PLOS ONE: un rôle compensatoire de NF-kB p53 en réponse au 5-FU-chimiothérapie à base de lignées cellulaires de cancer gastrique

Résumé

Malgré une amélioration remarquable de la chimiothérapie adjuvante à base de 5-FU-post-opératoire, le taux de patients atteints de cancer gastrique qui subissent une résection curative suivie de la chimiothérapie adjuvante de rechute reste importante. Par conséquent, il est important d'identifier des marqueurs prédictifs de l'efficacité chimiothérapeutique du 5-FU. Nous avons récemment identifié NF-kB comme une prédiction biomarqueur de rechute candidat dans le cancer gastrique. Pour évaluer l'importance biologique de NF-kB dans le cadre d'une chimiothérapie à base de 5-FU, nous avons analysé la réponse biologique NF-kB-dépendant de traitement 5-FU dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. Sept gènes induits par le traitement 5-FU de manière NF-kB-dépendante ont été identifiés, dont cinq sont connus des cibles de la p53. Knockdown de RELA
, qui code pour la sous-unité p65 de NF-kB, une diminution de deux niveaux de protéine cible p53 et p53. En revanche, le NF-kB n'a pas été affectée par TP53
effet de choc. Nous avons également démontré que les lignées cellulaires portant Pro Pro homozygotie /p53 dans codon72 de exon4, ce qui est important pour la liaison de NF-kB p53, sont plus résistantes au 5-FU que ceux qui ont Arg /Arg homozygotie. Nous concluons que le NF-kB joue un rôle important dans la réponse à un traitement 5-FU dans des lignées cellulaires de cancer gastrique, avec une fonction de compensation éventuelle de p53. Ces résultats suggèrent que le NF-kB est un potentiel de 5-FU chimiosensibilité prédiction marqueur qui reflète peut-être les voies de réponse au stress 5-FU-induits, y compris p53

Citation:. Endo F, Nishizuka SS, Kume K, Ishida K, Katagiri H, Ishida K, et al. (2014) Un rôle compensatoire de NF-kB p53 en réponse au 5-FU-chimiothérapie à base de lignées cellulaires de cancer gastrique. PLoS ONE 9 (2): e90155. doi: 10.1371 /journal.pone.0090155

Editeur: Thomas G. Hofmann, allemand Cancer Research Center, Allemagne

Reçu le 17 Octobre 2013; Accepté le 28 Janvier 2014; Publié le 27 Février, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Endo et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenue par Miast (innovation médicale par Advanced science et technologie) projet de Grant-in-Aid Center Strategic science médicale de recherche du Ministère de l'éducation, de la culture, de la science et de la technologie du Japon, 2010-2014 (SSN, K.Ku. GW); et Grant-in-Aid pour la recherche scientifique (C) (11,863,286) (S.S.N.), et (12,877,914) (K.Ko.). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

la majorité du cancer gastrique dans le monde est diagnostiqué en Asie orientale [1], où le traitement standard pour les cancers gastriques avancés reste la chirurgie et la chimiothérapie. Récemment développés chimiothérapies adjuvantes après gastrectomie curative pour le cancer gastrique avancé ont fait des progrès remarquables en termes de contrôle de la survie rechute et sans maladie, en particulier dans la population japonaise [2], [3]. Cependant, 30-40% des patients éprouvent encore une rechute malgré recevant une chimiothérapie après gastrectomie curative [3], ce qui suggère que la sélection des patients sur la base de l'information moléculaire pourrait être très efficace pour augmenter la non-rechute et les taux de survie de chimiothérapie médiée.

pour sélectionner des patients atteints de cancer gastrique qui pourraient bénéficier de la chimiothérapie, il est important de comprendre les sensibilités individuelles avant la chimiothérapie [4]. chimiothérapie adjuvante post-opératoire du cancer gastrique fournit une occasion de tester des tumeurs provenant de patients avant qu'ils ne reçoivent une chimiothérapie. Dans une tentative d'identifier des biomarqueurs potentiels dans ce cadre au niveau de la protéine, nous avons précédemment signalé un système de dépistage du panneau de lignée cellulaire en utilisant l'expression de la protéine quantitative de profilage avec Reverse-Phase réseaux de protéines (RPPAs) [5], [6] combiné avec un Cell- sur la base du système de dosage de croissance basée sur le concept du panneau de contrôle de la lignée cellulaire NCI-60 [7], [8]. Les biomarqueurs candidats ont été isolés sur la base de coefficients de corrélation à partir de l'expression protéique et de la matrice de sensibilité aux médicaments, puis encore validé en utilisant des échantillons chirurgicalement enlevés [9]. Sur la base de cette approche, nous avons identifié deux biomarqueurs au niveau des protéines, y compris NF-kB et JNK, dont les niveaux ont une bonne corrélation avec la réponse chimiothérapeutique. L'expression plus élevé de NF-kB semblait être en corrélation avec un mauvais pronostic, tandis que JNK a montré une corrélation inverse. Ces marqueurs ont également été validés au niveau moléculaire en utilisant des lignées cellulaires de cancer gastro-intestinal. Il a été démontré que le knock-down de l'ARNsi à médiation de p65 affecte presque exclusivement la sensibilité du 5-FU chez des médicaments chimiothérapeutiques actuellement utilisés; mais ce n'est pas le cas pour JNK knockdown [9]. Par conséquent, nous avons conclu que le NF-kB joue un rôle dominant dans le traitement 5-FU et JNK peut être un indicateur de l'inflammation chronique de l'arrière-plan gastrique mucosae [10]. Dans le prolongement de cette étude de validation, nous avons cherché à explorer ces protéines fonctionnellement et de clarifier le rôle du NF-kB en tant que facteur de transcription inductible par un stress pendant le traitement 5-FU. Nous avons également évalué le rôle de p53 transactivation après le 5-FU à médiation par NF-kB [10], [11], car il est bien connu que p53 est activé en réponse à cet agent génotoxique [12]. Dans cette étude, nous présentons un rôle compensatoire potentiel de NF-kB p53 par le biais d'une analyse de p53 NF-kB liaison de site polymorphique, le codon 72 de p53. Ensemble, ces résultats suggèrent que le NF-kB /p53-codon72 pourrait être un biomarqueur robuste pour la sensibilité 5-FU.

lignées cellulaires de Matériels et méthodes

Neuf gastrique humaine des lignées de cellules de cancer, y compris Kato-III, KE39, MKN74, MKN7, NUGC4, GSS, GCIY et MKN45 ont été obtenus à partir de la banque de cellules RIKEN BioResource Center. IWT-1 était un de novo
lignée cellulaire qui a établi dans notre laboratoire d'un patient gastrique mâle japonais du cancer qui avait rechuté péritonite carcinomateuse. L'utilisation de la ligne IWT-1 cellule a été approuvé par le Conseil de l'Université médicale Iwate Institutional Review (H25-116 et HG H25-15) et la famille du patient donneur décédé au moment de l'établissement de la lignée cellulaire avec un le consentement éclairé en ce qui concerne le prélèvement des échantillons et de faire de la lignée cellulaire. Les cellules ont été cultivées à 70-80% de confluence dans un milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) à 37 ° C en présence de 5% de CO _2.

Préparation d'un lysat cellulaire

Les cellules ont été récoltées par centrifugation et culots cellulaires ont été lysées en utilisant un tampon rose contenant 9 M d'urée (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA), 4% 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1 -propanesul-sulfonate (CHAPS; Calbiochem, Merck Millipore, Darmstadt, Allemagne), 2% pH 8,0 à 10,5 pharma-Lyte (GE Healthcare Japon, Tokyo, Japon), et 65 mM de DTT (GE Healthcare Japon, Tokyo, Japon) comme décrit précédemment [5], [13].

Western Blot

SDS-PAGE a été réalisée en utilisant NuPAGE 4-12% électrophorèse Bis-TrisGel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), XCell Sure Lock Mini-cellule (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), et Power PAC HC (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Les protéines résolues sur le gel ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose en utilisant iBlot Dry System blot (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Les membranes résultantes ont été bloquées avec 5% iBlot (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) et 0,1% de Tween-20 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) dans TBS (TBST) pendant 1 h. Les membranes ont été ensuite mis en incubation avec les anticorps primaires indiqués, y compris pan-actine, p53 (Thermo Scientific, Kalamazoo, MI, USA); p21, TIGAR et PUMAα /β (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA); et NF-kB, α-tubuline et PCNA (Cell Signaling Technology du Japon, Tokyo, Japon). Ensuite, les membranes ont été lavées deux fois pendant 5 minutes avec du TBST, mises en incubation avec un anticorps secondaire conjugué à HRP pendant 1 h, puis lavées deux fois pendant 5 minutes dans du TBST. des réactifs de détection de chimioluminescence ont été mises en incubation avec les membranes pendant 1-5 min, puis les images ont été acquises en utilisant l'image Pos LAS500 (GE Healthcare Japon, Tokyo, Japon). Pour évaluer la protéine induction par le 5-FU, western blots ont été quantifiées en utilisant ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).

Immunocytochimie

Les cellules ont été cultivées à 70-80 % de confluence dans un milieu RPMI-1640 complété avec 10% de FBS dans des lames de culture tissulaire traitée de la cuve de polystyrène 4 à chambre de verre et ensuite traitée avec du 5-FU comme indiqué dans chaque expérience. Après que les cellules ont été exposées à 50 pM de 5-FU pendant 4 heures pour voir une réaction de transcription précoce, elles ont été fixées dans 4% de paraformaldehyde, perméabilisées en utilisant 0,2% de Triton X-100 dans du PBS, et colorées avec du DAPI (0,6 pM de DAPI, 50 ul de RNase, et de 5 ml de PBS) à température ambiante pendant 12 min. Les cellules ont ensuite été incubées avec les anticorps primaires suivants: anti-NF-kB p65, phospho-NF-kB p65 (Ser536) et phospho-p53 (Ser15) (Cell Signaling Technology du Japon, Tokyo, Japon) et P53 (Thermo Scientific , Kalamazoo, MI, USA). Finalement, les cellules ont été incubées soit avec Alexa Fluor488- ou d'un anticorps secondaire conjugué à 568 (Life Technologies Japan, Tokyo, Japon). Un BX43 microscope à fluorescence (Olympus, Tokyo, Japon) a été utilisé pour l'acquisition de l'image.

Gene Expression Profiling

MKN45 cellules ont été récoltées après un traitement avec ou sans 50 pM de 5-FU pendant 4 h . ARN a ensuite été extrait des cellules récoltées et profil d'expression génique a été réalisée selon les instructions du fabricant (Sure Imprimer G3 GE8 humain × 60 K, Agilent Technologies Japan, Tokyo, Japon). Les données brutes ont d'abord été normalisées en divisant chaque signal de la sonde par le 75 ^{e percentile de la totalité du signal. Chaque expérience de puces à ADN a été réalisée en double exemplaire, résultant en deux contrôle et deux ensembles de données de puces à ADN 5-FU traitement. Pour identifier les gènes qui ont été exprimés de manière différentielle en réponse au 5-FU, chaque ensemble de données de commande a été comparée séparément à chaque traitement 5-FU fixé (4 comparaisons). gènes différentiellement exprimés étaient ceux qui avaient un changement dans l'expression > 2 fois dans chaque comparaison. Nous avons identifié l'ensemble final de 10 gènes exprimés de manière différentielle en fonction de leur fréquence dans les 4 comparaisons [14]. Pour confirmer la reproductibilité de ces changements d'expression quantitative en temps réel RT-PCR de 5-FU échantillons traités à 0, 4, 8, 12 et 24 heures a été effectuée pour chaque gène. Les séquences des amorces sont listées dans le tableau S1. Pour les gènes induits par le 5-FU, l'analyse des sites de liaison de promoteur a été effectuée en utilisant l'algorithme JASPAR (JASPAR, http://jaspar.genereg.net/). Une séquence promotrice de 1000 pb spécifique aux gènes respectifs a été obtenu à partir de la base de données transcriptionnelle Regulatory Element (http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/tred.cgi?process=home). Les sites de liaison ont été prédites par balayage des séquences de promoteur avec les séquences consensus de NF-kB et p53 avec 70% du seuil de score de profil.}

RELA et

Cellules de TP53 Gene Knockdown ont été cultivées à 70-80 % de confluence dans un milieu RPMI-1640 complété avec 10% de FBS dans des plaques à 6 puits de culture cellulaire et ensuite traitée avec du NF-kB p65 ou p53 ARNsi (Cell Signaling Technology du Japon, Tokyo, Japon) pendant 48 h. En bref, knockdown a été réalisée en utilisant Trans IT-TKO (Mirus Bio Corporation, Madison, WI, USA) à une concentration de 3% pendant 10 min à température ambiante. Les concentrations appropriées d'ARNsi pour chaque lignée cellulaire a été mélangée avec les solutions IT-TKO trans, suivie d'une incubation de 20 min à température ambiante. Les concentrations en siRNA utilisées étaient les suivantes: 100 nM pour l'ARNsi de p65 MKN45 et les cellules MKN74 et 150 nM pour les cellules de l'ESG et Kato-III; et 100 nM p53 siRNA pour MKN45, et les cellules de l'ESG, et 50 nM pour MKN74 cellules. Au bout de 48 h, les cellules ont été récoltées et les niveaux de protéine ont été examinés par Western Blot. Deux constructions siARN possédant des séquences différentes pour le même gène cible a été utilisée pour chaque gène pour confirmer la spécificité effet de choc. la distribution du cycle cellulaire a été évaluée en utilisant le cytomètre à base d'image Tali (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Pour voir l'effet maximum de siRNA sur la réponse de 5-FU, le médicament a été ajouté 48 h après siRNA a été transfecté, et le cycle cellulaire respectif a été mesurée après 24 h d'incubation avec le 5-FU. Toutes les expériences ont été répétées au moins trois fois.

TP53 Statut et Codon72 Variant

ADN a été extrait à partir de lignées cellulaires de cancer gastrique en utilisant QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen Japon, Tokyo, Japon). L'amplification par PCR pour le p53
exon4 codon72 variante (tableau S1) et le p53
mutation exon5-9 a été effectuée comme décrit précédemment [15], [16]. Chaque produit de PCR a été séquence en utilisant l'analyseur génétique ABI PRISM 3030xl (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) selon le protocole du fabricant. Les résultats de séquençage ont été analysées à l'aide FinchTV (PerkinElmer Japon, Tokyo, Japon) et MEGA 5.1 Beta 3 [17].

Croissance Suppression Assay

Dix mille cellules par puits ont été ensemencées dans 96 puits microplaques. Vingt-quatre heures plus tard, les cellules ont été traitées avec le 5-FU pendant 24 h. Après le traitement 5-FU, la fraction de cellules vivantes a été mesurée à l'aide de la cellule de comptage Kit-8 (DOJINDO Technologies moléculaires, Kumamoto, Japon) et un TriStar LB 941 lecteur de microplaques (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Allemagne). Cinquante pour cent de concentration d'inhibition de croissance (GI _{50) a été calculé en utilisant le logiciel Prism (Graph Pad Software, La Jolla, CA, USA). Le GI 50 valeurs ont été utilisées pour déterminer les corrélations entre l'efficacité et taux de protéine 5-FU basé sur le coefficient moment de produit de corrélation de Pearson ( r
).}

Résultats

fluorouracile induit NF-kB

pour confirmer le comportement typique de NF-kB en réponse au traitement 5-FU, nous traça la localisation subcellulaire de NF-kB dans le MKN45 (p53 de type sauvage), MKN74 (p53 mutant ) GSS (p53 mutante) et des lignées de cellules Kato-III (p53 homozygote supprimé). L'analyse par transfert Western avec des fractions nucléaires et cytoplasmiques ont démontré que le 5-FU induit NF-kB dans les deux compartiments dans MKN45, mais n'a pas été observée dans les lignées cellulaires p53 mutantes (Fig. 1A-D). Nous avons également examiné l'effet de 5-FU sur NF-kB localisation dans les cellules par immunocytochimie (Fig. 1E-H). NF-kB localisée dans le cytoplasme non traité MKN45, alors que le 5-FU traitement a provoqué une augmentation du NF-kB localisation nucléaire (figure 1E).; Cependant, aucune augmentation n'a été observée dans les lignées cellulaires mutantes p53 (Fig. 1F-H). Nous avons également observé une augmentation drastique phosphorylée NF-kB (p65 Ser536) dans le noyau de MKN45 traité avec 5-FU, ce qui indique le NF-kB est transactivée par le 5-FU (Fig. 1E). localisation nucléaire Constitutif et la phosphorylation de p53 occasionnelle a été observée dans MKN74 mais ne semblent pas être induite par 5-FU (Fig. 1G). localisation nucléaire de p53 a été induite par 5-FU dans l'ESG, mais le signal activé était faible (Fig. 1 H).

Les cibles de p53 sont induits sur 5-FU Traitement

Depuis NF-kB est un facteur de transcription (TF), sa localisation nucléaire lors d'un traitement 5-FU suggère fortement la transactivation. Nous avons identifié le top 7 des transcriptions parmi plus de 60.000 qui ont été induits après 4 h de traitement 5-FU en MKN45 utilisant l'expression du gène de profilage (tableau 1). Fait intéressant, cinq des 7 transcriptions, à savoir BBC3
(qui code pour p53-régulée modulateur de l'apoptose, PUMA), BTG2, C12orf5
(qui code probable fructose-2,6-bisphosphatase TIGAR), cibles p53 CDKN1A et GPR87
, sont connus [18] - [22]. La présence de sites de liaison de promoteur ont été prédites par balayage des séquences de promoteur avec les séquences consensus de NF-kB et de p53 en utilisant l'algorithme JASPAR (tableau 1) [23].

Nous avons constaté que les niveaux de p53 ont été induits dans le noyau semblable à celles de NF-kB en réponse à la 5-FU traitement (Fig. 1E). Le traitement du 5-FU a également augmenté les niveaux de phosphorylation de p53 à Ser15, ce qui suggère son transactivation (Fig. 1E, réf. [24]). En fait, la majeure partie de p53 totale induite par le 5-FU semble être phosphorylée. Nous avons également observé une induction dépendante du temps de gènes, y compris C12orf5 (TIGAR)
, BBC3 (PUMA)
, CDKN1A (p21)
et BTG2
par le 5-FU en utilisant la RT-PCR (Fig. 1I). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que la réponse cellulaire à un traitement 5-FU peut impliquer à la fois NF-kB et p53 pour l'activation transcriptionnelle dans ce contexte, en MKN45.

RELA Knockdown a un effet plus important sur p53 protéines cibles que TP53 Gene Knockdown

pour évaluer l'effet réglementaire du NF-kB et p53 en réponse au traitement 5-FU, nous avons analysé les niveaux de p65, p53, ainsi que des cibles de p53 connues, p21, TIGAR protéines, et PUMA, par western blot suivant RELA
et TP53 de l'effet de choc dans MKN45, MKN74, GSS et Kato-III. RELA de l'effet de choc provoqué une diminution marquée du taux de p53 dans toutes les lignées cellulaires. Comme attendu, les niveaux de p21, TIGAR, et PUMA ont également diminué (Fig. 2A). A l'inverse, tandis que TP53 de la knockdown diminué p53 niveaux, cela n'a pas affecté les niveaux p65. Comme prévu, les concentrations de protéines cibles p53 ont diminué de TP53
effet de choc; Cependant, cette réduction était inférieure à la réduction causée par RELA
knockdown (Fig. 2B). Dans l'analyse du cycle cellulaire, l'MKN74, l'ESG, et Kato-III lignées cellulaires ont montré une légère augmentation de la fraction de phase S ou G2 alors MKN45 présentait une augmentation de la fraction de G1 après 24 h d'exposition à 5-FU dans le p65 et p53 knockdown similaire aux scrambles correspondantes (Fig. 2C). Ces résultats peuvent indiquer la robustesse du mécanisme de réponse au stress cellulaire qui maintient la distribution du cycle cellulaire malgré le knockdown de p65 et p53.

TP53 Codon72 Pro Expositions Variant Faible 5-FU Sensibilité et des niveaux élevés de NF-kB

gène knock-down résultats expérimentaux indiquent que l'interaction entre le NF-kB et les protéines p53 pourrait être importante dans le contexte du traitement 5-FU. Pour étudier la possibilité que le la variante codon72 de TP53 peuvent affecter les réponses cellulaires au traitement 5-FU, nous avons séquencé TP53
codon72 ainsi que des mutations dans l'ADN domaine de codage des régions (c.-à-exons liaison 8.5) de 9 lignées cellulaires de cancer gastrique (tableau 2). L'état de la variation de codon72 et TP53
mutation n'a pas démontré des associations claires.

Nous avons ensuite étudié l'association entre la sensibilité 5-FU et TP53 de l'état (Fig. 3A ), ainsi que les niveaux endogènes de NF-kB et p53 (Fig. 3B). ESG, GCIY et MKN45 lignes, qui possèdent la variante homozygote Pro, présentent une faible sensibilité au 5-FU, alors que le KE39, MKN74, MKN7, NUGC4 et IWT1 lignes possédant Arg allèle montré une sensibilité relativement élevée. Kato-III, qui a une grande TP53 de la suppression [25], a été le plus sensible au 5-FU. les niveaux de protéine NF-kB ont été particulièrement corrélées avec le 5-FU sensibilité ( r
= 0,68; p
= 0,04;. la figure 3C); cependant, il n'y avait pas de corrélation claire entre les niveaux de p53 et de la sensibilité 5-FU ( r
= -0,04; p
= 0,95;. la figure 3D). Ces résultats suggèrent que Pro homozygotie est associée à la résistance 5-FU, alors que ni mutation p53, ni les niveaux de p53 endogènes affecte directement la sensibilité 5-FU.

Discussion

Nous avons déjà identifié NF-kB comme marqueur de prédiction potentiel de chimiosensibilité à base de 5-FU post-opératoire pour le cancer gastrique avancé [9]. NF-kB est un facteur de transcription inductible composé de p65 (RelA), c-Rel, Rel-B, p50 /NF-κB1 et p52 /NF-κB2 [26], et joue un rôle central dans les réponses immunitaires et cytokine inflammatoire réglementation [27] - [29]. Chang et al précédemment démontré que NF-kB induite par le haut ou une régulation négative des gènes exprimés de manière différentielle dans une mucosite intestinale 5-FU induit par induction de cytokines pro-inflammatoires, comme l'IL-6, le TNF-α, IL-1β [10]. Ces réponses inflammatoires 5-FU induites ont été considérés comme faisant partie du processus de stress qui peuvent conduire éviter une désensibilisation de l'efficacité du 5-FU dans la muqueuse gastrique [30]. Bien qu'il ait été suggéré que l'activation de NF-kB ne soit pas directement liée au développement et à la progression de la tumeur [31], le NF-kB a été considérée comme un marqueur biologique majeur et cible thérapeutique [32]. La preuve directe de la chimiorésistance réduite à 5-FU par siRNA pour RELA
ainsi que le pouvoir discriminant élevé de NF-kB coloration nucléaire dans les résultats thérapeutiques des tissus enlevés chirurgicalement nous a incités à effectuer une validation supplémentaire de NF-kB de un point de vue biologique.

Nos résultats du profilage de la transcription des gènes en aval a révélé que plusieurs p53 étaient régulés à la hausse en réponse à la 5-FU, dans laquelle la transactivation de NF-kB a également eu lieu. Ces deux facteurs de transcription ont été précédemment montré pour être co-régulé en réponse à des agents génotoxiques [33] - [35] et le TNF-α [36], [37]. En outre, il a été proposé que la co-activation de p53 et NF-kB dans les tumeurs traitées avec des agents génotoxiques pourrait conduire à un échec thérapeutique dû à la signalisation de survie NF-kB à médiation [38].

knockdown individuelle des ces facteurs de transcription des gènes en aval de p53 ont révélé p65 ont été affectées par effet de choc, alors que l'effet est limité par p53 knock-down. Des rapports antérieurs ont suggéré une relation de coopération entre p53 et NF-kB dans le cadre de autophagy, l'apoptose et l'activation de la phase S poste de contrôle [34], [39] - [41]. Nos résultats ont également indiqué que le NF-kB peut compenser l'activité transcriptionnelle de p53 intacte lorsque la fonction est perdue en réponse au traitement 5-FU. En effet, la majorité des cancers gastriques portent des mutations dans le domaine de liaison à l'ADN de p53, le rendant ainsi inactif transcriptionnel [42]. Une étude récente de Frank et al
. a rapporté que codon72 polymorphisme TP53
affecter substantiellement la capacité de p53 à coopérer avec le NF-kB pour la transactivation du gène, en particulier dans l'induction de l'apoptose par la caspase 4/11 [40]. Avec la présente constatation qu'une certaine activité transcriptionnelle de p53 nécessite NF-kB en réponse au 5-FU, p53 codon 72 polymorphisme pour sa liaison peut être plus influent que le statut mutationnel de TP53
ou expression de la protéine NF-kB statut de p53

l'impact du polymorphisme codon72 sur le risque de cancer spontané a été précédemment étudié, mais pas établi de façon concluante en raison de la population humaine et animale modèles limités [40], [43] - [45].. Cependant, le polymorphisme codon72 peut jouer un rôle dans le maintien des cellules cancéreuses établies que le déclenchement de transformation maligne cellulaire. En fait, des études antérieures ont rapporté que le Pro /Pro allèle est associée à la résistance à la chimiothérapie et de mauvais pronostic dans la cavité buccale [46], ainsi que colorectal [47], du sein [48] et gastrique [49] cancers et neuroblastomes [ ,,,0],43]. Une série de in vitro
études soutiennent également cette hypothèse montrant que l'allèle Arg est un inducteur d'apoptose plus puissant que l'allèle Pro [40], [50], [51]. L'apoptose est l'un des principaux mécanismes induits par le 5-FU et, par conséquent, il est raisonnable de supposer que l'efficacité d'une chimiothérapie à base de 5-FU est associée à des polymorphismes spécifiques de p53 [49]. Notre in vitro
conclusions soutenir ces données épidémiologiques et expérimentales et de proposer un mécanisme possible pour le 5-FU médiée interaction p53-NF-kB au site de liaison p53-codon72.

Comme prévu notre étude a démontré que les lignées cellulaires avec l'allèle Pro étaient plus résistantes au 5-FU que ceux avec l'allèle Arg. Le profil de la suppression de la croissance de 9 lignées cellulaires de cancer gastrique a montré une bonne corrélation avec les taux de protéine NF-kB. Ces résultats suggèrent que le génotype Arg /Arg a une forte induction de l'apoptose que le génotype Pro Pro /en présence de 5-FU. Parmi les lignées cellulaires (tous provenant de patients atteints d'un cancer gastrique japonais), le rapport de Arg /Arg Arg /Pro: Pro /Pro est 04:01:03, tandis que chez les patients japonais en bonne santé a été 4.5:4.4:1 [52] . Ceci peut refléter un processus de sélection qui se produit au cours du développement de la tumeur et la mise en place en tant que lignée cellulaire. Précédent méta-analyses du risque de cancer et les polymorphismes p53-codon72 suggèrent que le génotype Pro /Pro a un risque plus élevé de cancer (plus faible pour le génotype Arg /Arg) dans les populations asiatiques [45], [53]. Cependant, la signification de «risque de cancer» pour la malignité du cancer ou la réponse au traitement reste à élucider, car il est généralement difficile de mener une étude clinique dominée par les polymorphismes génétiques et d'évaluer les véritables effets génétiques de traitement. À ce jour, la plupart des rapports décrivant une association entre le polymorphisme p53 codon72 et réponses chimiothérapeutiques ont démontré que le génotype Arg /Arg a une réponse favorable dans un large éventail de cancers traités par des médicaments génotoxiques classiques [49], [54], [55] . Nous proposons un mécanisme putatif pour la réponse au 5-FU par l'intermédiaire de NF-kB et la protéine p53 liaison associée au polymorphisme du gène p53, et donc un diagnostic combinatoires de NF-kB expression de la protéine et codon72 peut être un indicateur utile pour la chimiothérapie adjuvante post-opératoire. Mis à part quelques grands ensembles de données à grande échelle [52], [56], dans la mesure des distributions démographiques et ethniques du polymorphisme reste incertaine. Accumulation données sur les différences ethniques pour le polymorphisme peut expliquer les différences dans le risque de cancer ou de taux de réponse chimiothérapeutique dans la population de patients.

En résumé, nos résultats indiquent que le NF-kB régule l'activité p53 de la transcription en réponse au 5-FU, qui peut être associé à un site polymorphique de p53 à codon72. D'autres études cliniques et épidémiologiques devraient évaluer l'utilité de pathologique concomitant /évaluation génétique de NF-kB /p53-codon72 dans des échantillons de cancer gastrique chirurgicalement enlevés afin de prédire l'efficacité du post-opératoire chimiothérapie adjuvante à base de 5-FU.

Informations complémentaires
Tableau S1.
Séquences d'amorces
doi: 10.1371. /journal.pone.0090155.s001
(DOCX)

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