PLoS ONE: компенсаторную роль NF-kB р53 в ответ на 5-ФУ химиотерапии на основе препаратов для рака желудка клетки Lines

Абстрактный
<р> Несмотря на значительное улучшение послеоперационных 5-ФУ на основе адъювантной химиотерапии, частота рецидивов у больных раком желудка, перенесших целебное резекцию с последующим адъювантной химиотерапии остается существенным. Поэтому, важно, чтобы определить маркеры прогнозирования для химиотерапевтического эффективности 5-ФУ. Недавно мы определили NF-kB в качестве биомаркеров прогнозирования кандидат рецидивов при раке желудка. Для оценки биологической значимости NF-kB в контексте 5-ФУ химиотерапии, мы проанализировали NF-kB-зависимую биологическую реакцию после обработки 5-ФУ в желудочном линиях раковых клеток. Семь генов, индуцируемых обработкой 5-ФУ в NF-kB-зависимым образом были идентифицированы, пять из которых известны цели р53. Нокдаун RELA
, который кодирует р65 субъединицы NF-kB, снижение как р53 и р53 уровни белка-мишени. В противоположность этому, NF-kB не была затронута TP53
нокдаун. Мы также показали, что клеточные линии, несущие Pro /Pro гомозиготности в codon72 р53 exon4, что важно для NF-kB связывания с р53, более устойчивы к 5-ФУ, чем те, с Arg /Arg гомозиготности. Мы пришли к выводу, что NF-kB играет важную роль в реакции на лечение 5-ФУ в желудочном линиях раковых клеток, с возможной компенсаторной функции р53. Эти результаты свидетельствуют о том, что NF-kB является потенциальным 5-FU-химиочувствительность предсказания маркер, который может отражать 5-FU-индуцированные пути стресс-реакция, в том числе p53
<р> Образец цитирования:. Эндо F, Nishizuka SS, Kume K, Ishida K, Katagiri H, Ishida K, и др. (2014) компенсаторную роль NF-kB р53 в ответ на 5-ФУ химиотерапии на основе препаратов для рака желудка клеточных линий. PLoS ONE 9 (2): e90155. DOI: 10.1371 /journal.pone.0090155
<р> Редактор: Томас Г. Гофман, немецкий онкологический научный центр, Германия
<р> Поступило: 17 октября 2013 года; Принято: 28 января 2014; Опубликовано: 27 февраля 2014
<р> Copyright: © 2014 Эндо и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа была поддержана MIAST (Medical Innovation по передовой науки и технологии) проекта дотация стратегических медицинских исследований Центра науки Министерства образования, культуры, науки и техники Японии, 2010-2014 годы (ССН, K.Ku. , GW); и дотация для научных исследований (C) (11863286) (S.S.N.) и (12877914) (K.Ko.). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> большинство рака желудка в мире диагностируется в Восточной Азии [1], где стандартная терапия на поздних стадиях рака желудка остается хирургическое вмешательство и химиотерапия. Недавно разработанные адъювантной химиотерапевтических препаратов после лечебной гастрэктомии для поздних стадий рака желудка добились значительного прогресса в плане контроля рецидива и безрецидивной выживаемости, особенно в японской популяции [2], [3]. Тем не менее, 30-40% пациентов все еще испытывают рецидив несмотря на получение химиотерапии после радикального гастрэктомии [3], предполагая, что отбор пациентов на основе молекулярной информации потенциально может быть очень эффективным для повышения химиотерапии опосредованной без рецидивов и выживаемости.
<р> чтобы выбрать для больных раком желудка, которые могли бы принести пользу от химиотерапии, важно понимать индивидуальную чувствительность до химиотерапии [4]. Послеоперационный адъювантной химиотерапии рака желудка дает возможность испытать опухоли пациента, полученных прежде, чем они получают химиотерапию. В попытке идентифицировать потенциальные биомаркеры в этой ситуации на уровне белка, мы ранее сообщали систему скрининга панели линия клеток с использованием количественной экспрессии белка профилирование с обращенной фазой Белковые матрицах (RPPAs) [5], [6] в сочетании с клеточно основанная система анализа роста на основе концепции NCI-60 клеточная линия скрининга панели [7], [8]. Кандидаты в биомаркеры были изолированы основаны на коэффициенты корреляции от экспрессии белка и матрицы чувствительности к лекарственным препаратам, а затем дополнительно подтверждена с помощью хирургически удаленных образцов [9]. На основе этого подхода мы определили два биомаркеров на уровне белка, в том числе NF-kB и JNK, чьи уровни имели хорошую корреляцию с химиотерапевтического ответ. Чем выше экспрессия NF-kB, казалось, коррелирует с неблагоприятным прогнозом, в то время как JNK показали обратную корреляцию. Эти маркеры были также подтверждены на молекулярном уровне с использованием желудочно-кишечные клеточные линии рака предстательной. Было показано, что миРНК-опосредованной нокдаун р65 почти исключительно влияет на чувствительность 5-ФУ среди используемых в настоящее время химиотерапевтических препаратов; но это не относится к JNK нокдаун [9]. Таким образом, мы пришли к выводу, что NF-kB играет доминирующую роль в лечении 5-ФУ и JNK может быть индикатором хронического воспаления желудка фоне слизистых оболочек [10]. В продолжение этого исследования валидации, мы стремились исследовать эти белки функционально и уточнить роль NF-kB как стресс-индуцируемый фактор транскрипции во время лечения 5-ФУ. Мы также оценили роль р53 после 5-FU-опосредованной трансактивации NF-kB [10], [11], так как хорошо известно, что р53 активируется в ответ на этот генотоксическому агента [12]. В этом исследовании мы сообщаем о потенциальной компенсаторную роль NF-kB для р53 с помощью анализа р53-NF-kB связывание полиморфный сайт, кодон 72 р53. В совокупности эти данные позволяют предположить, что NF-kB /p53-codon72 может быть надежным биомаркером чувствительности 5-ФУ.

Материалы и методы

Клеточные линии
<р> Девять человек желудка клеточные линии рака, в том числе Като-III, KE39, MKN74, MKN7, NUGC4, GSS, GCIY и MKN45 были получены из банка клеток RIKEN биоресурсные Center. ИВТ-1 был De Novo
клеточная линия, которая создана в нашей лаборатории из японского мужского желудка больного раком, который рецидивирующей перитонит carcinomatosa. Применение ИВТ-1 клеточной линии была одобрена советом медицинского университета Ивате Institutional Review (H25-116 и HG H25-15) и семье больного донора, который умер во время создания клеточной линии с письменное информированное согласие относительно взятия образцов и делает клеточную линию. Клетки выращивали до 70-80% сплошности в среде RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), при 37 ° С в присутствии 5% CO <суб> 2.

Получение клеточного лизата
<р> Клетки собирали центрифугированием и клеточные осадки лизируют с использованием розового буферного раствора, содержащего 9 М мочевину (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Мичиган, США), 4% 3 - [(3-холамидопропил) диметиламмонио] -1 -propanesul-fonate (CHAPS; Calbiochem, Merck Millipore, Дармштадт, Германия), 2% рН 8.0-10.5 Фарма-Lyte (GE Healthcare Япония, Токио, Япония), и 65 мМ DTT (GE Healthcare Япония, Токио, Япония) ранее описано [5], [13].

вестерн-блот
<р> ДСН-ПААГ проводили с использованием NuPAGE 4-12% Bis-TrisGel электрофорез (Invitrogen, Carlsbad, CA, США), XCell Конечно Блокировка Мини-ячейка (Invitrogen, Carlsbad, CA, США), и мощность РАС HC (Bio-Rad, Hercules, CA, США). Разделенные белки на геле переносили на нитроцеллюлозную мембрану с использованием iBlot системы Dry-блоттинга (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). Полученные мембраны блокировали 5% iBlot (Applied Biosystems, Foster City, CA, США) и 0,1% твин-20 (Bio-Rad, Hercules, CA, США) в TBS (TBST) в течение 1 ч. Мембраны затем инкубировали с указанными первичными антителами, в том числе пан-актина, р53 (Thermo Scientific, Каламазу, Мичиган, США); p21, TIGAR и PUMAα /β (Santa Cruz Biotechnology, Даллас, штат Техас, США); и NF-kB, α-тубулина, и PCNA (Cell Signaling Technology Япония, Токио, Япония). Затем мембраны промывали дважды в течение 5 мин с помощью TBST, инкубируют с конъюгированным с пероксидазой хрена вторичного антитела в течение 1 ч, а затем промывают дважды в течение 5 мин в TBST. реагенты для детекции хемилюминесценции инкубировали с мембранами в течение 1-5 минут, а затем изображения были получены с помощью Image Quant LAS500 (GE Healthcare Япония, Токио, Япония). Для оценки индукции белка на 5-ФУ, западные блоты количественно, используя ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).

Иммуноцитохимическая
<р> Клетки выращивали до 70-80 % конфлуэнтности в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS в 4-камерных ткани полистирола сосуд для культивирования обработанные предметные стекла, а затем обрабатывают 5-FU, как указано в каждом эксперименте. После того, как клетки подвергали воздействию 50 мкМ 5-ФУ в течение 4 ч, чтобы увидеть ранний транскрипционный ответ, они фиксировали в 4% параформальдегид, проницаемыми с помощью 0,2% Тритона Х-100 в PBS и окрашивали DAPI (0,6 мкМ DAPI, 50 мкл РНКазы, и 5 мл PBS), при комнатной температуре в течение 12 мин. Затем клетки инкубировали со следующими первичными антителами: анти-NF-kB р65, фосфо-NF-kB р65 (Ser536) и фосфо-р53 (Ser15) (Cell Signaling Technology Япония, Токио, Япония), и р53 (Thermo Scientific , Каламазу, Мичиган, США). Наконец, клетки инкубировали или с Alexa Fluor488- или 568-конъюгированные вторичные антитела (Life Technologies Япония, Токио, Япония). BX43 флуоресцентного микроскопа (Olympus, Токио, Япония) использовали для получения изображения.

экспрессии генов Профилирование
<р> MKN45 клетки собирали после обработки с добавлением или без 50 мкМ 5-ФУ в течение 4 ч , Затем РНК экстрагировали из собранных клеток и экспрессии генов профилирование проводили в соответствии с инструкциями изготовителя (Sure печати G3 Human GE8 × 60 K, Agilent Technologies Япония, Токио, Япония). Исходные данные впервые были нормированы путем деления каждого сигнала датчика на 75 й процентиль всего сигнала. Каждый микрочипов эксперимент проводили в двух повторах в результате чего два управления и два набора данных микрочипов 5-ФУ лечения. Для того, чтобы идентифицировать гены, которые были дифференцированно выражены в ответ на 5-ФУ, каждый набор данных управления сравнивали по отдельности с каждой обработкой 5-FU комплект (4 сравнения). Дифференциально экспрессируемые гены были те, которые имели изменение в экспрессии &циклопентилпурин 2 раза в каждом сравнении. Мы определили окончательный набор из 10 генов, выраженных по-разному в зависимости от их частоты в 4 сравнений [14]. Для подтверждения воспроизводимости этих изменений экспрессии, количественное в реальном времени ОТ-ПЦР из 5-FU обработанных образцов при 0, 4, 8, 12, и 24 ч проводили для каждого гена. Последовательности праймеров приведены в таблице S1. Для генов, индуцированных 5-ФУ, анализ промоторных участков связывания проводили с использованием алгоритма Джаспер (Джаспер, http://jaspar.genereg.net/). Промотором последовательность 1000 пар оснований специфичные для соответствующих генов была получена из транскрипционный регуляторный элемент базы данных (http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/tred.cgi?process=home). Связующие сайты были предсказаны путем сканирования промоторные последовательности с консенсусной последовательности NF-kB и р53 с 70% порога профиля баллов.

РЕЛА и TP53 нокдаун гена
<р> Клетки выращивали до 70-80 % конфлуэнтности в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS в 6-луночные планшеты для культивирования клеток, а затем обрабатывают с NF-kB р65 или р53 миРНК (Cell Signaling Technology Японии, Токио, Япония) в течение 48 ч. Если коротко, то нокдаун проводили с использованием Trans IT-TKO (MIRUS Bio Corporation, Madison, WI, USA) при концентрации 3% в течение 10 мин при комнатной температуре. Соответствующие концентрации киРНК для каждой линии клеток смешивали с IT-TKO решений Trans, за которыми следует 20 мин инкубации при комнатной температуре. Концентрации миРНК были использованы следующим образом: 100 нМ p65 миРНК для MKN45, а клетки MKN74 и 150 нм для GSS и Като-III клеток; и 100 нМ миРНК для р53 MKN45, и клетки GSS, и 50 нМ для MKN74 клеток. Через 48 часов клетки собирали и уровни белка исследовали с помощью Вестерн-блоттинга. Два миРНК конструкции, обладающие различными последовательностями в той же гена-мишени был использован для каждого гена, чтобы подтвердить специфичность нокдаун. Распределение клеточного цикла оценивали с использованием Тали изображения на основе цитометр (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США). Чтобы увидеть максимальный эффект миРНК на ответ 5-ФУ, препарат был добавлен через 48 ч после миРНК трансфектировалась, и соответствующий клеточный цикл измеряли через 24 ч инкубации с 5-ФУ. Все эксперименты повторяли по меньшей мере три раза.

TP53 Статус и Codon72 Вариант
<р> ДНК экстрагировали из желудка линий раковых клеток с использованием QIAmp ДНК Mini Kit (Qiagen Японии, Токио, Япония). ПЦР-амплификации для была выполнена p53
exon4 codon72 вариант (таблица S1) и p53
exon5-9 мутации, как описано ранее [15], [16]. Каждый продукт ПЦР секвенировали с использованием генетического анализатора ABI PRISM 3030xl (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) в соответствии с протоколом производителя. Результаты секвенирования были проанализированы с использованием FinchTV (PerkinElmer Япония, Токио, Япония) и MEGA 5.1 Beta 3 [17].

Рост Подавление анализа
<р> Десять тысяч клеток на лунку высевали в 96-луночный микропланшет. Через двадцать четыре часа спустя клетки обрабатывали 5-ФУ в течение 24 ч. После обработки 5-ФУ, доля живых клеток измеряли с использованием Cell счетная Kit-8 (DOJINDO Молекулярные технологии, Кумамото, Япония) и TriStar LB 941 микропланшет-ридера (Berthold Technologies, Бад-Вильдбад, Германия). Пятьдесят процентов концентрация ингибирования роста (GI <суб> 50) была рассчитана с использованием программного обеспечения Prism (Graph Pad Software, La Jolla, CA, USA). GI <суб> 50 значения были использованы для определения корреляции между эффективностью и белковыми уровнями 5-ФУ на основе коэффициента продукта момента корреляции Пирсона ( г
).

Результаты

Fluorouracil Индуцирует NF-kB
<р> Чтобы подтвердить типичное поведение NF-kB в ответ на лечение 5-ФУ, мы проследили внутриклеточную локализацию NF-kB в MKN45 (p53 дикого типа), MKN74 (мутант р53 ), GSS (мутант р53), и Като-III (p53 гомозиготно удалена) клеточные линии. Вестерн-блоттинга с ядерными и цитоплазматическими фракций показали, что 5-ФУ индуцированной NF-kB в обоих отсеках MKN45 но не наблюдалась в мутант р53 клеточных линий (фиг. 1A-D). Мы также исследовали влияние 5-ФУ по локализации NF-kB в клетках с помощью иммуногистохимии (рис. 1E-H). NF-kB локализован в цитоплазме в необработанном MKN45, в то время как 5-ФУ лечение привело к увеличению NF-кВ ядерной локализации (рис 1E.); Тем не менее, увеличение не наблюдалось в клеточных линиях мутант р53 (рис. 1F-H). Мы также наблюдали резкое увеличение фосфорилированного NF-kB (p65 Ser536) в ядре MKN45 обработанной 5-FU, указывая NF-kB была трансактивируется на 5-ФУ (рис. 1д). Конститутивная ядерной локализации и иногда фосфорилирование р53 наблюдалась в MKN74 но, похоже, не индуцируется 5-ФУ (рис. 1Г). Ядерная локализация р53 индуцируют 5-ФУ в ГСС, но активированный сигнал был слабый (рис. 1 H).

p53 Цели индуцируется при 5-ФУ лечения

Так как NF-kB является фактором транскрипции (TF), его ядерная локализация при лечении 5-ФУ сильно предлагает трансактивация. Мы определили 7 лучших транскриптов среди более чем 60 000, которые были вызваны через 4 ч лечения 5-ФУ в MKN45 с использованием экспрессии гена профилирующих (таблица 1). Интересно отметить, что пять из 7 транскриптов, а именно BBC3
(который кодирует p53 повышающей регуляции модулятора апоптоза, PUMA), btg2, C12orf5
(который кодирует вероятный фруктозо-2,6-бифосфатазы TIGAR), CDKN1A и GPR87
, известны цели р53 [18] - [22]. Присутствие промотора участков связывания были предсказаны путем сканирования промоторные последовательности с консенсусной последовательности NF-kB и р53 с использованием алгоритма (табл Джаспер 1) [23].
<Р> Мы обнаружили, что уровень р53 индуцированный в ядре аналогичной таковым NF-kB в ответ на 5-FU обработки (рис. 1д). Лечение 5-ФУ также повышал уровень p53 фосфорилирования по Ser15, предполагая его трансактивационную (рис. 1E, реф. [24]). На самом деле, большинство общей р53, индуцированной 5-ФУ, казалось, фосфорилируется. Мы также наблюдали зависимое от времени индукции генов, в том числе C12orf5 (TIGAR)
, BBC3 (PUMA)
, CDKN1A (p21)
и btg2 Ру по 5-ФУ с использованием оТ-ПЦР (рис. 1I). Взятые вместе, эти результаты свидетельствуют о том, что клеточный ответ на лечение 5-ФУ может включать в себя как NF-kB и р53 для активации транскрипции в этом контексте, в MKN45.

РЕЛА Нокдаун имеет большее влияние на р53 белки-мишени, чем TP53 нокдаун гена
<р> Для того, чтобы оценить регуляторную эффект NF-kB и р53 в ответ на лечение 5-ФУ, мы проанализировали уровни протеина p65, p53, а также известных мишеней p53, p21, TIGAR, и PUMA, с помощью Вестерн-блоттинга следующим RELA
и TP53
нокдаун в MKN45, MKN74, ГСС и Като-III. Рела
нокдаун вызвало заметное снижение уровней p53 в клеточных линиях. Как и ожидалось, уровни р21, TIGAR, и PUMA также снижались (рис. 2, а). С другой стороны, в то время как TP53
нокдаун снизились уровни p53, это не повлияло на P65 уровни. Как и ожидалось, уровни р53 белков-мишеней были снижены на TP53
нокдаун; Тем не менее, это снижение было меньше, чем снижение, вызванное <ЕМ> РЕЛА
нокдаун (рис. 2В). При анализе клеточного цикла, MKN74, GSS, и Като-III клеточные линии показали незначительное увеличение фазовой фракции S или G2, тогда как MKN45 наблюдалось увеличение в G1 фракции после 24 часов экспозиции 5-ФУ в p65 и p53 нокдаун аналогичны соответствующим карабкается (рис. 2в). Эти результаты могут свидетельствовать о надежности механизма реакции клеточного стресса, который поддерживает распределение клеточного цикла, несмотря на нокдаун р65 и р53.

TP53 Codon72 Pro Variant Экспонаты Низкая 5-FU Чувствительность и высокий NF-kB Уровни <бр> <р> нокдаун гена экспериментальные результаты показали, что взаимодействие между NF-kB и p53 белков может иметь важное значение в контексте лечения 5-ФУ. Для того, чтобы исследовать возможность того, что TP53
вариант codon72 может повлиять на клеточные реакции на лечение 5-ФУ, мы секвенировали TP53
codon72, а также мутации в ДНК-связывающий домен кодирующих областей (т.е. экзоны 5-8) из 9 желудочных линий раковых клеток (таблица 2). Статус изменения codon72 и TP53
мутации не демонстрируют четких ассоциаций.
<Р> Затем мы исследовали связь между чувствительностью 5-ФУ и TP53
состояния (рис. 3А ), а также эндогенные уровни NF-kB и p53 (фиг. 3б). GSS, GCIY и MKN45 линии, которые обладают Pro гомозиготный вариант, выставленная низкую чувствительность к 5-ФУ, в то время как KE39, MKN74, MKN7, NUGC4 и IWT1 линий, обладающих Arg аллель выставлялась относительно высокая чувствительность. Като-III, который имеет большой TP53
удаление [25], был самым чувствительным к 5-ФУ. уровни белка NF-kB были особенно коррелируют с 5-ФУ чувствительность ( г
= 0,68; р
= 0,04;. фиг.3С); Тем не менее, не было четкой корреляции между уровнями p53 и чувствительностью 5-ФУ ( г
= -0,04; р
= 0,95;. Рис 3D). Эти результаты свидетельствуют о том, что Pro гомозиготность связано с сопротивлением 5-ФУ, в то время как ни мутации р53, ни эндогенные уровни p53 напрямую влияет на чувствительность 5-ФУ.

Обсуждение
<р> Ранее мы идентифицировали NF-kB в качестве потенциального маркера для предсказания послеоперационной 5-ФУ на основе химиочувствительность для поздних стадий рака желудка [9]. NF-kB является индуцируемый фактор транскрипции, состоящий из р65 (RelA), C-Rel, отн-Б, P50 /NF-κB1, и P52 /NF-κB2 [26], и играет центральную роль в иммунных реакций и воспалительных цитокинов регулирование [27] - [29]. Чанг и др ранее показано, что NF-kB индуцируется вверх или вниз, регулирование дифференцированно экспрессируемых генов в 5-ФУ-индуцированных кишечных мукозитом индуцируя провоспалительных цитокинов, таких как IL-6, TNF-a и IL-1 [10]. Эти 5-ФУ-индуцированные воспалительные реакции были рассмотрены, чтобы быть частью процессов стресс-избегая, которые могут привести к десенсибилизации 5-FU эффективности в слизистой оболочке желудка [30]. Несмотря на то, было высказано предположение, что активация NF-kB не связан непосредственно с развитием и прогрессии опухоли [31], NF-kB рассматривалась как главный биомаркер и терапевтическую мишень [32]. Прямым доказательством восстановленного химиорезистентности 5-ФУ с помощью миРНК для РЕЛА
вместе с высокой дискриминационного силой NF-kB ядерного окрашивания в терапевтических результатов хирургическим путем удаленных тканей побудили нас выполнить дальнейшую проверку NF-kB из биологической точки зрения.
<р> Наши транскрипционные профилирование результаты показали, что гены нескольких р53 вниз по течению были повышающей регуляции в ответ на 5-ФУ, в котором трансактивации NF-kB также имели место. Эти два основных фактора транскрипции, ранее было показано, что совместно регулируется в ответ на генотоксическими агентов [33] - [35] и ФНО-α [36], [37]. Кроме того, было высказано предположение, что совместное активацию р53 и NF-kB в опухолях, обработанных генотоксическими агентов может привести к терапевтическому отказа из-за NF-kB-опосредованной сигнализации выживания [38].
<Р> Индивидуальный нокдаун эти факторы транскрипции, выявленные гены вниз по течению р53 были затронуты p65 нокдауна, в то время как эффект был ограничен р53 нокдаун. Предыдущие доклады предложили отношения сотрудничества между р53 и NF-kB в контексте аутофагии, апоптоза и активации S-фазы контрольной точки [34], [39] - [41]. Наши результаты также показали, что NF-kB может компенсировать транскрипционной активности р53 при неповрежденной функция теряется в ответ на лечение 5-ФУ. На самом деле, большинство рака желудка несут мутации в связывающем домене р53 ДНК, таким образом, что делает его транскрипционно неактивный [42]. Недавнее исследование, проведенное Frank и др
. сообщили, что codon72 полиморфизм ТР53
существенно влияет на способность р53 сотрудничать с NF-kB для гена трансактивации, в частности, при индукции апоптоза через каспаза 4/11 [40]. Вместе с настоящей находкой, что некоторые транскрипционной активности р53 требуют NF-kB в ответ на 5-ФУ, p53 кодон 72 полиморфизма для его NF-kB связывания может быть более влиятельным, чем мутационный статус
или белка выражения TP53 статус p53
<р> влияние codon72 полиморфизма на спонтанном риск развития рака был ранее исследован, но окончательно не установлено из-за ограниченных моделей популяций человека и животных [40], [43] - [45].. Тем не менее, codon72 полиморфизм может играть определенную роль в поддержании установленных раковых клеток, чем вызывая клеточную злокачественную трансформацию. На самом деле, предыдущие исследования сообщили, что Pro /Pro аллеля связано с устойчивостью к химиотерапии и неблагоприятным прогнозом в полости рта [46], а также толстой и прямой кишки [47], молочной железы [48] и желудка [49] раки и нейробластомы [ ,,,0],43]. Серия в пробирке
исследований также подтверждают эту гипотезу, показывая, что аллель Arg является более мощным индуктором апоптоза, чем Pro аллеля [40], [50], [51]. Апоптоз является одним из основных механизмов, вызванных 5-FU и, таким образом, разумно предположить, что эффективность 5-ФУ химиотерапии ассоциируется с конкретными полиморфизмов р53 [49]. Наш в пробирке
данные подтверждают эти эпидемиологические и экспериментальные данные и предложить возможный механизм 5-FU-опосредованного взаимодействия р53-NF-kB на участке связывания р53-codon72.
<Р> Как и следовало ожидать наше исследование показало, что клеточные линии с Pro аллеля были более устойчивы к 5-ФУ, чем с аллелем Arg. Профиль подавления роста 9 желудочных линий раковых клеток показали хорошую корреляцию с уровнем белка NF-kB. Эти результаты свидетельствуют о том, что генотип Arg /Arg, имеет более сильную индукцию апоптоза, чем Pro /Pro генотип в присутствии 5-фторурацила. Среди клеточных линий (все получены от японских пациентов с раком желудка), отношение Arg /Arg: Арг /Pro: Pro /Pro был 4:01:03, в то время как у здоровых японских пациентов была 4.5:4.4:1 [52] , Это может отражать процесс отбора, который происходит во время развития опухоли и создания в качестве клеточной линии. Предыдущий мета-анализ риска развития рака и полиморфизмов р53-codon72 позволяют предположить, что Pro /Pro генотип имеет более высокий риск развития рака (ниже для генотипа Arg /Arg) в азиатских популяциях [45], [53]. Тем не менее, значение «риска рака» для злокачественной опухоли рака или ответа на лечение еще предстоит выяснить, потому что, как правило, трудно провести клиническое исследование, преобладали генетических полиморфизмов и оценить истинные генетические эффекты лечения. На сегодняшний день большинство сообщений, описывающих связь между р53 codon72 полиморфизма и химиотерапевтических реакций показали, что генотип Arg /Arg имеет благоприятный отклик в широком диапазоне видов рака, обработанных обычными генотоксическими препаратами [49], [54], [55] , Предложен предполагаемый механизм реакции на 5-ФУ через NF-kB и p53 белка связывание связано с p53 полиморфизм, и, таким образом, комбинационная диагноз экспрессии белка NF-kB и codon72 может быть полезным индикатором для послеоперационной адъювантной химиотерапии. За исключением нескольких крупных наборов данных [52], [56], степень демографическими и этнических распределений полиморфизма остается неясным. Накопленные данные об этнических различий для полиморфизма может объяснить различия в риске рака или химиотерапевтического скорости реакции в популяции пациентов.
<Р> Таким образом, наши результаты показывают, что NF-kB регулирует p53 транскрипционной активности в ответ на 5-ФУ, который может быть связан с полиморфным сайта р53 в codon72. Дальнейшие клинические и эпидемиологические исследования должны оценить полезность сопутствующей патологией /генетической оценки NF-kB /p53-codon72 в хирургически удаленных желудка образцов рака, чтобы предсказать эффективность послеоперационной 5-ФУ на основе адъювантной химиотерапии. <Бр>

поддержка Информация
таблице S1.
праймеров
DOI: 10.1371. /journal.pone.0090155.s001
(DOCX)

• PLoS ONE: Изменение веса тела и макрофагов ингибирующей цитокин-1 во время химиотерапии рака желудка Advanced: Что так…
• PLoS ONE: Взаимодействие Эффекты ИРП-пусть-7а-1 rs10739971 с PGC и ERCC6 генных полиморфизмов рака желудка и атрофический га…