PLOS ONE: en kompensatorisk roll av NF-kB till p53 som svar på 5-FU baserad kemoterapi för Gastric Cancer Cell Lines

Abstrakt

Trots anmärkningsvärd förbättring av postoperativa 5-FU-adjuvant kemoterapi, återfallsfrekvensen av gastric cancerpatienter som genomgår kurativ resektion följt av adjuvant kemoterapi förblir betydande. Därför är det viktigt att identifiera förutsägelse markörer för kemoterapeutiska effekten av 5-FU. Vi identifierade nyligen NF-kB som en kandidat återfall förutsägelse biomarkör i magcancer. För att utvärdera den biologiska signifikansen av NF-kB i samband med 5-FU-baserad kemoterapi, vi analyserat NF-KB-beroende biologisk respons på 5-FU behandling i gastriska cancercellinjer. Sju gener som induceras av 5-FU behandling i en NF-KB-beroende sätt identifierades, varav fem är kända p53 mål. Knockdown av RELA
, som kodar för den p65-subenheten av NF-kB, minskade både p53- och p53-mål-proteinnivåer. Däremot var NF-kB påverkas inte av TP53
knockdown. Vi visade också att cellinjer som bär Pro /Pro homozygositet i codon72 av p53 exon4, vilket är viktigt för NF-KB-bindning till p53, är mer resistenta mot 5-FU än de med Arg /Arg homozygositet. Vi drar slutsatsen att NF-kB spelar en viktig roll i svaret på 5-FU behandling i gastriska cancercellinjer, med en möjlig kompenserande funktionen för p53. Dessa resultat antyder att NF-kB är en potentiell 5-FU-chemosensitivity förutsägelse markör som kan återspegla 5-FU-inducerade stressresponsvägar, inklusive p53

Citation:. Endo F, Nishizuka SS, Kume K, Ishida K, Katagiri H, Ishida K, et al. (2014) en kompensatorisk roll av NF-kB till p53 som svar på 5-FU-kemoterapi för Gastric cancercellinjer. PLoS ONE 9 (2): e90155. doi: 10.1371 /journal.pone.0090155

Redaktör: Thomas G. Hofmann, tyska Cancer Research Center, Tyskland

emottagen: 17 okt 2013; Accepteras: 28 januari 2014. Publicerad: 27 februari 2014

Copyright: © 2014 Endo et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av miast (Medical Innovation av avancerad vetenskap och teknik) projekt av Grant-i-stöd för strategisk Medical Science Research Center från ministeriet för utbildning, kultur, vetenskap och teknik i Japan, 2010-2014 (SSN, K.Ku. GW); och Grant-i-Stöd för vetenskaplig forskning (C) (11.863.286) (S.S.N.), och (12.877.914) (K.Ko.). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Huvuddelen av magcancer i världen diagnostiseras i Östasien [1], där standardbehandling för avancerad magsäckscancer fortfarande kirurgi och kemoterapi. Nyligen utvecklade adjuvanta kemoterapiregimer efter botande gastrektomi för avancerad magsäckscancer har gjort anmärkningsvärda framsteg när det gäller att kontrollera återfall och sjukdomsfri överlevnad, i synnerhet i den japanska befolkningen [2], [3]. Men 30-40% av patienterna fortfarande upplever återfall trots får kemoterapi efter botande gastrektomi [3], vilket tyder på att patienten urval baserat på molekylär information skulle kunna vara mycket effektivt för att öka kemoterapi-medierad icke-återfall och överlevnad.

om du vill välja för gastric cancerpatienter som kan dra nytta av kemoterapi, är det viktigt att förstå enskilda känslighet före kemoterapi [4]. Postoperativ adjuvant kemoterapi av magcancer ger en möjlighet att testa patientgenererade tumörer innan de får kemoterapi. I ett försök att identifiera potentiella biomarkörer i denna inställning på proteinnivå, vi tidigare rapporterat en cellinje panel screening system med kvantitativa proteinuttrycksprofilering med omvänd fas Proteinchip (RPPAs) [5], [6] kombineras med en cell- baserad tillväxt analyssystem baserat på konceptet NCI-60 cellinje screening panel [7], [8]. Kandidat biomarkörer isolerades baserat på korrelationskoefficienter från proteinuttryck och läkemedelskänslighet matris och sedan valideras ytterligare med hjälp av kirurgiskt avlägsnade prover [9]. Baserat på denna strategi vi identifierat två biomarkörer på proteinnivå, inklusive NF-kB och JNK, vars nivåer hade god korrelation med kemoterapeutisk svar. Det högre uttryck av NF-kB föreföll att korrelera med en sämre prognos, medan JNK visade ett omvänt samband. Dessa markörer också valideras på molekylär nivå med hjälp av gastrointestinala cancercellinjer. Det har visat sig att siRNA-medierad knockdown av p65 nästan uteslutande drabbar 5-FU känslighet bland tillfället används kemoterapeutiska läkemedel; men detta är inte fallet för JNK knockdown [9]. Därför drog vi slutsatsen att NF-kB spelar en dominerande roll i 5-FU behandling och JNK kan vara en indikator på kronisk inflammation i mag-bakgrunds slemhinnor [10]. Som en förlängning av detta valideringsstudie försökte vi undersöka dessa proteiner funktionellt och klargöra vilken roll av NF-kB som en stress-inducerbar transkriptionsfaktor under 5-FU behandling. Vi utvärderade också betydelsen av p53 efter 5-FU-medierad transaktivering av NF-kB [10], [11], eftersom det är väl känt att p53 aktiveras som svar på denna genotoxiska medel [12]. I denna studie rapporterar vi en potentiell kompensatorisk roll av NF-kB för p53 genom analys av en p53-NF-KB-bindande polymorfa stället, kodon 72 av p53. Tillsammans antyder dessa upptäckter att NF-kB /p53-codon72 kan vara en robust biomarkör för 5-FU känslighet.

Material och metoder

cellinjer

Nio mänsklig gastric cancercellinjer, inklusive Kato-III, KE39, MKN74, MKN7, NUGC4, GSS, GCIY och MKN45 erhölls från RIKEN Bioresource Center Cell Bank. IWT-1 var en de novo
cellinje som fastställts i vårt laboratorium från en japansk manlig magcancer patient som hade återfall peritonit carcinomatosa. Användningen av IWT-1-cellinjen har godkänts av Iwate Medical University Institutional Review Board (H25-116, och HG H25-15) och familjen av givare patient som dött i samband med upprättandet av cellinje med en skriftligt informerat samtycke med avseende på att ta prover och göra cellinje. Celler odlades till 70-80% konfluens i RPMI-1640 kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) vid 37 ° C i närvaro av 5% CO _2.

Framställning av cellysat

Celler skördades genom centrifugering och cellpelletar lyserades med hjälp av rosa buffert innehållande 9 M urea (Sigma-Aldrich, St Louis, MI, USA), 4% 3 - [(3-cholamidopropyl) dimetylammonio] -1 -propanesul-fonate (CHAPS, Calbiochem, Merck Millipore, Darmstadt, Tyskland), 2% pH 8,0-10,5 pharma-Lyte (GE Healthcare Japan, Tokyo, Japan), och 65 mM DTT (GE Healthcare Japan, Tokyo, Japan) som tidigare beskrivits [5], [13].

Western Blöt

SDS-PAGE utfördes med användning av NuPAGE 4-12% Bis-TrisGel elektrofores (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), XCell Sure Lock Mini-cell (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), och Power PAC HC (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). De upplösta proteiner på gelén överfördes till ett nitrocellulosamembran med användning av iBlot Dry Blotting System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). De resulterande membranen blockerades med 5% iBlot (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) och 0,1% Tween-20 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) i TBS (TBST) under 1 timme. Membraner inkuberades sedan med de indikerade primära antikroppar, inklusive pan-aktin, p53 (Thermo Scientific, Kalamazoo, Ml, USA); p21, TIGAR och PUMAα /β (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA); och NF-kB, α-tubulin, och PCNA (Cell Signaling Technology Japan, Tokyo, Japan). Därefter tvättades membranen två gånger under 5 minuter med TBST, inkuberades med en HRP-konjugerad sekundär antikropp under 1 h, och tvättades sedan två gånger i 5 min i TBST. Kemiluminescens detektionsreagens inkuberades med membranen för 1-5 minuter och sedan bilder förvärvades med Image Quant LAS500 (GE Healthcare Japan, Tokyo, Japan). För att utvärdera protein induktion genom 5-FU, fick western blottar kvantifierades med ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).

Immuncytokemi

Celler odlades till 70-80 % konfluens i RPMI-1640 kompletterat med 10% FBS i 4-kammar polystyren kärlet vävnadskulturbehandlade glasskivor och behandlades därefter med 5-FU såsom anges i varje experiment. Efter det att cellerna exponerades för 50 ^ M av 5-FU under 4 h för att se en tidig transkriptionell svar, de fixerades i 4% paraformaldehyd, permeabiliserades med användning av 0,2% Triton X-100 i PBS, och färgades med DAPI (0,6 | iM DAPI, 50 | j, l RNas, och 5 ml PBS) vid rumstemperatur under 12 min. Cellerna inkuberades sedan med följande primära antikroppar: anti-NF-kB p65, fosfor-NF-kB p65 (Ser536), och fosfor-p53 (Ser15) (Cell Signaling Technology Japan, Tokyo, Japan), och p53 (Thermo Scientific , Kalamazoo, Ml, USA). Slutligen inkuberades cellerna med antingen Alexa Fluor488- eller 568-konjugerad sekundär antikropp (Life Technologies Japan, Tokyo, Japan). En BX43 fluorescerande mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) användes för bildinhämtning.

profilering av genuttryck

MKN45-celler skördades efter behandling med eller utan 50 | iM av 5-FU under 4 h . RNA extraherades sedan från skördade celler och genuttryck profilering utfördes enligt tillverkarens instruktioner (Sure Skriv G3 Human GE8 × 60 K, Agilent Technologies Japan, Tokyo, Japan). Rådata först normaliseras genom att dividera varje sond signalen med 75 ^{e percentilen av hela signalen. Varje mikromatris experiment utfördes i duplikat resulterar i två kontroll och två 5-FU behandling microarray datauppsättningar. För att identifiera gener som differentiellt uttryckta som svar på 5-FU, fick varje styrdata uppsättning jämfört separat till varje 5-FU behandling som (4 jämförelser). Differentiellt uttryckta gener var de som hade en förändring i expression > 2-faldigt i varje jämförelse. Vi identifierade den sista uppsättningen av 10 differentiellt uttryckta gener baserat på deras frekvens i 4 jämförelser [14]. För att bekräfta reproducerbarheten av dessa expressions förändringar, kvantitativ realtids-RT-PCR av 5-FU-behandlade prov vid 0, 4, 8, 12, och 24 h utfördes för varje gen. Primersekvenser är listade i tabell S1. För gener som induceras av 5-FU var analys av promotorbindande ställen utfördes med användning Jaspar algoritm (Jaspar, http://jaspar.genereg.net/). Ett 1000 bp promotorsekvens som är specifik för respektive gener erhölls från transkriptionella regulatoriska element Database (http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/tred.cgi?process=home). Bindningsställen förutsagda genom scanning promotorsekvenser med konsensussekvenserna av NF-kB och p53 med 70% av profilen poäng tröskel.}

RELA och TP53 Gene Knockdown

Celler odlades till 70-80 % konfluens i RPMI-1640 kompletterat med 10% FBS i 6-brunnars cellodlingsplattor och behandlades sedan med NF-kB p65 eller p53 siRNA (cell Signa Technology Japan, Tokyo, Japan) under 48 timmar. I korthet sattes knockdown utfördes med användning av Trans IT-TKO (Mirus Bio Corporation, Madison, WI, USA) vid en koncentration av 3% under 10 minuter vid rumstemperatur. Lämpliga koncentrationer av siRNA för varje cellinje blandades med de trans IT-TKO lösningar följt av en 20 min inkubation vid rumstemperatur. De siRNA koncentrationer som användes var som följer: 100 nM p65 siRNA för MKN45, och MKN74-celler, och 150 nM för GSS och Kato-III-celler; och 100 nM p53 siRNA för MKN45, och GSS-celler, och 50 nM för MKN74 celler. Efter 48 h skördades cellerna och proteinnivåer undersöktes med hjälp av Western blöt. Två siRNA-konstruktioner som har olika sekvenser till samma mål gen användes för varje gen att bekräfta knockdown specificitet. Cellcykelfördelningen bedömdes med användning av Tali bildbaserade flödescytometer (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). För att se den maximala effekten av siRNA på 5-FU svar, till läkemedlet sattes 48 h efter siRNA transfekterades, och respektive cellcykeln mättes efter 24 h inkubation med 5-FU. Alla experiment upprepades åtminstone tre gånger.

TP53 Status och Codon72 Variant

DNA extraherades från gastriska cancercellinjer med användning av QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen Japan, Tokyo, Japan). PCR-förstärkning för p53
exon4 codon72 variant (Tabell S1) och p53
exon5-9 mutation utfördes såsom tidigare beskrivits [15], [16]. Varje PCR-produkt sekvenserades med användning av ABI PRISM 3030xl genetisk analysator (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) enligt tillverkarens protokoll. Sekvenseringsresultaten analyserades med användning FinchTV (PerkinElmer Japan, Tokyo, Japan) och MEGA 5,1 Beta 3 [17].

Tillväxt Suppression Assay

Tio tusen celler per brunn såddes i en 96-brunnars mikroplattan. Tjugofyra timmar senare celler behandlades med 5-FU under 24 h. Efter 5-FU behandlingen bedömdes fraktionen av levande celler mäts med användning av Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan) och en TriStar LB 941 mikroplattläsare (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland). Femtio procent tillväxthämning koncentration (GI _{50) beräknades med användning av Prism programvara (Graph Pad Software, La Jolla, CA, USA). GI 50 värdena användes för att bestämma korrelationer mellan 5-FU effekt och proteinnivåer baserade på Pearson produktmomentkorrelationskoefficient ( r
).}

Resultat

Fluorouracil inducerar NF-kB

för att bekräfta typiska NF-kB beteende som svar på 5-FU behandling, spårade vi subcellulära lokalisering av NF-kB i MKN45 (p53 vild typ), MKN74 (p53-mutant ), GSS (p53-mutant), och Kato-III (p53 homozygot utgår) cellinjer. Western blot-analys med nukleära och cytoplasmiska fraktioner visade att 5-FU-inducerad NF-kB i båda avdelningarna i MKN45 men observerades inte i p53 muterade cellinjer (Fig. 1A-D). Vi undersökte också effekten av 5-FU på NF-KB-lokalisering i cellerna genom immuncytokemi (Fig. 1E-H). NF-kB lokaliserad till cytoplasman i obehandlade MKN45, medan 5-FU behandling orsakade en ökning av NF-kB nukleär lokalisering (Fig 1E.); emellertid observerades ingen ökning observerades i de p53 mutanta cellinjer (Fig. 1F-H). Vi observerade också en drastisk ökning av fosforylerad NF-kB (p65 Ser536) i kärnan av MKN45 behandlades med 5-FU, vilket tyder på NF-kB har transaktiveras av 5-FU (Fig. 1E). Konstitutiv nukleär lokalisering och tillfällig fosforylering av p53 observerades i MKN74 men inte verkar vara induceras av 5-FU (Fig. 1G). Nukleär lokalisering av p53 framkallades av 5-FU i GSS, men den aktiverade signalen var svag (fig. 1 H).

p53 mål induceras på 5-FU behandling

Eftersom NF-kB är en transkriptionsfaktor (TF), antyder dess nukleära lokalisering på 5-FU behandling starkt trans. Vi identifierade de översta 7 utskrifter bland över 60.000 som induceras efter 4 h av 5-FU behandling i MKN45 använder genuttryck profilering (Tabell 1). Intressant, fem av de 7 transkript, nämligen BBC3
(som kodar för p53 uppreglerade modulator av apoptos, PUMA), BTG2, C12orf5
(som kodar sannolikt fruktos-2,6-bisfosfatas TIGAR), CDKN1A och GPR87
, är kända p53 mål [18] - [22]. Närvaron av promotor-bindningsställen förutsades genom scanning promotorsekvenser med konsensussekvenserna av NF-kB och p53 med användning av Jaspar algoritm (tabell 1) [23].

Vi fann att p53 nivåer inducerades i kärnan liknande till de av NF-kB som svar på 5-FU-behandling (Fig. 1E). Behandling av 5-FU ökade också nivåerna av p53 fosforylering vid Ser15, vilket tyder på dess transaktivering (fig. 1E, ref. [24]). I själva verket, verkade de flesta av den totala p53 induceras av 5-FU till fosforyleras. Vi observerade också en tidsberoende induktion av gener, inklusive C12orf5 (TIGAR) Review, BBC3 (PUMA) Review, CDKN1A (p21) Review, och BTG2 Musik av 5-FU med användning av RT-PCR (Fig. 1I). Sammantaget antyder dessa resultat att det cellulära svaret på 5-FU behandling kan innebära både NF-kB och p53 för transkriptionsaktivering i detta sammanhang, i MKN45.

RELA Knockdown har en större effekt på p53 målproteiner än TP53 Gene Knockdown

för att utvärdera den reglerande effekt av NF-kB och p53 som respons på 5-FU behandling, analyserade vi proteinnivåer p65, p53, liksom kända p53 mål, p21, TIGAR, och PUMA, genom western blotting efter RELA Mössor och TP53
knockdown i MKN45, MKN74, GSS, och Kato-III. RELA
knockdown orsakade en markant minskning av p53-nivåer i alla cellinjer. Som väntat, nivåerna av p21, TIGAR och PUMA sjunker också (Fig. 2A). Omvänt, medan TP53
knockdown minskade p53 nivåer, det påverkade inte p65 nivåer. Som väntat var halterna av p53 målproteiner minskade med TP53
knockdown; men denna minskning var mindre än minskningen orsakas av RELA
knockdown (Fig. 2B). I cellcykelanalysen, den MKN74, GSS, och Kato III-cellinjer visade en svag ökning i S eller G2-fasen fraktion medan MKN45 uppvisade en ökning av G1 fraktionen efter 24 h exponering för 5-FU i p65 och p53 knockdown liknar de motsvarande förvränger (Fig. 2C). Dessa resultat kan indikera robustheten i cellulär stress maskiner som upprätthåller cellcykelfördelningen trots knockdown av p65 och p53.

TP53 Codon72 Pro Variant uppvisar låg 5-FU känslighet och hög NF-kB nivåer

Gene knockdown experimentella resultaten indikerade att interaktionen mellan NF-kB och p53-proteiner kan vara viktigt i samband med 5-FU-behandling. För att undersöka möjligheten att TP53
codon72 variant kan påverka cellulära svar på 5-FU behandling, vi sekvens TP53
codon72 liksom mutationer i DNA-bindande domän kodande regioner (dvs exoner 5-8) av 9 gastriska cancercellinjer (tabell 2). Statusen för codon72 variation och TP53
mutation inte visade tydliga associationer.

undersökte vi nästa sambandet mellan 5-FU känslighet och TP53
status (Fig. 3A ) såväl som de endogena nivåerna av NF-kB och p53 (fig. 3B). GSS, GCIY och MKN45 linjer, vilka besitter Pro homozygot variant, uppvisade låg känslighet för 5-FU, medan KE39, MKN74, MKN7, NUGC4 och IWT1 linjer som har Arg-allel uppvisade relativt hög känslighet. Kato-III, som har en stor TP53
radering [25], var den mest känsliga för 5-FU. NF-kB proteinnivåer var särskilt korrelerade med 5-FU känslighet ( r
= 0,68; p
= 0,04; Fig. 3C); men det fanns ingen tydlig korrelation mellan p53 nivåer och 5-FU känslighet ( r
= -0,04; p
= 0,95; Fig. 3D). Dessa resultat tyder på att Pro homozygoti förknippas med 5-FU motstånd, medan varken p53-mutation eller endogena p53 nivåer direkt påverkar 5-FU känslighet.

Diskussion

Vi har tidigare identifierat NF-kB som en potentiell förutsägelse markör för postoperativ 5-FU-baserade chemosensitivity för avancerad magsäckscancer [9]. NF-kB är en inducerbar transkriptionsfaktor bestående av p65 (RelA), c-Rel, Rel-B, p50 /NF-κB1, och p52 /NF-κB2 [26], och spelar en central roll i immunsvar och inflammatoriska cytokinet förordningen [27] - [29]. Chang et al tidigare visat att NF-kB induceras uppåt eller nedreglering av differentiellt uttryckta gener i 5-FU-inducerad tarm mukosit genom inducerande proinflammatoriska cytokiner, såsom IL-6, TNF-α, och IL-1β [10]. Dessa 5-FU-inducerade inflammatoriska svar har ansetts vara en del av stress undvika processer som kan leda till desensibilisering av 5-FU effekt i magslemhinnan [30]. Även om det har föreslagits att aktivering av NF-kB ej är direkt förknippad med tumörutveckling och progression [31], har NF-kB ansetts vara en viktig markör och terapeutiskt mål [32]. Den direkta bevis för minskad chemoresistance till 5-FU genom siRNA för RELA
tillsammans med den höga diskriminerande kraft av NF-kB nukleär färgning i terapeutiska resultat av kirurgiskt avlägsnade vävnader fick oss att utföra ytterligare validering av NF-kB från en biologisk synpunkt.

Våra transkription profilering resultat avslöjade att nedströms gener flera p53 var uppreglerat som svar på 5-FU, i vilket transaktivering av NF-kB också inträffat. Dessa två stora transkriptionsfaktorer har tidigare visat sig vara co-reglerade som svar på genotoxiska agens [33] - [35] och TNF-α [36], [37]. Dessutom har det föreslagits att samtidig aktivering av p53 och NF-kB i tumörer som behandlats med genotoxiska medel skulle kunna leda till terapeutiska fel på grund av NF-KB-medierad överlevnad signalering [38].

Individuell knockdown av dessa transkriptionsfaktorer avslöjade gener nedströms p53 påverkades av p65 knockdown, medan effekten begränsades av p53 knockdown. Tidigare rapporter har föreslagit ett samarbete mellan p53 och NF-kB i samband med autophagy, apoptos, och S-fas checkpoint aktivering [34], [39] - [41]. Våra resultat indikerade också att NF-kB kan kompensera för den transkriptionella aktiviteten hos p53 när den intakta funktionen går förlorad som respons på 5-FU-behandling. Faktum är att en majoritet av magcancer bära mutationer i p53-DNA-bindningsdomänen, vilket sålunda gör det transkriptionellt inaktivt [42]. En färsk studie från Frank et al
. rapporterade att codon72 polymorfism av TP53
väsentligt påverkar möjligheten för p53 att samverka med NF-kB för genen trans, särskilt i induktion av apoptos genom kaspas 4/11 [40]. Tillsammans med den nuvarande upptäckten att vissa transkriptionsaktivitet av p53 kräver NF-kB som svar på 5-FU, p53 kodon 72 polymorfism för dess NF-KB-bindande kan vara mer inflytelserik än mutationsstatus TP53
eller proteinuttryck status av p53

effekten av codon72 polymorfism på spontan cancerrisk har tidigare undersökts men inte fastställt på grund av begränsade mänskliga befolkningen och djurmodeller [40], [43] -. [45]. Emellertid kan codon72 polymorfism spela en roll för att upprätthålla etablerade cancerceller än utlösa cellulära malign transformation. I själva verket har tidigare studier rapporterat att Pro /Pro allelen är associerad med resistens mot kemoterapi och dålig prognos i munhålan [46] samt kolorektal [47], bröst [48] och gastric [49] cancer och neuroblastom [ ,,,0],43]. En serie av In vitro
studier stödjer också denna hypotes visar att Arg-allelen är en mer potent apoptos inducerare än Pro allel [40], [50], [51]. Apoptos är en av de viktigaste mekanismerna som induceras av 5-FU och därför är det rimligt att anta att effekten av 5-FU-baserad kemoterapi är förknippade med specifika p53 polymorfismer [49]. Vår In vitro
resultat stöder dessa epidemiologiska och experimentella data och föreslå en möjlig mekanism för 5-FU-medierad p53-NF-kB interaktion vid p53-codon72 bindningsställe.

Som väntat visade vår studie att cellinjer med Pro-allelen var mer resistenta mot 5-FU än de med Arg-allelen. Tillväxten suppression profil av 9 gastriska cancercellinjer visade en god korrelation till NF-kB-proteinnivåer. Dessa resultat tyder på att Arg /Arg genotypen har en starkare induktion av apoptos än Pro /Pro genotyp i närvaro av 5-FU. Bland de cellinjer (alla härrör från japanska patienter magcancer), förhållandet mellan Arg /Arg: Arg /Pro: Pro /Pro var 04:01:03, medan den hos friska japanska patienter var 4.5:4.4:1 [52] . Detta kan bero på en urvalsprocess som sker under tumörutveckling och etablering som en cellinje. Tidigare metaanalyser i cancerrisk och p53-codon72 polymorfismer tyder på att Pro /Pro genotyp har en högre risk för cancer (lägre för Arg /Arg genotyp) i asiatiska populationer [45], [53]. Förblir emellertid betydelsen av "cancer risk" för cancer malignitet eller behandlingssvar som skall belysas, eftersom det i allmänhet är svårt att genomföra en klinisk studie som domineras av genetisk polymorfism och bedöma den sanna genetiska effekter av behandling. Hittills har de flesta rapporter beskriver ett samband mellan p53 codon72 polymorfism och kemoterapeutiska svar visat att Arg /Arg genotypen har ett positivt svar i ett brett spektrum av cancer som behandlas med konventionella genotoxiska läkemedel [49], [54], [55] . Vi föreslår en förmodad mekanism för reaktion på 5-FU via NF-kB och p53-proteinbindning i samband med p53-polymorfism, och således en kombinations diagnos av NF-KB-proteinexpression och codon72 kan vara en användbar indikator för postoperativ adjuvant kemoterapi. Bortsett från några storskaliga datamängder [52], [56], förblir omfattningen av demografiska och etniska distributioner av polymorfism oklar. Samlar data om etniska skillnader för polymorfism kan förklara skillnaderna i cancerrisk eller kemoterapeutiska svarsfrekvensen i patientgrupp.

Sammanfattningsvis våra resultat tyder på att NF-kB reglerar p53 transkriptionsaktivitet som svar på 5-FU, som kan vara förknippade med en polymorfa stället av p53 vid codon72. Ytterligare kliniska och epidemiologiska studier bör bedöma användbarheten av samtidig patologiska /avelsvärdering av NF-kB /p53-codon72 i kirurgiskt avlägsnade magcancer exemplar för att förutsäga effekten av postoperativ 5-FU-adjuvant kemoterapi.

Bakgrundsinformation
tabell S1.
primersekvenser
doi:. 10,1371 /journal.pone.0090155.s001
(DOCX) Review

• PLOS ONE: Byte av kroppsvikt och Macrophage hämmande cytokin-1 under kemoterapi vid avancerad ventrikelcancer:? Vad är deras kliniska betydelse
• PLOS ONE: The Interaction Effekter av pri-låt-7a-1 rs10739971 med PGC och ERCC6 Gene polymorfismer i Gastric Cancer och atrofisk gastrit