Ploche ONE: N-Terminal polypeptid annexinu A2 Znižuje Infekcia Mycoplasma hyorhinis sa rakovina žalúdka Cells

abstraktné

Mycoplasma infekcie u človeka a jeho kontaminácie v bunkových kultúrach sú celosvetovým problémom. Lieky v súčasnej dobe k dispozícii pre prevenciu alebo liečbu infekcií Mycoplasma trpia nízku citlivosť, silnú odolnosť a vysokú toxicitou. Naše predchádzajúce práce ukázali, že Mycoplasma hyorhinis
( M
. hyorhinis
) infekcia bola sprostredkovaná interakciou medzi P37 zo M
. hyorhinis stroje a annexinu A2 (ANXA2) hostiteľských buniek, avšak translačný hodnota tohto mechanizmu bola neznáma. V tomto dokumente, sme syntetizuje N-konci polypeptidu ANXA2 (A2PP), a zistilo sa, že by mohla znížiť A2PP infekciu M
. hyorhinis
k rakovinovým bunkám žalúdka a blokom M
. hyorhinis
infekcia vyvolaná bunková migrácia. Ďalej sme zistili, že A2PP by mohla znížiť M
. hyorhinis
kontaminácie priechodných buniek. Okrem toho, v porovnaní s komerčnými antibiotík bežne používané v bunkovej kultúre, aby sa zabránilo M
. hyorhinis
infekcie, A2PP preukázala väčšiu účinnosť, ale nízku toxicitu na rast buniek. Preto naša štúdia prvýkrát odhalil potenciál A2PP pre liečbu a prevenciu M
. hyorhinis
infekcie

Citácia :. Yuan S, Qu L, Shou C (2016) N-Terminal polypeptid annexinu A2 Znižuje infekciu Mycoplasma hyorhinis
do žalúdka nádorových buniek , PLoS ONE 11 (1): e0147776. doi: 10,1371 /journal.pone.0147776

Editor Gernot Zissel, Universitätsklinikum Freiburg, Nemecko |

Prijaté: 16. októbra 2015; Prijaté: 07.1.2016; Uverejnené: 26. januára 2016

Copyright: © 2016 Yuan et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Dáta Availability :. Všetky relevantné údaje sú v papieri. Microarray dáta bola uložená v NCBI génovej expresie Omnibus (GEO) (prístupové no.GSE73777)

Financovanie :. Darcovia Národná prírodná Science Foundation Číny (81572532). http://www.nsfc.gov.cn/publish/portal1/. SCC získala finančné prostriedky. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo príprave rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

patogénne mykoplazmy, vrátane Mycoplasma pneumoniae ( M
. pneumoniae
), Mycoplasma hyorhinis ( M
. hyorhinis
), ústna Mycoplasma ( M
. orale
) a Mycoplasma genitalium ( M
. genitalium
), patrí do triedy Mollicutes, čo je najmenší mikroorganizmus žijúci v prírode a môže duplikovať nezávisle [1-2]. Mnoho štúdií ukázalo, že infekcia s týmito mykoplaziem bola spojená s vývoj nádoru [3-8]. M
. orale
spôsobuje chromozomálne abnormality v ľudských diploidných bunkách a vyvoláva bunkovú transformáciu [6]. Infekcia M
. hyorhinis
alebo M
. genitalium
by mohlo zvýšiť migráciu a invazivitu prostaty epiteliálnych buniek [3]. M
. hyorhinis
infekcie bola spojená s artritídou, serozitida, neplodnosť a rakoviny človeka [9-12].

Navyše kontaminované mykoplazmy v bunkovej kultúre, je vážnym problémom a rýchlosť priechodu buniek nakazený mykoplazmy je vysoká. Bunková kultúra je široko používaný v biologických vedách, ako v základnom výskume, klinickej skúšky, výskum, vývoj a výrobu biologických produktov, ako aj v oblasti biofarmaceutických a vakcín výroby. Prevencia bunky pred mikrobiálnej kontaminácie má zásadný význam pre zabezpečenie kvality výskumu. Kontaminácia Mycoplasma je najčastejší problém v bunkovej kultúre s výskytom 30% -60% [1]. Ukázalo sa, že štyri druhy mykoplaziem tvorí viac ako 95% z infekcie v bunkovej kultúre, a M
. orale
, arginín Mycoplasma ( M
. arginínu
), M
. hyorhinis
, a Levin je nie Acholeplasma ( A
. laidlawii
) [13,14,15,16]. Vzhľadom k malej veľkosti, Mycoplasma je ťažko sa nachádza pod svetelným mikroskopom a je ľahko ignorovať výskumníkmi. V posledných rokoch rad antibiotiká používané na liečbu mykoplaziem opakovane za následok vznik rezistencie mykoplazmy. Z týchto dôvodov je nutné vyvinúť nové prostriedky pre prevenciu alebo zníženie Mycoplasma infekcie.

Naše predchádzajúce práce ukázali, že M
. hyorhinis
infekcie závisí na interakciu (P37 hlavný membránový proteín M
. hyorhinis
) a hostiteľ ANXA2 prostredníctvom ich N-terminálny domény. Tiež sme zistili, polyklonálne protilátky k P37 môže blokovať infekciu M
. hyorhinis stroje a pokles M
. hyorhinis
-promoted migrácie žalúdočné nádorové bunky [17]. Na týchto objavoch, sme zvýšil hypotézu, že peptid, syntetizovaný podľa aminokyselinové sekvencie ANXA2 N-koncovej oblasti (1 ^{st na 30 th aa, tu sme nazvali tento peptid ako A2PP), je možné zablokovať M
. hyorhinis
infekcie prostredníctvom konkurencie s ANXA2 a prípadne byť použité ako liečivo pre prevenciu M
. hyorhinis
infekcie v bunkovej kultúre. V tejto štúdii sme testovali túto hypotézu a tiež porovnávala účinky A2PP s inými liekmi pri prevencii M
. hyorhinis
infekcie.}

Materiály a metódy

bunkovej kultúre

AGS karcinómu žalúdka bunková línia bola od American Type Culture Collection (ATCC). BGC823 rakovina žalúdka bunková línia bola založená Pekinskej univerzite ľudovej nemocnici a bol zakúpený od firmy Cell kultúrne centrum Čínskej akadémie lekárskych vied (Peking, Čína). AGS a BGC823 bunky boli kultivované v médiu RPMI-1640, doplnenom 10% fetálneho teľacieho séra, získaného od firmy Invitrogen (Carlssbab, CA, USA). Mycoplasma skúška bola vykonaná pred každým novým experimentu PCR amplifikáciu M
. hyorhinis P37
.

Mycoplasma Propagácia a Co-kultúra

propagácie Mycoplasma a kokultivace bola vykonaná ako bolo oznámené predtým [17,18,19].

protilátky a činidlá

Anti-P37 monoklonálna protilátka PD4 generoval a charakterizovaný skôr [5,20,21]. Polyklonálne anti-P37 protilátka bola získaná od imunizáciou králikov s fúznym proteínom GST-P37 po štandardného protokolu. Anti-EGFR a anti-fosfo-EGFR bol zakúpený od firmy Cell Signaling Technology (CST, USA). Anti-ANXA2 bol od Novus Biotechnology (Novus Biotechnology, USA). Anti-fosfo-ANXA2 bol od Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA). A2PP (1 ^{st až 30 th aa) a rôzne skrátené A2PP peptidy, vrátane A2PP-ND4 (5 th až 30 th aa), A2PP-ND8 (9 teho 30 th aa), A2PP-ND12 (13 rd 30 th aa), A2PP-Nd16 (17 th až 30 th aa), A2PP-CD4 (1 st na 26 th aa), A2PP-CD8 (1 st na 22 nd aa), A2PP-Cd12 (1 st na 18 th aa), A2PP- CD16 (1 st až 14 th aa), spolu s náhodnými kontrolnými peptidy (coNP) boli syntetizované Sbsbio (Peking, Čína). Antimikrobiálne Mycoplasma I (MYCO I) a Mycoplasma II (MYCO II) boli zakúpené od M & C génovej technológie (Peking, Čína). Ciprofloxacín (CIP) bol od Double-Crane Pharm (Peking, Čína).}

Detekcia M
. hyorhinis
pomocou kvantitatívnej PCR (qPCR)

DNA bola extrahovaná z AGS alebo BGC823 buniek po M
. hyorhinis
infekcie DNA lyzačním pufri (50 mM Tris s pH 8,5, 1 mM EDTA, 0,5% Tween-20, a 200 mg /L proteinázy K) podľa štandardného protokolu. qPCR bola vykonaná s 30 ng DNA a SYBR Green Real-time PCR 2 × premix kit (Takara, Otsu, Japonsko) za použitia Krok číslo jedna systém od ABI (Foster City, CA, USA). Reakčná programy a P37
-specifických primery (forward: 5 'TATCTCATTGACCTTGACTAAC-3' reverznej: 5'-ATTTTCGCCAATAGCATTTG-3 ') boli hlásené už skôr [22]. Ak chcete porovnať M
. hyorhinis
hladina DNA v bunkách, GAPDH
(vpred: 5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 ', reverzné: 5'-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3 ") bol zosilnený ako kontrola a dáta boli analyzované s použitím 2 ^{-ΔΔCt metóda. Primery boli syntetizované Sangon (Shanghai, Čína).}

Western Blotting

Bunky boli zozbierané z kultivačnej misky s 2 x SDS pufra. Elektroforéza v polyakrylamidovom géle (SDS-PAGE) a Western blot boli vykonávané ako bolo opísané skôr [23].

Cell ELISA

96-jamkové boli vrúbľovať s bunkami (1 x 10 ^{4 /i), a následne spracovanie uvedených peptidov a infekcii M
. hyorhinis
po dobu 24 hodín. Bunky boli imobilizované 0,05% glutaraldehydu po dobu 10 minút, potom sa bunka ELISA bola vykonaná ako bolo opísané skôr [24].}

Solid-Phase Test väzby a rozbaľovací Assay

Rekombinantný GST-P37 a GST proteíny boli vytvorené a čistí sa ako je opísané skôr [17]. GST-P37 a GST boli nariedia v pufri (0,1 M Na _{2CO 3, 0,1 M NaHCO 3, pH 9,6) a cez noc potiahnuté s 96 priehlbinami pri teplote 4 ° C. Doštičky boli premyté PBS trikrát a blokované 5% odstredené mlieko /PBS pri teplote miestnosti (RT) počas 2 hodín. Po premytí PBS, pridané uvedenej koncentrácie biotínom konjugovaná A2PP (syntetizovaný Sbsbio) a inkubujú sa pri teplote miestnosti po dobu 2 hodín. Po premytí s PBST počas 3 krát, streptavidínu konjugovaného s HRP (Baltimore Pike, West Grove, PA, USA) bolo pridané a inkubovať pri izbovej teplote po dobu 30 minút. Po vyvinutí farby s Ortho-fenyléndiamínu (Sigma), optické hustoty pri 490 nm (OD490) bol zaznamenaný u readeru (Bio-Rad 550). Na rozbaľovací testu, 100 ng GST-P37 alebo GST proteín bol spoločne inkubované s 20 uM biotín-A2PP a streptavidínom guličiek (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA) vo väzobnom pufri (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% NP-40, 0,5 mM DTT, 1 mM PMSF a 1 x kompletný inhibítory proteázy), pri teplote 4 ° C cez noc. Zrazeniny boli premyté väzbovým pufrom štyrikrát a analyzované metódou Western blot.}

Co-Imunoprecipitácia

M
. hyorhinis
infikované bunky (BGC823 alebo AGS) boli homogenizované v lyzačním pufri (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 1 mM PMSF a 1 x kompletné inhibítory proteázy), pri teplote 4 ° C počas 10 min. Po 12, 000 g odstreďovanie počas 10 min pri 4 ° C a supernatanty boli oddelené. Proteínové lyzáty (500 ug) boli inkubované s 20 uM A2PP alebo coNP, 1 ug anti-ANXA2 a proteín G Sepharose guličky (GE Healthcare) pri 4 ° C cez noc. Pre-imúnna IgG (1 ug) bol použitý ako kontrola. Vyzrážané guľôčky sa promyly lyzačním pufra štyrikrát, vymýva v 2 x pufri, varené, a analyzované metódou Western blot.

Imunofluorescenčný test

Bunky boli schovať na krycie sklíčko a kultivujú sa cez noc. Ďalší deň sa bunky boli ošetrené s uvedenými peptidy a infikované M
. hyorhinis
po dobu 24 hodín. Potom boli bunky premyté ľadovo chladným PBS trikrát, pevné v 4% paraformaldehydu po dobu 15 minút pri teplote miestnosti. Po blokovaní po dobu 1 hodiny v 5% BSA /PBS, bunky boli inkubované s uvedenými protilátkami pri teplote miestnosti po dobu 1 hodiny. Ďalej boli bunky premyté 3 krát opäť pomocou PBST a inkubované s FITC alebo TRITC-značenej sekundárnej protilátky po dobu 30 minút pri teplote miestnosti. Po premytí s PBS a kontrastným s DAPI, bunky boli umiestnené na 50% glycerolu /PBS. Zeiss LSM780 konfokálna mikroskop (ZEISS Microsystems, Oberkochen, Nemecko) bola použitá pozorovať lokalizáciu označených proteínov.

Cell Migration Test

Transwell komora s 8,0 um klapiek (Corning, NY, USA) bol použitý v teste bunkovej migrácie. Spodná komora bola naplnená 800 ul média obsahujúceho 10% FBS ako chemoatraktantu. Bunky boli resuspendované v médiu bez séra obsahujúcom M
. hyorhinis stroje a A2PP alebo coNP, potom boli starostlivo prenesie do hornej komory každé zariadenie Transwell pri hustote 2 x 10 ^{5 buniek /ml (120 ul /komora). Bunky boli ponechané migrovať po dobu 24 hodín pri teplote 37 ° C. Horná plocha každej membrány bol zbavený buniek s vatovým tampónom. Bunky prenikli na spodnú stranu membrány boli fixované v chladnom metanole a zafarbené 0,1% kryštálovú violeťou a počítajú v deviatich náhodne vybraných mikroskopických poliach na jamku. Každá vzorka bol pripravený v triplikátech komôr a každý experiment bol opakovaný po dobu aspoň 3 krát.}

Cell testu proliferácie

žalúdočné rakovinové bunky boli nasadené na 96-jamkové kultivačné doštičky v hustote 5 x 10 ^{3/100 ul /jamka v troch vyhotoveniach, a boli liečení označených činidiel. Proliferáciu buniek boli kvantifikované bunkovej sútoku s CloneSelect Imager (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).}

Microarray Analýza a Real-Time RT-PCR

AGS a BGC823 bunky ( 1 x 10 ^{6 na 10 cm 2 dosky) boli liečení A2PP, CIP, MYCO i a II MYCO dobu 24 hodín, premyté PBS a zožne v TRIzolu činidlá. RNA vzorky boli skúmané v OE Biotechnology (Shanghai, Čína) pomocou Affymetrix GeneChip ® PrimeView ™ Human Gene Expression Array. Microarray dáta bola uložená v NCBI génovej expresie Omnibus (GEO) (prístupové no.GSE73777). Raw dáta bola zaznamenaná pomocou Affymetrix GeneChip konzolový príkaz (verzia 4.0, Affymetrix). Ďalej softvér Genespring (verzia 12.5, Agilent Technologies) bol použitý na dokončenie základnej analýzy s primárnymi údajmi. Po prvé, surové dáta bola normalizovaná pomocou algoritmu RMA. Odlišne exprimovaných génov potom boli identifikované pomocou násobné zmeny. Prah sada pre hore a dole regulovaných génov bola násobná zmena ≥ 2,0. Potom, GO a KEGG analýzy boli použité pre výber z génov, ktoré v súvislosti s bunkového cyklu a apoptózu buniek. Real-time RT-PCR bola použitá pre overenie výsledkov čipu a vykonáva v súlade s pokynmi výrobcov (SYBR, Toyobo). Hladiny expresie príbuzných génov boli normalizované pomocou GAPDH stroje a 2 -ΔΔCT bola použitá pre výpočet relatívnej expresie génu. Primery pre real-time RT-PCR ( ATF
dopredu, 5'-GAGTGGCGACAGGATAGAGC-3 ', reverzné, 5'-TTTAGCCTCCCTCCCTTAGC-3'; DDIT3
, vpred, 5 ' -GCGCATGAAGGAGAAAGAAC-3 ', reverzné, 5'-ACCATTCGGTCAATCAGAGC-3'; CEBPB
dopredu, 5'-AGCGACGAGTACAAGATCCG-3 ', reverzné, 5'-AGCTGCTCCACCTTCTTCTG-3') boli syntetizované Sangon <. br>}

Štatistická analýza

dáta bola prezentovaná ako priemer ± SD. Rozdiely boli analyzované metódou ANOVA za použitia programu SPSS 11.0 a P < 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú.

Microarray prístupové číslo

Microarray dáta bola uložená v NCBI génovej expresie Omnibus (GEO) (prírastkové č. GSE73777).

Výsledky

A2PP nemá žiadny vplyv na životaschopnosť alebo migráciu buniek rakovina žalúdka

aby bolo možné zhodnotiť úlohu ANXA2 svojej N-koncovej domény vo M
. hyorhinis
infekcie, sme najprv syntetizované A2PP peptid, zodpovedajúci N-koncu ANXA2 (obr 1A). Biotínom značený A2PP bolo preukázané, že špecificky interagujú s GST-P37 v teste väzbové fázy pevnej látky (obrázok 1B) a pull-down testu (obr 1C). Zistili sme, že A2PP neovplyvnil morfológiu AGS a BGC823 buniek (obr 1D). Okrem toho, v koncentráciách menších ako 20 um, A2PP neinhibuje proliferáciu buniek (obr 1E), čo naznačuje, že A2PP má minimálnu toxicitu pre bunky. EGFR sa podieľa na regulácii ANXA2 fosforylácie [17,25,26], zatiaľ čo A2PP nemal vplyv na fosforylácie alebo úrovne proteínu EGFR a ANXA2 [obr 2A]. Okrem toho, A2PP nemal žiadny vplyv na migráciu AGS a BGC823 buniek (obr 2b a 2c). Bunková lokalizácia ANXA2 je regulovaná jeho fosforylácie, ktorá je rozhodujúca pre jeho funkciu [17,27,28]. Zistili sme, A2PP nezmenil subcelulárnu lokalizáciu endogénneho ANXA2 (obr 2D). Tieto výsledky ukazujú, že A2PP samotná nemá vplyv na malígne fenotyp alebo EGFR-ANXA2 signalizáciu buniek karcinómu žalúdka.

A2PP Pokles M
. hyorhinis
infekcie

Naše predchádzajúce práce ukázali, že N-terminálny ANXA2 sprostredkováva M
. hyorhinis
infekcie [17]. Ako ukazuje výsledok testu buniek ELISA, sme zistili, že M
. hyorhinis
infekcia bola blokovaná A2PP v spôsobom závislým od dávky v BGC823 a AGS buniek, ale coNP-ošetrené bunky boli ešte veľmi infikované M
. hyorhinis
(obr 3A). Tieto výsledky boli podporené qPCR testy (obr 3b). Dôsledne, A2PP tiež znížená hladina proteínovej P37 proteínu vo Western blot analýzy (obr 3C a 3D). Medzitým hladiny phophos-AXNA2 a phophos-EGFR v infikovaných bunkách boli down-regulované pôsobením A2PP (obr 3C a 3E), zatiaľ čo celkové hladiny AXNA2 a EGFR boli relatívne stabilné (obrázok 3C). V imunofluorescenčné analýzy, bolo zistené, že inhibujú A2PP M
. hyorhinis
infekciou vyvolanou akumuláciu P37 a ko-lokalizácia medzi P37 a ANXA2 (obr 4A). V ko-Imunoprecipitácia testu s proteínovými lyzáty zo M
. hyorhinis
infikované bunky, A2PP znížila interakcie medzi P37 a ANXA2 (obr 4B). Dohromady tieto dôkazy podporila myšlienku, že by mohla znížiť A2PP M
. hyorhinis
infekcie a potvrdzuje, že náš predchádzajúci zistenie, že je požadovaná N-terminál ANXA2 pre sprostredkovanie M
. hyorhinis
infekcie [17].

A2PP Potláča M
. hyorhinis
indukovanej migrácie

Naše predchádzajúce štúdie ukázali, že M
. hyorhinis
infekcie by mohla podporiť migráciu buniek karcinómu žalúdka [17, 23]. V tejto štúdii sme zistili, že M
. hyorhinis
-promoted migráciu buniek karcinómu žalúdka nebola ovplyvnená coNP, ale v závislosti na dávke inhibovaný A2PP (obr 5A a 5B). Tieto výsledky naznačujú, že A2PP inhibuje M
. hyorhinis
indukovanej migrácie, ktorá bola spojená s jeho schopnosti znižovať infekcie-podporoval fosforylácie EGFR a ANXA2 (obr 3C a 3E).

A2PP však má podstatnú Motif k zníženiu M
. hyorhinis
infekcie

Ak chcete charakterizovať kritický motív podľa A2PP, sme sa snažili zistiť, či rôznych skrátených peptidov A2PP (obr 6A) by mohol znižuje M
. hyorhinis
infekcie. V analýze qPCR, A2PP a skrátené peptidy A2PP-ND4, ND8, ND12, CD4, CD8 a zníženej Cd12 M
. hyorhinis
infekcie v rakovinových bunkách žalúdka, ale A2PP-Nd16 a A2PP-CD16 sa nepodarilo znížiť M
. hyorhinis
infekcie (obr 6B). Podobný vzor inhibícia bola získaná z Western blot testu (obr 6C). Tieto výsledky naznačujú, že existencia špecifického motívom A2PP je nevyhnutné pre jeho schopnosť znižovať M
. hyorhinis
infekcie. Pre ďalšie zmapovať kľúčové sekvencie tohto možného motívu, sme syntetizované dva peptidy zodpovedajúce 11 ^{-20 th th AA (označované ako A2PP-10A) a 13 -18 th th aa (nazývané ako A2PP-6a a) (obrázok 7A). V qPCR teste, obaja peptidy by mohla znížiť M
. hyorhinis
infekcii (obr 7B), ktorý bol podporovaný Western blot testu (7c). Pozoruhodne, inhibičné účinky A2PP-10A boli lepšie ako u A2PP-6AA, ale účinky oboch peptidov boli menej robustné ako u A2PP (obr 7B a 7C). Thesefore, centrálne sekvencie (11 -20 th th) zo A2PP by mohol byť zásadný motív k potlačeniu M
. hyorhinis
infekcie.}

Porovnanie A2PP s inými liekmi pri prevencii M
. hyorhinis
infekcie

M
. hyorhinis
bol jedným z hlavných zdrojov znečistenia bunkové kultúry [13,14,15]. Najlepším spôsobom, ako eliminovať M
. hyorhinis
infekcie je zlikvidovať bunky a rýchlo sterilizovať všetky kontaktovali cievy, ale niektoré infikované bunky nemohli byť nahradené v niekoľkých prípadoch. V dôsledku toho je nutné používať špecifické antimikrobiálne prístupy na prevenciu alebo elimináciu M
. hyorhinis
infekcie. Tam boli rôzne antimikrobiálnych látok pre prevenciu M
. hyorhinis
od infikovanie. Napríklad Ciprofloxacín (CIP) by mohol odstrániť M
. hyorhinis
primeranej koncentrácie [29]. Dva antimikrobiálne zložky pomenované ako mykoplazem I (MYCO I) a Mycoplasma II (MYCO II) by mohla znížiť M
. hyorhinis
infekcie blokovaním jeho bielkovín a syntézu nukleových kyselín. Avšak, niektoré problémy, ako je nízka citlivosť, silnú odolnosť a vysokú toxicitu môžu obmedziť ich aplikácií v bunkovej kultúre. Na základe týchto úvah, veríme, že je potrebné porovnať efektivitu z A2PP, CIP, MYCO I a II MYCO pri predchádzaní M
. hyorhinis
infekcie. Westernovým prenosom a qPCR testoch sme zistili, že inhibičný účinok A2PP o M
. hyorhinis
infekcia bola podobná ako u MYCO Aj, ale bol lepší ako u CIP a MYCO II (obr 8A a 8B). Zaujímavé je, že sme zistili, že A2PP by tiež mohla účinne eliminovať M
. hyorhinis
infekcie v silne infikovaných buniek v procese pasáží z P _{1 až P 3 (obr 8C a 8D). Navyše, v porovnaní s MYCO I a II MYCO, A2PP mal menší inhibičný účinok na proliferáciu buniek (obrázok 9A). Ak chcete preskúmať mechanizmov A2PP, CIP, MYCO I a efekty myco II je na proliferáciu buniek, sme vykonali analýzu microarray a premietaný podmnožinu odlišne exprimovaných génov v A2PP, CIP, MYCO I a II MYCO liečiť bunky. Kvantitatívna analýza RT-PCR ukázali zvýšenú expresiu génov apoptózy súvisiace s ( ATF5
DDIT3
CEBPB
), ktorú MYCO I a liečbu MYCO II, ale len málo zmien bolo pozorované v A2PP a CIP skupín (obr 9b). Tieto výsledky ukazujú, že A2PP má menšiu toxicitu a lepšie preventívne potenciál v blokovacím M
. hyorhinis
infekcie v kultivovaných bunkách.}

Diskusia

Mycoplasma infekcie a kontaminácie sú stále prevládajúce dnes a priniesť značné riziká pre pacientov a kvality výskumu. V posledných rokoch sa niekoľko štúdií naznačujú, že Mycoplasma infekcie bola tiež spojená s tumorigenezí [3-8]. Mycoplasma infekcia môže spôsobiť poškodenie DNA, ovplyvňujú expresiu génov, a narušiť kontrolného bodu bunkového cyklu a proapoptotický reakcii [30]. M
. hyorhinis
bola nájdená u 56% karcinómov žalúdka, 55,1% karcinómov hrubého čreva a 39,7% karcinómov prsníka tkaniva [20]. Okrem toho, sérologické skúšky ukázali, že 36% benígnej hyperplázie prostaty (BPH) a 52% rakoviny prostaty, tkanivá boli M
. hyorhinis
pozitívne [4]. Tieto štúdie naznačujú možnú súvislosť medzi M
. hyorhinis
infekcie a výskyt nádorov [4,20]. A čo viac, v procese bunkovej kultúry, najčastejšie zdroje znečistenia sú mykoplazmy, baktérie a plesne, ale miera kontaminácie mykoplazmy je relatívne vyššia [13]. Výsledky z rôznych skupín ukázali, že miera znečistenia mykoplazmy sa pohybovala od 15 do 80%, niektoré z nich dokonca dosiahla 100% [15,31]. Analýza sekvencií DNA z 1000 genómov projektu vyplynulo, že 7% vzoriek boli kontaminované mykoplazmami [32]. Avšak, prevenciu Mycoplasma infekcie a kontaminácie je ťažké. Po prvé, vzhľadom k pleomorfní, plasticita, filtrovateľnosť a ľahkej rozpustnosti, mykoplazmy mohla prejsť mikrofiltračný membránou ľahko, takže sú existujú na povrchu hostiteľskej bunky, alebo sa endocytován bunkami [1,13,33]. Po druhé, Mycoplasma postráda bunkovej steny, takže sú necitlivé voči antibiotikám, ktoré inhibujú syntézu bunkovej steny, ako je penicilín. Účinné antimikrobiálne látky existujú, ale ich kontinuálne aplikácie v bunkovej kultúre sa neodporúča kvôli toxicite do buniek. Napokon, Mycoplasma je atypické baktérie, spôsobujúce difficulities v správnej diagnózy [34].

početné anti-Mycoplasma lieky boli vyvinuté, ako je erytromycín, Leucomycin, roxitromycínu ofloxacín, ciprofloxacín. Avšak nepriaznivé účinky, toxicita a odolnosť ešte priniesť problémy pre znižovanie znečistenia [10,11,35-38]. Okrem toho, kontinuálne podávanie týchto antibiotík nemôže úplne vylúčiť Mycoplasma pre viac ako jeden rok alebo dokonca týždňov [39,40]. Preto je dôležité nájsť nové spôsoby, ktoré môžu účinne a včas eliminujú Mycoplasma infekcie alebo znečistenia. Riešením tohto cieľa možno pravdepodobne nájsť prostredníctvom charakteristiky molekulárnych mechanizmov podkladových Mycoplasma infekcie.

Naše predchádzajúce štúdia zistila, že interakcia P37 proteínu s AXNA2 sprostredkované M
. hyorhinis
infekcie [17]. V tejto štúdii sme sa najprv syntetizuje N-terminálny polypeptid ANXA2 (A2PP) a overené ich špecifickú interakciu s GST-P37 proteínu vo viazaní v pevnej fáze a testy streptavidin pull-down. Inšpirovaný také interakcie, sme uvažoval, či A2PP mohol popudiť infekcii M
. hyorhinis
. Zistili sme, že A2PP, vo vhodnej koncentrácii (20 uM), zníženie M
. hyorhinis
infekcie, potlačený infekcie-podporoval migrácie a zníženej infekcie-provokoval fosforylácie EGFR a ANXA2 v rakovinových bunkách žalúdka. Tieto účinky boli spojené so zníženou interakciu medzi P37 a ANXA2. Je potrebné poznamenať, že samotný A2PP vykazovali minimálne účinky na proliferáciu buniek a fosforylácie EGFR a ANXA2, čo naznačuje, že A2PP je pravdepodobné, že bude užitočná činidlá pre zníženie M
. hyorhinis
infekcie. Táto predstava bola podporená porovnaní A2PP a ich účinkov antibiotík komerčných "na proliferáciu buniek a M
. hyorhinis
infekcia, ktorá ukázala, že A2PP naozaj mal menšiu toxicitu na bunky, ale silnou schopnosťou pôsobiť proti infekcii.

Aj cez túto A2PP, 30 aa polypeptidu, by mohla znížiť M
, hyorhinis
infekcie efektívne, stále potrebujeme pochopiť, či skrátené formy A2PP mohol dosiahnuť podobný anti- M
. hyorhinis
schopnosti. Pomocou niekoľkých skrátených peptidov A2PP, sme zistili, že centrálna sekvencie (11 ^{th -20 th) zo A2PP môže byť nevyhnutné motív pre inhibíciu M
. hyorhinis
infekcie. Avšak, inhibičné účinky skrátených peptidov boli ešte nie je tak silný ako v plnej dĺžke A2PP, čo naznačuje, že koncové sekvencie sú nevyhnutné pre udržanie správnej štruktúry na dosiahnutie efektívnej väzba s P37. Ďalšie štúdie sú potrebné k nájdeniu účinky modifikácií a /alebo mutácií tohto motívu na inhibíciu M
. hyorhinis
infekcie}

Poďakovanie

Ďakujeme a vďačnosťou uznať Lin Meng, Dr. Zhihua Tian (všetko od Pekinskej univerzity Cancer Hospital & Institute). Na zabezpečenie kritických činidiel alebo technickú pomoc.

• Ploche ONE: nikotín inhibuje vyvolané cisplatinou apoptózy cez regulačný α5-nAChR /Akt signalizáciu v rakovina žalúdka ľudských bunkách
• Ploche ONE: nízky výskyt synchrónny alebo metachronních nádorov po endoskopickom LIEKU Submukózna Dissection za predčasné rakoviny žalúdka s nediferencovaných histológia