motiv A2PP, smo skušali ugotoviti, ali različnih okrnjenih peptidov A2PP (slika 6A) lahko zmanjša M
. hyorhinis
okužbe. Pri analizi qPCR, A2PP in okrnjenih peptidi A2PP-Nd4, ND8 Nd12, CD4, CD8, in Cd12 zmanjša M
. hyorhinis
okužba želodca rakavih celicah, vendar A2PP-Nd16 in A2PP-CD16 ni zmanjšala M
. hyorhinis
okužba (slika 6B). Podoben vzorec inhibicije smo dobili od Western blot testom (slika 6c). Ti rezultati kažejo na obstoj določenega motiva A2PP je bistvenega pomena za njegovo sposobnost, da zmanjša M
. hyorhinis
okužbe. Da bi še dodatno karto temeljne sekvence tej potencialni motiv, smo sintetizirali dva peptide, ki ustrezajo 11 ^{th -20 th aa (imenovana kot A2PP-10aa) in 13 th -18 th aa (označilo kot A2PP-6aa) (slika 7A). V qPCR testu, bi lahko oba peptidi zmanjšanje M
. hyorhinis
okužba (slika 7B), ki je bila podprta z Western blot testom (slika 7c). Predvsem so bili zaviralni učinki A2PP-10aa boljši od tistih A2PP-6aa, vendar učinke obeh peptidov so bile manj robustna kot tiste A2PP (slika 7B in 7C). Thesefore, osrednji sekvence (11 th -20 th) z dne A2PP bi lahko bistveno motiv, da zavira M
. hyorhinis
okužbe.}

Primerjava A2PP z drugimi zdravili pri preprečevanju M
. hyorhinis
Okužba

M
. hyorhinis
je bil eden od glavnih virov onesnaževanja celične kulture [13,14,15]. Najboljši način za odpravo M
. hyorhinis
okužba zavreči celice in hitro sterilizacijo vse vzpostavi stik plovila z, vendar so nekateri okužene celice ni mogoče nadomestiti v več primerih. Zato je nujno, da se uporabljajo posebne antimikrobne pristope za preprečitev ali odpravo M
. hyorhinis
okužbe. Tam so bili različni antimikrobna sredstva za preprečevanje M
. hyorhinis
okužil. Na primer, lahko ciprofloksacin (CIP) izkoreninjenje M
. hyorhinis
v primerni koncentraciji [29]. Dve antimikrobne sestavine imenovan kot mikoplazme I (MYCO I) in mikoplazma II (MYCO II) bi lahko zmanjšali M
. hyorhinis
okužba z blokado svojo sintezo beljakovin in nukleinskih kislin. Vendar pa lahko nekateri pomisleki, kot so nizke občutljivosti, močan odpor in visoka toksičnost omejiti njihove aplikacije v celični kulturi. Na podlagi teh ugotovitev, menimo, da je treba primerjati izkoristke A2PP, CIP, MYCO I in MYCO II pri preprečevanju M
. hyorhinis
okužbe. Z metodo Western blot in qPCR testih smo ugotovili, da zaviralnega učinka A2PP o M
. hyorhinis
okužba je bila podobna kot pri MYCO I, vendar pa je bil boljši od tistih, CIP in MYCO II (slika 8A in 8B). Zanimivo je, da smo ugotovili, da bi lahko A2PP tudi učinkovito odpraviti M
. hyorhinis
okužba močno okuženih celic v procesu prehodov iz P _{1 do P 3 (slika 8C in 8D). Poleg tega v primerjavi z MYCO I in II MYCO imela A2PP manj zaviralnega učinka na celice proliferacijo (slika 9A). Raziskati mehanizme A2PP, CIP, MYCO I in učinkov MYCO II je na celice orožja, smo izvedli analizo mikromrež in pregledani podskupino različno izraženih genov v A2PP, CIP, MYCO I in MYCO II zdraviti celice. Kvantitativna analiza RT-PCR je pokazala povečano izražanje, povezanih z apoptoze genov ( ATF5
, DDIT3
, CEBPB
), ki ga MYCO I in zdravljenje MYCO II, ampak malo spremembe so bile opazili pri A2PP in skupine za varovanje ključne infrastrukture (slika 9b). Ti rezultati kažejo, da ima A2PP manj toksičnost in boljše preventivno potencial blokiranje M
. hyorhinis
okužba v kultiviranih celicah.}

Pogovor

okužba Mycoplasma in onesnaženje še vedno prevladujejo danes in prinašajo precejšnje tveganje za bolnike in kakovosti raziskovanja. V zadnjih letih je bilo več študij kažejo, da je bila okužba mikoplazma povezana tudi z tumorigeneze [3-8]. okužba Mycoplasma lahko povzroči poškodbe DNA, vpliva na izražanje genov, in motijo ​​kontrolno točko na celičnega ciklusa in apoptotske odgovor [30]. M
. hyorhinis
so našli v 56% želodca raka, 55.1% kolona raka in 39,7% dojk rak tkiva [20]. Poleg tega, serološke preiskave so pokazale, da je bilo 36%, benigna hiperplazija prostate (BPH) in 52% raka prostate tkiva M
. hyorhinis
pozitiven [4]. Te študije kažejo na možno povezavo med M
. hyorhinis
okužbe in pojava tumorjev [4,20]. Še več, v procesu celične kulture, najpogostejši vir onesnaženja so mikoplazma, bakterije in plesni, vendar pa je stopnja kontaminacije mikoplazme razmeroma višja [13]. Rezultati iz različnih skupin so pokazali, da je stopnja kontaminacije mikoplazmami gibala od 15 do 80%, nekateri celo dosegla 100% [15,31]. Analiza zaporedja DNK od 1000 genomov Projektno pomenilo, da je bilo 7% vzorcev onesnažene z mikoplazme [32]. Vendar pa je preprečevanje okužbe Mycoplasma in kontaminacijo je težko. Prvič, zaradi pleomorfne, plastičnosti, filtriranja, enostavno topnosti, lahko mikoplazme prehajajo skozi microfiltration membrano brez težav, zaradi česar jih obstaja na gostiteljske celice površini ali naj bi endocitira celice [1,13,33]. Drugič, mikoplazme nima celične stene, da postanejo neobčutljivi na antibiotike, ki zavirajo sintezo celične stene, na primer penicilin. Učinkovito protimikrobna storiti obstajajo, vendar je njihova stalno aplikacije v celični kulturi ni priporočljiva zaradi toksičnosti za celice. Končno, mikoplazme je a atipične bakterije, ki povzročajo difficulities v pravilnem diagnosticiranju [34].

Veliko anti-mikoplazma zdravila so bili razviti, kot so eritromicin, Leucomycin, Roxithromycina, ofloksacija in ciprofloksacin. Vendar škodljivi učinki, toksičnost in odpornost še vedno prinašajo dovolj za zmanjšanje onesnaževanja [10,11,35-38]. Poleg tega neprekinjeno dajanje teh antibiotikov ne more v celoti odpraviti Mycoplasma za eno ali celo več tednov [39,40]. Zato je ključnega pomena, da bi našli nove načine, s katerimi lahko učinkovito in pravočasno odpravo okužbe Mycoplasma ali kontaminacije. Rešitev za ta namen, je verjetno mogoče najti z karakterizacijo molekularnih mehanizmov, povezanih okužbo Mycoplasma.

Naša predhodna študija je pokazala, da je interakcija P37 beljakovin z AXNA2 posredovano M
. hyorhinis
okužba [17]. V tej študiji, smo najprej sintetizirali N-terminalni polipeptid ANXA2 (A2PP) in potrdi njegovo specifično interakcijo s GST-P37 proteina v trdni fazi vezavo in streptavidina spustni testi. s takšno interakcijo navdih, smo se spraševali, ali bi A2PP nevtralizira okužbo M
. hyorhinis
. Ugotovili smo, da A2PP, v ustrezni koncentraciji (20 uM), zmanjšal M
. hyorhinis
okužba, zaviral migracije okužbo napredoval, in zmanjša okužba izzvala phosphorylations EGFR in ANXA2 v želodčnih rakavih celic. Ti učinki so bili povezani z zmanjšano interakcijo med P37 in ANXA2. Opozoriti je treba, da A2PP samostojno razstavljal minimalne učinke na proliferacijo celic in phosphorylations z EGFR in ANXA2, kar kaže, da je A2PP verjetno, da bo koristno reagent za zmanjšanje M
. hyorhinis
okužbe. Ta pojem je bil podprt s primerjavah A2PP je in učinkov poslovnih antibiotikov "na celično proliferacijo in M
. hyorhinis
okužba, ki je pokazala, da so imeli A2PP manj toksičnost za celice, vendar močno sposobnost, da preprečijo okužbo.

Kljub tem A2PP, 30 aa polipeptid, bi lahko zmanjšalo M
. hyorhinis
okužba učinkovito, moramo še ugotoviti, ali bi okrnjenih oblike A2PP doseči podoben boj proti M
. hyorhinis
sposobnost. Z uporabo več okrnjene peptide A2PP, smo ugotovili, da bi lahko osrednji sekvence (11 ^{th -20 th) iz A2PP bistven motiv za zaviranje M
. hyorhinis
okužbe. Vendar pa so bili zaviralni učinki okrnjenih peptidov še vedno ni tako močna, kot je celovečerni A2PP, kar kaže, da so spremljajoči sekvence bistvenega pomena za ohranitev ustrezne strukture za doseganje učinkovite vezave s P37. Nadaljnje raziskave so potrebne, da bi našli učinke spremembe ali /in mutacijo tega motiva na inhibicijo M
. hyorhinis
okužba}

Priznanja

zahvaljujemo in se zahvaljujeta Lin Meng, dr Zhihua Tian (vse iz Peking University Cancer Hospital & Institute). Za zagotavljanje kritične reagentov ali tehnična pomoč.

• Plos ONE: Nikotin zavira Cisplatin-inducirane apoptoze preko urejanju α5-nAChR /AKT signalnega v Human želodca raka celic
• Plos ONE: Nizka Pojavnost sinhronskega ali Metachronous tumorje po endoskopske Submukozno Dissection za zgodnje Rak želodca z nediferencirano Histology