PLOS ONE: A Novel Proteomics-Based Clinical Diagnostics identifie la technologie Hétérogénéité dans les voies de signalisation activées dans gastrique Cancers

Résumé

Objet

Le but de cette étude était d'utiliser la collaboration basée sur la protéomique enzyme réactif (CEER) immunologique amélioré pour étudier phosphorylations protéines tyrosine en tant que marqueurs de diagnostic dans les cancers gastriques (GCS).

les lysats de protéines expérimentale conception de 434 GCS stade avancé fraîchement congelés ont été analysés pour la phosphorylation de HER1, HER2, p95HER2, HER3, ÉÉGC, IGF1R et PI3K. Les modèles d'activation de la voie ont été séparés en fonction de la tumeur statut HER2. classification hiérarchique a été utilisée pour déterminer coactivations de la voie en glucocorticoïdes. Valeur pronostique des modèles d'activation de la voie a été déterminée en mettant en corrélation les temps des différents sous-groupes de GC à l'aide de Kaplan-Meier analyse de survie survie sans maladie. CEER a également été utilisé pour déterminer la présence de la tyrosine phosphorylée cascades de signalisation dans les cellules tumorales circulantes (CTC) et les cellules ascites tumorales (ATC).

En utilisant un dosage immunologique nouveaux de diagnostic, CEER de

Résultats, nous démontrer la présence de p95HER2 et les voies de signalisation activées en même temps que dans des tissus tumoraux GC, et CTC ATC isolés à partir de patients atteints de GC pour la première fois. p95HER2 est exprimé en ~77% de HER2 (+) GCS. Environ 54% des glucocorticoïdes ont un actif HER1, HER2, HER3, ÉÉGC ou IGF1R et démontrent un moins bon pronostic que ceux où ces tyrosine kinases de récepteur (RTK) ne sont pas activées. classification hiérarchique des RTK révèle co-regroupement des HER1 phosphorylée: ÉÉGC, HER2: HER3 et IGF1R-PI3K. Coactivation de HER1 avec ÉÉGC rend GCS avec une survie sans maladie plus courte comparativement à seulement ÉÉGC activé GCS.

Conclusions

Notre étude met en évidence l'utilité d'une technologie de diagnostic compagnon roman, CEER qui a de fortes implications pour le développement de médicaments et le suivi thérapeutique. CEER est utilisé pour fournir une meilleure compréhension des voies de signalisation activées dans GCS avancées qui peuvent améliorer considérablement leur prise en charge clinique grâce à une sélection précise des patients pour les thérapies ciblées

Citation:. Lee J, Kim S, Kim P, Liu X, Lee T, Kim KM, et al. (2013) A Novel Proteomics-Based Clinical Diagnostics Technology Identifie Hétérogénéité dans les voies de signalisation activées dans les cancers gastriques. PLoS ONE 8 (1): e54644. doi: 10.1371 /journal.pone.0054644

Editeur: Anthony W. I. Lo, l'Université chinoise de Hong Kong, Hong Kong

Reçu 20 Septembre 2012; Accepté le 13 Décembre 2012; Publié le 25 Janvier, 2013 |

Droit d'auteur: © 2013 Lee et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Les auteurs ont pas de soutien ou de financement pour signaler

intérêts concurrents:. Alors que PK, XL, TL, NH, GH, AK, AJ, GM, GL et SS sont employés par Prometheus Laboratories, cela ne modifie pas les auteurs le respect de toutes les PLOS ONE politiques sur les données et les matériaux de partage.

introduction

agents Moléculairement ciblés ont accéléré le domaine de l'oncologie. Étant donné que la moitié environ de la composante de la tyrosine kinase du kinome humain est impliquée dans les cancers humains, il est surprenant qu'une grande proportion des agents thérapeutiques actuels visent diverses kinases [1], [2]. Co-activation des tyrosine kinases de récepteur (RTK) a été observée dans les sous-ensembles de multiples cancers tels que le glioblastome [3], le cancer du sein [2], [4], [5], [6], [7], le cancer du poumon [8 ], [9], la tête et du cou [7] et le cancer gastrique [4], [5], [6] impliquant donc comme nécessaire à la progression tumorale et la survie. Ces observations fournissent justification clinique suffisante pour le criblage de RTK activés dans les cancers qui pourraient alors guider le ciblage thérapeutique et fournir des connaissances pour les stratégies thérapeutiques combinatoires rationnelles potentiellement. Cependant, une simple analyse de l'expression ou de l'activation d'un seul état TKP qui peut être la protéine cible spécifique pour une thérapeutique particulière est insuffisante pour la sélection des patients parce que souvent les patients ne répondent pas à des thérapies en dépit de l'expression de la cible. Plusieurs problèmes potentiels pourraient être responsables d'un tel manque de bénéfice thérapeutique d'agents ciblés, par exemple, 1) activation concomitante des voies parallèles ou alternatives qui contournent la protéine (s) à l'origine ciblée, et 2) la modification continue des caractéristiques moléculaires et pathologiques de néoplasique les tissus au cours de la progression du cancer. Par conséquent, il serait idéal d'avoir un outil de diagnostic compagnon qui pourrait être appliquée sur des quantités limitées d'échantillons cliniques pour saisir la complexité globale des réseaux de signalisation phosphorylés dans le tissu néoplasique en plus de la cible directe de la protéine RTK pour surveiller la maladie "évolution" .

ciblée l'analyse de la phosphorylation des échantillons cliniques a été entravée en raison de l'absence d'essais cliniques facilement utilisables qui sont suffisamment sensibles pour fonctionner sur des quantités limitées de tissus cliniques. Nous avons précédemment rapporté le développement d'un nouveau dosage immunologique axée sur la proximité, Collaborative Enzyme Reactive-immunologique amélioré (CEER; Figure S1) [6], qui est adapté à l'analyse à la fois l'expression totale et le statut d'activation de la signalisation des protéines cascades. ECOR peut être effectuée de façon multiplexée directement sur des échantillons cliniques qui peuvent être disponibles en quantités limitées. Le dosage de l'ECOR utilise la formation d'un immuno-complexe qui nécessite la co-localisation de deux détecteurs conjugué à une enzyme-anticorps une fois que les protéines cibles ont été capturés sur un micro-réseau unique. Ce format permet la détection efficace et sensible des RTK, ainsi que des protéines de la voie en aval jusqu'au niveau de la cellule unique (une sensibilité d'environ 100 zeptomoles). Dans cette étude, nous avons utilisé le test de CEER pour étudier la complexité de la voie de signalisation dans les cancers gastriques (GC).

GCS sont la principale cause de décès par cancer dans le monde avec une incidence de 18,9 /100 000 cas par an et un taux de mortalité taux de 14,7 /100.000 par an [10] et sont la tumeur maligne la plus courante en Corée [11]. Métastases GC reste un défi thérapeutique pour les oncologues médicaux en raison de son mauvais pronostic. À l'heure actuelle, le trastuzumab est le seul agent ciblé actif qui a prouvé être efficace pour GC dans un essai de phase III randomisée [12]. Bien que l'activation de plusieurs RTK a été rapportée dans GCS, leur impact sur le pronostic GC est inconnue. Ceci est important pour le développement et l'application de produits thérapeutiques pour la prise en charge clinique des glucocorticoïdes.

Dans cette étude, nous avons utilisé la plate-forme de CEER multiplexé pour déterminer les niveaux de RTK activés (HER1, HER2, variantes tronquées de HER2, à-dire, p95HER2, HER3, ÉÉGC, PI3K et IGF1R) dans 434 tissus GC frais congelé et a tenté de classer les patients du GC en sous-groupes potentiels en fonction de leurs modèles d'activation de la voie de la protéine. Nous avons observé plusieurs activations de protéines de signal dans les sous-groupes de tumeurs du GC qui sont en corrélation avec la survie sans maladie (DFS) chez ces patients. Par conséquent, nous supposons que les entrées d'activation de la voie redondante pourrait conduire à la signalisation en aval résiduel dans GCS, limitant ainsi l'efficacité anti-tumorale des monothérapies ciblées contre les RTK simples. Enfin, nous avons mis au point une méthode potentiellement puissant qui peut permettre aux cliniciens de surveiller de référence et l'évolution des changements dans les profils d'activation TKP tumorales au cours d'un traitement utilisant des cellules circulantes tumorales (CTC) et des cellules malignes isolées à partir du liquide péritonéal (cellules de tumeur ascitique ou ATCs ). Pris ensemble, notre étude fournit des preuves pour l'activation RTK concomitante GC tissus humains en plus établir CEER comme un outil clinique efficace pour diagnostiquer et surveiller l'activation RTK pendant le traitement par GC ou de la progression de la maladie.

Patient cohorte et Specimen Tissue Procurement

l'étude a été réalisée après approbation du Centre de Conseil institutionnel d'examen médical Samsung (SMC IRB) de levée de consentement éclairé en utilisant des tissus d'archives avec des données cliniques rétrospectives. Les échantillons de tumeurs primaires ont tous été recueillies auprès de Samsung Medical Center. Tous les patients ont subi une gastrectomie avec radicale dissection des ganglions lymphatiques à visée curative. De Mars 2001 à Février 2005, 447 tissus frais congelés obtenus à partir de 434 patients ont été recueillies à partir de tumeurs gastriques primaires réséquées chirurgicalement et étaient disponibles pour l'analyse finale. Tous les tissus frais congelés ont été collectés (dans les < 30 minutes) dans le champ chirurgical et ont été immédiatement congelés rapidement et stockés dans de l'azote liquide jusqu'à une utilisation ultérieure. des échantillons de tumeurs ont été confirmées par la présence de > zone tumorale de 70% par le pathologiste. Pour l'analyse, de petits morceaux de tissus congelés (10 um section X 3) ont été préparés en utilisant une lame de rasoir prérefroidi et lysées dans 100 ul de tampon de lyse. Les lysats résultants ont été stockés à -80 ° C jusqu'à l'analyse subséquente

histopathologie Examen et détermination du statut HER2

Tous les H &disponibles;. Diapositives E-colorées ont été examinées au niveau central par deux pathologistes (ID, KKM ) au cœur de la pathologie expérimentale de l'Institut de recherche sur le cancer Samsung. Tous les échantillons de tumeurs étaient des tumeurs gastriques primaires réséquées chirurgicalement. le statut HER2 a été déterminé par IHC et FISH. l'analyse IHC a été réalisée en utilisant le HercepTest ™ (Dako, Glostrup, Danemark). HER2 niveaux d'expression de protéines ont été notés comme 0 à 3+, selon les recommandations du panel de consensus sur HER2 score pour GC [13], [14]. Pour FISH, kit de sonde PathVysion HER2 ADN (Abbott, Des Plaines, IL) a été utilisé. Ariol système d'analyse d'image a été utilisée pour compter les signaux d'hybridation (Genetix, San Jose, États-Unis). Tous les échantillons ayant des rapports de HER2 /CEP17 entre 1,8 et 2,2 ont été marqués manuellement en comptant plus de 60 cellules qui ne se chevauchent pas. Ratios de > 2.2, 1.8 à 2.2, ou < 1,8 ont été classés comme positifs, équivoques, ou négative pour l'amplification, respectivement. 17 polysomie chromosomal a été défini comme un signal de CEP17 qui a plus de six copies en moyenne par cellule. Sur les 447 échantillons, 434 spécimens ont été inclus dans l'analyse finale.

Collaborative Enzyme Reactive-immunologique (Enhanced CEER)

diapositives CEER ont été imprimées, incubées avec des lysats GC et traitées comme décrit précédemment [ ,,,0],6]. Les lames ont été scannée à quatre paramètres photomultiplicateur (PMT) de gain pour augmenter la plage dynamique effective. Les données ont été ajustées à une équation à cinq paramètres dérivés en fonction de la concentration en anticorps de capture et PMT et présentés dans des unités calculées (CU).

Impression multiplexée-microarray.

anticorps de capture ont été imprimés sur des lames de verre nitrocellulose revêtu (ONCYTE®, Grâce Bio-Labs) en utilisant des imprimantes non-contact (Nanoplotter, GESIM). Le diamètre de la tache était d'environ 175 um. Les lames ont été conservés dans une chambre desséché à 4 ° C. Environ 500 pL de capture Abs ont été imprimés en triple à des concentrations de dilution en série de 1 mg /ml, 0,5 mg /ml et 0,25 mg /mL. Purifié souris IgG ont servi de témoins négatifs. configurations de diapositives Immuno-tableau sont présentés dans la figure S1.

conjugaison d'anticorps et de purification.

-cible spécifique des anticorps (monoclonal de souris contre des épitopes spécifiques sur les protéines de transduction du signal humains) et les enzymes de détection correspondants, la glucose oxydase (GO) ou la peroxydase de raifort (HRP), ont été activés avec l'agent de réticulation bifonctionnel, le succinimidyl-4- (N-maléimidométhyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), et couplés produisant conjugués anticorps-enzyme. On a purifié les conjugués par HPLC. les activités des anticorps dans les conjugués purifiés ont été déterminés par ELISA de compétition et les activités enzymatiques après la conjugaison ont été détectés par des tests fonctionnels spécifiques pour chaque enzyme de détection.

essais de CEER

diapositives Immuno-puces à ADN ont été rincées. 2 fois avec du TBST (Tris 50 mM /NaCl 150 mM /0,1% de Tween-20, pH de 7,2 à 7,4), bloquées avec 80 ul Whatman tampon de blocage pendant 1 heure à température ambiante, puis lavé 2 fois avec du TBST. dilués en série ou des échantillons témoins lysat dans 80 ul de tampon de dilution (2% de BSA /0,1% de Triton X-100 /TBS à pH 7,2 à 7,4) ont été ajoutés à des sous-ensembles désignés sur des lames et on fait incuber pendant 1 heure à température ambiante. Les lames ont été lavées 4X (3 min. Chaque) et un détecteur d'ABS ont été ajoutés dans 80 ul de tampon de réaction et incubé pendant 2 heures à température ambiante. Après avoir lavé les lames avec du TBST pour éliminer non lié détecteur d'ABS, 80 ul d'une solution de biotine-tyramide (5 pg /ml dans 50 mM de glucose /PBS), préparée à partir de 400 pg /ml dans une solution d'éthanol (Perkin-Elmer Life Science) a été ajoutée et incubée pendant 15 min dans l'obscurité. GO /HRP à médiation par procédé d'amplification du signal tyramide a été arrêtée par lavage avec du TBST 4X, 3 min à chaque fois. dépôt local de biotine-tyramide a été détectée par incubation avec la streptavidine (SA) -Alexa647 (Invitrogen) à raison de 0,5 pg /ml dans du BSA 2% /Triton 0,1% /TBS pendant 40 min. À la fin de l'incubation, les lames ont été lavées 4X avec du TBST, séchées et conservées dans l'obscurité jusqu'à ce qu'ils ont été imagées par l'intermédiaire d'un scanner de puces à ADN.

Pour CEER analyse des données, les diapositives ont été numérisés à quatre réglages de gain de PMT pour augmenter la dynamique effective gamme. intensités de signal de fond corrigée a été calculée pour les taches imprimées en triple. Plusieurs critères ont été utilisés pour filtrer les données pour d'autres analyses, y compris les limites sur les empreintes ponctuelles, coefficient de variation des répétitions sur place, et le contexte général de pad. Pour chaque essai, une courbe standard a été générée à partir de lysats de cellules témoins dilués en série préparées à partir de lignées cellulaires avec des protéines de transduction de signal bien caractérisées. Les données ont été ajustées à une équation à cinq paramètres dérivés en fonction de la concentration et VPM anticorps de capture. La courbe standard pour chaque marqueur a été ajusté en fonction de l'intensité du signal logarithmique, mesurée en unité de fluorescence relative (RFU) par rapport à la concentration logarithmique des lysats cellulaires et les renvois aux lignées cellulaires standards. Par exemple, la courbe standard de lysats cellulaires préparés à partir dilués en série BT474 a été utilisé pour normaliser l'expression de HER2 et le degré de phosphorylation dans chaque échantillon (figure S2). Par conséquent, un échantillon avec 1 CU d'expression HER2 a la valeur équivalente à la valeur RFU RFU de 1 cellule BT474 de référence standard. Comme les cellules de référence ont 1~2 × 10 ^{6 HER1 ou récepteurs HER2 par cellule avec environ 10% des récepteurs phosphorylés, 1 CU représente l'expression de 1~2 × 10 6 RTK ou 1~2 × 10 5 RTK phosphorylées [6]. La limite de détection (LOD) valeur par CU était déterminé à être inférieur à 1 UC pour la fois l'expression et l'activation de HER2. prédictions individuelles de chaque dilution et le gain a été calculée en une seule prédiction finale.}

pleine longueur des récepteurs p185-HER2 de HER2 tronquée d'enrichissement ont été épuisés à partir de lysats de tissu tumoral en utilisant des anticorps magnétique perles couplées spécifique au domaine extracellulaire (ECD) de HER2, comme illustré sur la figure S3. Résultant p185-HER2 lysats appauvri, qui contenait enrichis tronqués HER2 (t-HER2) protéines réceptrices dépourvues du DPE, ont été utilisés pour la quantification ultérieure de l'expression t-HER2 et la phosphorylation en utilisant les essais de CEER respectifs. Une valeur de coupure de 500 CU a été utilisé pour marquer p95HER2 positivité par 20 pg de tissu analysé. Le p95HER2 test de lecture totale était par rapport aux signaux générés à partir des courbes standard générées en utilisant un lysat de cellules de contrôle à partir de la lignée cellulaire de cancer du sein BT474.

culture cellulaire et réactifs

lignées cellulaires CEER de contrôle de dosage , les cellules MDA-MB-468, T47D, HCC827 et BT474 avec des degrés d'expression ErbB-RTK variables ont été obtenues auprès de l'ATCC et cultivées à 37 ° C dans 5% de CO _{2 - pour MDA-MB-468 (Dulbecco essentiel minimal milieu (DMEM) + 10% de FBS), BT474 (DMEM + 10% de FBS) et HCC827 et T47D (RPMI 1640 + 10% de FBS, 0,2 U /ml d'insuline bovine). On a compté les cellules et on les lave avec du PBS 1X avant la stimulation du facteur de croissance. MDA-MB-468 cellules ont été stimulées avec 100 nM de facteur de croissance épidermique (EGF) ou le facteur de croissance transformant a (TGFa), des cellules T47D ont été stimulées avec 20 nM héréguline β (HRGβ) ou 100 ng /ml de facteur de croissance 1 analogue à l'insuline (IGF-1) dans un milieu de croissance exempt de sérum pendant 5 ou 15 minutes. les cellules stimulées ont été lavées avec 1 x PBS, puis lysées (tampon de lyse: 50 mM de Tris, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1% de Triton X-100 et 2 mM de Na 3VO 4) et conservés sur de la glace pendant 30 min avant de prendre le surnageant pour un essai ultérieur ou conservés à -80 ° C.}

détermination du marqueur CEER et carte regroupement de chaleur

Positivity pour un biomarqueur donné a été défini comme étant supérieur au troisième quartile pour un marqueur biologique particulier dans la population de patients de cette étude. Les patients ont été classés en fonction de la valeur de l'essai CU ECOR pour un marqueur biologique donné. Ces patients plus grands que le troisième seuil de quartile ont été considérés comme les plus à risque d'avoir des niveaux de biomarqueurs élevés et voies de signalisation activées donc potentiellement. Après l'analyse de survie a été effectuée pour évaluer la qualité prédicative de ces seuils.

Le profil de biomarqueur d'échantillons de tumeur a été représentée par une carte de chaleur. Chaque cellule a été colorisée basée sur le rang décile de l'activation de ce marqueur. Chaque marqueur a été classé par décile, représenté par une teinte distincte, à l'échelle indiquant la couleur. Tant la ligne (patient) et la colonne (marqueur) regroupement a été montré. L'algorithme de liaison complète a été utilisée pour obtenir une classification hiérarchique (ou dendrogramme) en regroupant séquentiellement les observations les plus corrélées à l'aide de la fonction de hclust dans R, appelée par la fonction heatmap.2 disponible avec la bibliothèque de l'environnement statistique R de gplots: Une langue et Environnement pour le calcul statistique (http://www.r-project.org/). Les sous-groupes de marqueurs ont été définis par le regroupement qui a permis des comparaisons de profils de marqueurs pour les patients.

CTC et ATC isolement

Pour l'évaluation de la CCT, 7,5 ml d'échantillons de sang ont été prélevés dans 10 ml d'éthylènediamine évacués tétraacétique (EDTA) tubes. Le système CellSearch (Veridex) a été utilisée pour l'immuno-isolement magnétique CTC selon le protocole décrit précédemment [6] en utilisant des ferrofluides conjugués Ab contre épithéliale molécule d'adhésion cellulaire. Pour l'évaluation ATC contenus cellulaires ont été enrichies de 50 à 100 ml de fluide ascitique par centrifugation et l'isolement des cellules tumorales immuno-magnétique a été réalisée de façon similaire. Plusieurs jeux de ATCs ont été traités avec des cocktails de facteurs de croissance (EGF, HRG, HGF et IGF1) avec ou sans lapatinib et PHA-665752 combinaison d'inhibiteur.

Résultats et discussions

Les caractéristiques des patients

Caractéristiques des 434 patients du GC sont fournis dans le tableau 1. Tous les patients ont reçu gastrectomies avec D2 dissection des ganglions lymphatiques avec 242 (55,8%) des patients recevant gastrectomies sous-total. Selon AJCC système de mise en scène 2002 86 patients avaient stade pathologique I, 116 avaient la phase II, 126 étaient au stade III et 106 étaient au stade IV (35 patients atteints de métastases M1) GC. Au moment de l'analyse, 226 patients étaient morts et 237 patients avaient documenté la récidive. 70 patients avaient un carcinome chevalière. L'globale à 5 ans et les taux de survie sans maladie étaient de 52,4% et 50,0%, respectivement. Tous les tissus GC primaires ont été acquis au moment de l'intervention chirurgicale et immédiatement congèle pour analyse moléculaire ultérieure.

analyses basées sur CEER-révèlent une hétérogénéité dans l'expression de HER2 et la présence de la protéine HER2 variant tronqué, p95HER2, HER2 (+) gastrique cancers

Nous avons précédemment rapporté le développement de tests de CEER basés immuno-biopuces [6], [15]. Nous avons utilisé le test HER2 à base de CEER pour enquêter sur le statut HER2 des HER2 (+) et HER2 (-) échantillons dans notre cohorte GC patients qui ont été séparés selon la norme IHC HercepTest /analyse FISH. L'avantage des essais à base de CEER-est leur plus grande sensibilité et de spécificité par rapport aux tests basés sur IHC [6]. Sur la base actuelle HER2 (+) les définitions des glucocorticoïdes [13], [14], à savoir, des échantillons avec un score HER2-IHC de 3+ ou 2+ et positif HER2 de statut d'amplification du gène, 50 de 434 (11,5%) échantillons dans notre cohorte GC patients étaient HER2 (+) par IHC HercepTest /analyse FISH (tableau S1). En revanche, selon les lignes directrices IHC spécifiques pour les cancers du sein, seulement 78% (39/50) de ces patients étaient HER2 (+) (tableau S1) indiquant les différences dans les critères de notation pour positivité HER2 entre les cancers de l'estomac et du sein. La majorité des glucocorticoïdes HER2 (+) (36 sur 50 échantillons (72%)) étaient du sous-type intestinal plutôt que les diffuses ou de type mixte GCS en accord avec les rapports publiés [13], [16], [17].

test HER2 à base CEER-démontré sensiblement plus hauts niveaux d'expression de HER2 dans IHC /FISH HER2 (+) des tumeurs par rapport à celles de l'HER2 (-) tumeurs (avec une valeur moyenne de 77,9 CU vs. 4.3 CU, 8.18E-10 p-valeur), comme illustré sur la figure 1A. Les données de base HER2-CEER est présenté en CU, une unité fonctionnelle standard basée sur la lignée cellulaire contrôle avec l'expression de HER2 connue [6], qui permet de comparer l'expression HER2 dans les échantillons. Seulement 32/50 ou 64% de IHC /FISH HER2 (+) GCS a démontré l'expression de HER2 par CEER et il y avait un niveau significatif d'hétérogénéité dans l'expression de HER2 dans ces échantillons révélés par les lectures quantitatives CEER. Hétérogénéité dans l'expression de HER2 peut expliquer la raison pour seulement un degré modéré de concordance (87,5%) entre l'IHC et FISH lectures pour HER2 dans le procès de ToGA [12]. Cet écart aurait une incidence directe sur les résultats de la thérapeutique HER2 ciblées telles que le trastuzumab en glucocorticoïdes. En outre, en raison de la grande sensibilité de l'essai de CEER, on a remarqué que ~20% du IHC /FISH HER2 (-) GCS encore exprimé totale HER2 quoique à des niveaux nettement inférieurs à ceux du HER2 (+) de la population de patients
.

Utilisation de la p95HER2 plate-forme de test à base de CEER, des formes tronquées de HER2 ont été détectés spécifiquement, en plus de longueur HER2, dans GCS pour la première fois. expression p95HER2 a été analysée dans 31/50 HER2 (+) échantillons et 27/384 HER2 (-) échantillons) qui a démontré une pleine expression significative longueur de HER2 par CEER (figure 1B). L'incidence de p95HER2 en HER2 (+) GCS était ~77% (en 24/31 échantillons) (tableau S1). Semblable à la pleine expression longueur de HER2, la majorité d'expression p95HER2 (79% de p95HER2 exprimé en HER2 (+)) a été détectée dans glucocorticoïdes de type intestinal. expression p95HER2 a également été observée dans un petit pourcentage de HER2 (-) CG (37% ou 10/27 échantillons) qui ont démontré pleine HER2 expression de longueur. Toutefois, l'expression moyenne p95HER2 en HER2 (+) des échantillons de GC était significativement plus élevée que celle observée dans HER2 (-) GCS (5083,6 CU en HER2 (+) vs 437,0 CU en HER2 (-), p-value = 1.27E-05 ). p95HER2 peut contribuer à la non-réactivité trastuzumab dans les tumeurs du GC comme dans 70-80% des surexprimant HER2 des cancers du sein [18]. Trastuzumab plus chimiothérapie standards rendus une réponse globale de seulement 47% en HER2 (+) GCS dans le procès de ToGA [12] indiquant l'existence de mécanismes de résistance au trastuzumab possibles et notre incapacité à sélectionner avec précision les intervenants de trastuzumab. Afin de valider cliniquement expression p95HER2 avec la résistance au trastuzumab, qui a été controversée en particulier en raison des récents résultats contradictoires des études sur le cancer du sein GeparQuattro [19], rigoureux p95HER2 dosage de raffinement en termes de déterminations test de diagnostic de coupure cliniquement pertinents et applicabilité en milieu clinique est nécessaire. Une validation d'expression p95HER2 est prévue dans un lapatinib néoadjuvante de phase II plus chimiothérapie essai clinique chez les patients du GC comme plusieurs études suggèrent l'utilisation de lapatinib p95HER2 (+) cancers [20], [21].

Pris ensemble , nos données définissent clairement le statut HER2 dans GCS et démontrent l'utilité des diagnostics HER2 à base de CEER dans des échantillons GC patients pour déterminer leur précision pleine longueur et d'expression de HER2 tronquée. Le développement de ces diagnostics va fortement influer sur la sélection précise de HER2 (+) GCS qui sont répondeurs à trastuzumab et d'autres agents ciblant HER2. Nous avons précédemment rapporté l'utilisation de diagnostics HER2 à base de CEER chez les patients atteints de cancer du sein [6], [15] qui ont démontré une plus grande sensibilité et de spécificité par rapport aux diagnostics basés sur IHC.

cancers gastriques démontrent l'activation concomitante de voies

Nous avons utilisé le test de CEER directement sur des échantillons de GC pour évaluer la présence du total et phosphorylés (activés) formes de plusieurs molécules de signalisation qui sont connus des cibles de médicaments de signalisation: ces inclus plusieurs RTK (HER1, HER2, HER3, ÉÉGC, IGF1R) et PI3K. Des images représentatives de multiplexées CEER voie-réseaux de huit échantillons différents sont présentés dans la figure 2A. Ces images montrent clairement l'hétérogénéité dans les signatures de la voie activée qui prévaut dans GCS. Par exemple, les deux HER1 /HER2 sont coactivated dans les échantillons 1 et 6, alors que HER2 est activée dans l'échantillon 2, bien que HER1, HER2 et ÉÉGC sont exprimés à des niveaux élevés. Exemple 5 démontre l'activation de tous les 5 RTK analysés, y compris la PI3K aval et les voies Shc. La section suivante décrit l'hétérogénéité de la voie de signalisation observée dans notre GC patients cohorte déterminée par les analyses de CEER.

Tumeurs de 202 patients (46,5%) ont eu aucune activation détectable des RTK testés dans notre étude. modèles d'activation de la voie pour le reste des tumeurs, comme illustré dans une analyse de la concentration de la voie (figure 2B), largement varié avec des glucocorticoïdes démontrant l'activation concomitante de plusieurs RTK tels que HER2 /HER3, HER1 /2/3, HER1 /3 /ÉÉGC ou HER3 /ÉÉGC tandis que d'autres ont été phosphorylée uniquement sur une seule protéine. La teneur en tumoral de tous les échantillons analysés a > 70% sur la base de leur examen histologique. Toutefois, l'expression pan-cytokératine (pan-CK) était nettement variable de l'hétérogénéité suggère dans le contenu épithéliale de GCS. Sur la base de ce profilage, nous avons classé l'échantillon 434 GC cohorte selon leurs signatures d'activation RTK et le statut HER2

HER axe dans les cancers gastriques. (Tableau 2 & tableau S1).

Au moins un élément récepteur de l'axe HER a été activé dans 41% des patients atteints de GC. HER2 phosphorylation a été détectée, non seulement dans 50% de HER2 (+) patients atteints de GC, mais aussi dans ~22% de HER2 (-) des cancers, en accord avec l'expression de HER2 totale observée précédemment décrite. 16/25 HER2 (+) des échantillons qui ont démontré activés HER2 ont également exprimé p95HER2. De même, HER3 a également été phosphorylée dans un pourcentage plus élevé de HER2 (+) GC (36%) par rapport à HER2 (-) des cancers (~ 24%). Cependant, HER1 phosphorylée n'a pas eu une telle préférence et a été activée de manière équivalente dans les deux types GC (26% HER2 (+) et 25% en HER2 (-)). En outre, la plupart des tumeurs HER membre actif du GC (~64%) ont montré une activation concomitante d'autres récepteurs RTK, à savoir ÉÉGC ou IGF1R. Histologiquement, la majorité de la HER2 (+), type intestinal GCS exprimé un HER2 activé (en 22/36 ou ~61%), suivie par HER3 (en 13/36 ou ~36%) avec un ensemble de 36% des glucocorticoïdes de type intestinal exprimant HER2 une voie activée. Dans l'ensemble, l'activation HER2 était plus concentrée dans le type intestinal (55/154 ou 35,7%) par rapport aux cancers de type diffus (43/225 ou 19,1%). En revanche, activé HER1 a également été observée dans les deux-type intestinal (38/154 ou 24,7%) et le type diffus (58/225 ou 25,8%) GCS. Activé HER3 a également été équivalente présente (29,9% et 21,8%) entre les deux sous-types de classification de Lauren.

Comme la fonction de signalisation de l'axe HER kinase dépend de la dimérisation du récepteur activé, nous avons examiné les différentes paires de HER membre coactivations. Coactivation de HER2 avec HER3 a été préféré dans HER2 (+) cancers (13/50 ou 26%) avec 7/13 HER2: GCS HER3 activés sans coactivation HER1. Environ 54% de la HER2: HER3 coactivated HER2 (+) GCS coexprimé p95HER2. D'autre part, HER2 (-) CG n'a pas démontré une préférence pour toute paire HER kinase dimère spécifique avec les trois possibles paires de dimères activés (HER1: HER2, HER1: HER3 et HER2: HER3) exprimé en -15% chacun de HER2 (-) échantillons. activation Triple de HER1 /2/3 récepteurs a été observée chez 11,1% des glucocorticoïdes avec une distribution légèrement plus élevé dans HER2 (-) cancers

ÉÉGC activé cancers gastriques (tableau 3 & tableau S1).
.

similaire à HER1, ÉÉGC phosphorylation a été réparti entre de manière équivalente HER2 (+) (22%) et HER2 (-) (~ 25%) GCS. En outre, la distribution ÉÉGC activé sur la base du histotype Lauren était similaire entre intestinal (48/154 ou 31,2%) et diffus de type (55/225 ou 24,4%) GCS.

La majorité des ÉÉGC échantillons GC activé (~ 71% ou 77/108) ont montré une activation concomitante de HER membres des récepteurs de kinases. Tous les échantillons avec un ÉÉGC phosphorylée ont démontré une amplification de ÉÉGC (données non représentées). Nous avons étudié l'HER axe des récepteurs qui cross-talk avec la voie de ÉÉGC préféré. Sur les 77 échantillons de GC démontrant une coactivation ÉÉGC avec un HER membre, 66 échantillons (~86%) étaient avec HER1. Dans l'ensemble aussi ÉÉGC est préférentiellement coactivated avec HER1 (15,2%) par rapport à HER2 (10,1%) ou HER3 (9,7%). Ces observations suggèrent une éventuelle diaphonie entre les voies de signalisation ÉÉGC et HER1 dans GCS. activation ÉÉGC ne coexiste avec HER3 activé à moins que HER1 et /ou HER2 ont été phosphorylés dans le même échantillon. Environ 7% des patients du GC a démontré une coactivation des trois membres de récepteurs HER axe avec ÉÉGC. ÉÉGC Activé coexisté avec p95HER2 exprimant des échantillons en 5/24 et 1/10 HER2 (+) et HER2 (-) GCS, respectivement

IGF1R cancers gastriques activés (tableau 4 & tableau S1)..

similaire à l'activation HER3, la voie de signalisation entraîné par le récepteur de l'IGF-1 était actif dans un pourcentage plus élevé de HER2 (+) GC (30%) que les HER2 (-) CG (24,7%). En outre, comme on l'observe avec HER3 phosphorylé, IGF1R activé a été réparti de façon équivalente entre les intestins (26%) et le type diffus (~ 24%) GC. Cette distribution nous amène à étudier s'il y avait une IGF1R: HER3 coactivation dans la GC du patient cohorte. IGF1R était en effet au maximum coactivated avec p-HER3 surtout dans HER2 (+) GCS où 22% ou 11/50 HER2 (+) GCS démontré un IGF1R: HER3 coactivation. Cependant, dans HER2 (-) GCS, pourcentage de IGF1R coactivation avec HER3 (en 51/384 échantillons ou 13,8%) était similaire à IGF1R coactivation avec HER1 (en 53/384 échantillons ou 13,3%). IGF1R: coactivation HER2 (en 45/384 échantillons ou 11,7%), suivie de près. Dans l'ensemble, 34/434 échantillons de GC ont démontré coactivation de tous les membres de l'axe HER kinase avec IGF1R dont 28 échantillons aussi démontré un coactivation ÉÉGC. Cependant, ÉÉGC a rarement été co-activé avec IGF1R en l'absence d'un membre de sa kinase de récepteur de co-activation. En outre, c-MET: coactivations IGF1R ont été principalement observées dans HER2 (-) GCS

échantillons de GC ont été regroupés hiérarchiquement en fonction de leurs profils d'activation du marqueur à base décile (Figure 2B).. L'analyse a démontré que ÉÉGC: HER1, HER2: HER3 et IGF1R: modèles d'activation de PI3K ont été étroitement corrélée avec le ÉÉGC: amas HER1 formant un sous-ensemble distinct.

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