PLoS ONE: Роман протеомики на основе клинической диагностики Технология Обозначает Неоднородность в активированном путей передачи сигналов в желудочном Раки

Абстрактный

Цель
<р> Цель данного исследования состояла в том, чтобы использовать протеомики на основе Collaborative Фермент Enhanced Реактивная (CEER) иммунологический исследовать протеин-тирозин-фосфорилирование в качестве диагностических маркеров рака желудка (ГКС ).

Экспериментальный дизайн

Белковые лизаты из свежезамороженных 434 продвинутых ШС этапе были проанализированы для фосфорилирования HER1, HER2, p95HER2, HER3, CMET, IGF1R и PI3K. Узоры активации пути были подразделены на основании опухоли HER2 статуса. Иерархическая кластеризация был использован для определения coactivations в Подготовка в ШС. Прогностическое значение Тропинка паттернов активации определяли путем соотнесения без признаков болезни выживаемости различных подгрупп GC с использованием анализа выживаемости Каплана-Мейера. CEER также был использован для определения присутствия тирозина фосфорилируется сигнальных каскадов в циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) и опухолевых клеток асцита (ЦОВ),.

Результаты

с использованием новых диагностических иммуноанализа, CEER, мы демонстрируют наличие p95HER2 и одновременно активированные сигнальных путей в дс опухолевых тканях, ЦОК и ЦОВов изолированы от пациентов GC впервые. p95HER2 выражается в ~77% от HER2 (+) ШС. Приблизительно 54% ​​ШС имеют активированную HER1, HER2, HER3, CMET или IGF1R и демонстрируют худший прогноз, чем те, где эти рецепторные тирозинкиназы (RTK) не активируются. Иерархическая кластеризация RTKs показывает совместное кластеризацию фосфорилированного HER1: CMET, HER2: HER3 и IGF1R-PI3K. Coactivation из HER1 с CMET делает ШС с более короткой безрецидивной выживаемости по сравнению с только CMET активированный ШС.

Выводы
<р> Наше исследование подчеркивает полезность новой технологии компаньон диагностики, CEER, который имеет сильные последствия для разработки лекарственных препаратов и терапевтического мониторинга. CEER используется для обеспечения более глубокого понимания активированных сигнальных путей в продвинутых ШС, которые могут значительно улучшить их клиническое управление посредством точного отбора пациентов для целевых терапевтических средств
<р> Образец цитирования:. Ли Дж, Ким S, P Ким, Лю X, Ли T, Ким К., и др. (2013) роман протеомики на основе клинической диагностики Технологии Обозначает Неоднородность в активированном путей передачи сигналов в желудочном Раки. PLoS ONE 8 (1): e54644. DOI: 10.1371 /journal.pone.0054644
<р> Редактор: Энтони В. И. Ло, Китайский университет Гонконга, Гонконг
<р> Поступило: 20 сентября, 2012 года; Принято: 13 December 2012 года; Опубликовано: 25 января 2013
<р> Copyright: © 2013 Lee и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Авторы не имеют никакой поддержки или финансирования сообщать
<р> Конкурирующие интересы:. в то время как ПК, XL, TL, NH, GH, АК, AJ, GM, GL и SS используются Прометеем Laboratories, это не меняет авторов " соблюдение всех политик PLoS ONE на данных и материалов общего доступа.

Введение
<р> Молекулярно целевые агенты ускорили области онкологии. Учитывая, что примерно половина тирозинкиназы составляющей человеческого kinome участвует в злокачественных опухолях человека, не удивительно, что большая часть текущих терапевтических средств целевых различных киназ [1], [2]. Coactivation рецепторных тирозинкиназ (RTK) наблюдалась в подмножествах множества видов рака, таких как глиобластомы [3], рак молочной железы [2], [4], [5], [6], [7], рак легких [8 ], [9], рак головы и шеи [7] и рака желудка [4], [5], [6], таким образом, вовлекая их по мере необходимости для опухолевой прогрессии и выживаемости. Эти наблюдения дают достаточное клиническое обоснование для скрининга активированные RTKs в раковых заболеваний, которые могли бы затем направлять терапевтический адресности и потенциально обеспечивают знания для рациональных комбинаторных терапевтических стратегий. Тем не менее, просто анализируя выражение или активации статус одного РТК, который может быть конкретный белок-мишень для конкретного терапевтического средства является недостаточным для отбора пациентов, как часто раз пациенты не реагируют на терапию, несмотря на экспрессию мишени. Несколько потенциальных проблем могут быть ответственны за такое отсутствие терапевтического эффекта от целевых агентов, например, 1) сопутствующей активации параллельных или альтернативных путей, которые обходят первоначально целевой белок (ы), и 2) непрерывного изменения в молекулярных и патологических особенностей неопластических тканей во время прогрессирования рака. Таким образом, было бы идеально, чтобы иметь диагностический инструмент компаньон, который может быть применен на ограниченном количестве клинических образцов, чтобы захватить комплексную сложность фосфорилированных сигнальных сетей в опухолевой ткани в дополнение к прямой цели РТК белка для контроля за "развивающуюся" болезнь .
<р> Targeted фосфорилирование анализ клинических образцов было затруднено из-за отсутствия пригодных для использования легко клинических анализов, которые достаточно чувствительны, чтобы функционировать в ограниченном количестве клинических тканей. Ранее мы уже сообщали о разработке нового приближения на основе иммуноферментного анализа, Collaborative ферментного Enhanced реактивно-иммуноанализа (CEER, рисунок S1) [6], которая подходит для анализа как общее выражение и состояние активации сигнального белка каскадами. CEER может быть выполнена в мультиплексной способом непосредственно на клинических образцах, которые могут быть доступны в ограниченных количествах. Анализ CEER использует формирование уникальной иммуно-комплекс требующих совместной локализации двух детекторных энзим-конъюгированные-антител, как только белки-мишени были захвачены на микрочипе. Этот формат обеспечивает эффективное и чувствительное обнаружение RTKs, а также вниз по течению белки вниз Подготовка в к уровне одной клетки (чувствительность приблизительно 100 zeptomoles). В данном исследовании мы использовали анализ CEER для изучения сложности сигнального пути в рака желудка (GC).
<Р> ШС являются ведущей причиной смерти от рака во всем мире с частотой 18,9 /100 000 случаев в год и смертности скорость 14,7 /100000 в год [10] и являются наиболее распространенным злокачественным в Корее [11]. Метастатический GC остается терапевтической проблемой для медицинских онкологов из-за его плохого прогноза. В настоящее время трастузумаб является единственным активным целевой агент, который доказал свою эффективность для GC в рандомизированном испытании фазы III [12]. В то время как активация нескольких RTKs было сообщено в ШС, их влияние на GC прогнозе неизвестна. Это имеет важное значение для разработки и применения терапевтических средств для лечения клинического управления ШС.
<Р> В этом исследовании мы использовали мультиплексированного CEER платформу, чтобы определить уровни активированных RTKs (HER1, HER2, усеченные варианты HER2, т.е. p95HER2, HER3, CMET, PI3K и IGF1R) в 434 свежих тканей замороженное GC и попытались классифицировать пациентов GC в потенциальные подгруппы на основе их белковых паттернов активации пути. Мы наблюдали несколько активаций белка сигнала в подгруппах GC опухолей, которые коррелируют с безрецидивной выживаемости (DFS) у этих больных. Таким образом, мы предполагаем, что избыточная активация входа проводящих путей может привести к остаточному вниз по течению сигнализации в ШС, ограничивая тем самым эффективность противоопухолевый монотерапиями целевых против одиночных RTKs. И, наконец, мы разработали потенциально мощную методику, которая может позволить врачам отслеживать базовые и эволюционирующие изменения в опухолевых профилей активации РТК в течение лечения с использованием циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) и злокачественные клетки, выделенные из перитонеальной жидкости (опухоли Эрлиха клеток или ЦОВов ). Взятые вместе, наше исследование дает доказательства сопутствующей активации РТК в GC тканях человека, кроме создания CEER в качестве эффективного клинического инструмента для диагностики и мониторинга активации RTK во время лечения ГХ или прогрессирования заболевания.

Материалы и методы

Пациент Когорта и тканевая образцов закупок
<р> исследование было проведено после утверждения советом Samsung Medical Center Institutional Review (SMC IRB) для обоснованного отказа согласия с использованием архивных тканей с ретроспективных клинических данных. Первичные образцы опухоли были собраны от Samsung Medical Center. Всем пациентам была выполнена гастрэктомия с радикальной лимфодиссекции с лечебной целью. С марта 2001 года по февраль 2005 года 447 свежие замороженные ткани, полученные из 434 пациентов были собраны из хирургически удаленных первичных опухолей желудка и были доступны для окончательного анализа. Все свежие замороженные ткани были собраны (в пределах &лт; 30 минут) в операционное поле и немедленно замораживали и хранили в жидком азоте до последующего использования. Образцы опухоли были подтверждены на наличие > 70% площади опухоли патологоанатомом. Для анализа, небольшие кусочки замороженных тканей (10 мкм раздел Х 3) были получены с использованием prechilled лезвием бритвы и лизируют в 100 мкл буфера для лизиса. Полученные лизаты хранили при -80 ° С до последующего анализа

гистопатология Обзор и определение статуса HER2
<р> Все доступные H &. E-витражные стекла были централизованно рассмотрены двумя патологи (ID, ККМ ) при экспериментальной патологии ядра Научно-исследовательского института рака Samsung. Все образцы опухолей из хирургически удаленных первичных опухолей желудка. статус HER2 определяли IHC и FISH. Анализ IHC проводили с использованием HercepTest ™ (Dako, Glostrup, Дания). уровни экспрессии белка HER2 оценивали как 0 до 3+, в соответствии с рекомендациями консенсуса панельных по HER2 тем самым увеличив счет GC [13], [14]. Для рыбы, был использован комплект зонд PathVysion HER2 ДНК (Abbott, Дес-Плейнс, штат Иллинойс). Ariol система анализа изображений была использована для подсчета сигналов гибридизации (Genetix, Сан-Хосе, США). Все образцы с коэффициентами HER2 /CEP17 между 1,8 и 2,2 были забиты вручную путем подсчета более 60 неперекрывающихся клеток. Коэффициенты > 2,2, от 1,8 до 2,2, или &л; 1,8 были классифицированы как положительные, сомнительны, так и отрицательным для амплификации, соответственно. Хромосомные 17 полисомию был определен как CEP17 сигнал, который имел более чем шесть копий в среднем на одну ячейку. Из 447 образцов, 434 образцов были включены в окончательный анализ.

Collaborative Фермент Enhanced Реактивный-иммунологический (CEER)
<р> CEER слайды были напечатаны, инкубировали с GC лизатов и обрабатывали, как описано ранее [ ,,,0],6]. Слайды были отсканированы в четырех настройках ФЭУ (ФЭУ) усиления, чтобы увеличить эффективный динамический диапазон. Данные были пригодны к уравнению с пятипараметрическое производном как функция захвата-антитела концентрации и PMT и представлены в вычисленных единицах (у.е.).

мультиплексированного микрочипов печать.
<Р> Захват антитела были напечатаны на нитроцеллюлозных покрытием стеклах (ONCYTE®, Грейс Bio-Labs) с использованием бесконтактных принтеров (Nanoplotter, GeSiM). Диаметр пятна составлял приблизительно 175 мкм. Слайды были сохранены в высушенном камере при температуре 4 ° С. Примерно 500 мкл захвата Abs печатались в трех повторах при серийных концентрациях разведении 1 мг /мл, 0,5 мг /мл и 0,25 мг /мл. Очищенная мышь-IgGs служили в качестве отрицательного контроля. Иммуно-массив конфигураций слайд показаны на рисунке S1.

Антитело спряжения и очистка.
<Р> Target-специфические антитела (мышиное моноклональное против специфических эпитопов на белках сигнальной трансдукции человека) и соответствующих ферментов детектора, глюкозооксидазы (ГО) или пероксидазу хрена (ПХ), активировали бифункциональный сшивающий агент, сукцинимидил-4- (N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), и в сочетании с получением антитело-ферментные конъюгаты. Конъюгаты очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Антител деятельность в очищенных конъюгатов определяли с помощью конкурентного ELISA и активности ферментов после конъюгации были обнаружены функциональных анализов, специфических для каждого фермента детектора.

CEER анализы.
<Р> Иммуно-микрочипов слайды были промыты 2X с TBST (50 мМ Трис /150 мМ NaCl /0,1% твин-20, рН 7,2-7,4), блокировали 80 мкл Ватман блокирующего буфера в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем промывали 2Х TBST. Серийно разведенные лизат контроля или образцов в 80 мкл буфера для разведения (2% БСА /0,1% Тритон Х-100 /TBS, рН 7,2-7,4), были добавлены к обозначенным подмассивов на слайдах, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Слайды были промыты 4X (3 мин. Каждый), и детектор Абс были добавлены в 80 мкл реакционного буфера и инкубировали в течение 2-х часов при комнатной температуре. После того, как моечные слайды с TBST для удаления несвязанного детектора Abs, 80 мкл биотин-tyramide раствора (5 мкг /мл в 50 мМ глюкозы /PBS), приготовленный из 400 мкг /мл в растворе этанола (фирма Perkin-Elmer Life Science), и инкубировали в в течение 15 мин в темноте. ГО /ПХ-опосредованный процесс усиления сигнала tyramide останавливали промывкой TBST 4X, 3 мин каждый. Локальное осаждение биотин-tyramide был обнаружен путем инкубации со стрептавидином (SA) -Alexa647 (Invitrogen), при 0,5 мкг /мл в 2% БСА /0,1% Тритон /TBS в течение 40 мин. После завершения инкубации слайды были промыты 4X с TBST, сушат и выдерживают в темноте, пока они не были обследованы с помощью сканера микрочипов.
<Р> Для анализа данных CEER, слайды были отсканированы при четырех значениях усиления ФЭУ, чтобы увеличить эффективный динамический ассортимент. Фон со скорректированной интенсивности сигналов были усреднены для пятен, напечатанных в трех экземплярах. Несколько критериев были использованы для фильтрации данных для дальнейшего анализа, в том числе ограничения на спот следы, коэффициент вариации для точечных повторах, и общего фона площадки. Для каждого анализа стандартную кривую получали из серийно разведенными лизатов клеток с полученными из клеточных линий с хорошо охарактеризованных белков сигнальной трансдукции. Данные были пригодны к уравнению с пятипараметрическое производном как функция захвата-антитела концентрации и ФЭУ. Калибровочная кривая для каждого маркера был пригоден в зависимости от интенсивности сигнала журнала, измеренная в качестве единицы относительной флуоресценции (RFU) в зависимости от логарифма концентрации клеточных лизатов и ссылки на стандартные клеточные линии. Например, стандартная кривая серийно разведенными клеточных лизатов, приготовленных из ВТ474 использовали для нормализации экспрессии HER2 и степень фосфорилирования в каждом образце (рис S2). Следовательно, образец с 1 CU выражения HER2 имеет значение, эквивалентное РФС к значению РФС 1 стандартной эталонной ВТ474 клетки. Как опорные клетки имеют 1~2 × 10 6 HER1 или HER2 рецепторы на клетку с приблизительно 10% фосфорилированных рецепторов, 1 CU представляет собой выражение 1~2 × 10 6 RTKs или 1~2 × 10 5 фосфорилированные RTKs [6]. Предел обнаружения (LOD значения) по ТС было определено, менее 1 CU как для экспрессии и активации HER2. Индивидуальные прогнозы от каждого разведения и усиления были усреднены в один окончательного прогноза.

усеченного Her2 ОБОГАЩЕНИЕ
<р> Полноразмерные p185-HER2 рецепторы были истощены из лизатов опухолевых тканей с помощью магнитно-бусинка соединенных антител специфичные для внеклеточного домена (ECD) HER2, как показано на рисунке S3. Результирующая p185-HER2 истощенные лизаты, в котором содержатся обогащенные усеченные белки рецептора HER2 (трет-HER2), испытывающих недостаток в ECD, были использованы для последующего количественного выражения трет-HER2 и фосфорилирования с использованием соответствующих CEER анализов. Срезаемого значение 500 CU был использован, чтобы выиграть для p95HER2 позитивности на 20 мкг ткани анализировали. Общий анализ p95HER2 считывания был относительно сигналов, генерируемых из стандартных кривых, полученных с использованием контроля клеточного лизата от рака молочной линии раковых клеток ВТ474.

Культура клеток и реактивы

линии CEER управления анализа клеток , MDA-MB-468, T47D, HCC827 и ВТ474 клетки с различной степенью экспрессии ErbB-РТК были получены из АТСС и выращивали при 37 ° с в 5% CO <суб> 2 - для MDA-MB-468 (Дульбекко минимально необходимым среда Игла (DMEM) + 10% FBS), ВТ474 (DMEM + 10% FBS), и HCC827 и T47D (среда RPMI 1640 + 10% ФБС, 0,2 ед /мл бычьего инсулина). Клетки подсчитывали и промывали 1 × PBS до того фактора роста стимуляции. Клетки MDA-MB-468 были стимулированы 100 фактора нмоль эпидермального роста (EGF) или трансформирующего фактора роста а (TGFα), клетки T47D стимулировали 20 нМ херегулин бета (HRGβ) или 100 нг /мл фактора-1 инсулиноподобного роста (IGF1) в бессывороточной среде для выращивания в течение 5 или 15 мин. Стимулированные клетки промывали 1 × PBS и затем лизируют (буфера для лизиса: 50 мМ Трис, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1% Trition Х-100 и 2 мМ Na <суб> 3VO <суб> 4) и выдерживают на льду в течение 30 мин, прежде чем принимать супернатант для последующего анализа или храниться при температуре -80 ° C.

определение CEER маркер и Теплокарта кластеризация
<р> Позитивность для данного биомаркера была определена как больше, чем третий квартиль для индивидуального биомаркера в популяции пациентов данного исследования. Пациенты оценивались на основе значения CU из анализа CEER для данного биомаркера. Те пациенты, больше, чем третий квартиль обрезания были рассмотрены на самом высоком риске иметь повышенные уровни биомаркеров и, следовательно, потенциально активированные сигнальные пути. Последующий анализ выживаемости было сделано для оценки предикативный качества этих обрезаний.
<р> биомаркером профиль образцов опухолей была представлена ​​карта тепла. Каждая ячейка была раскрашены основана на децилю ранге активации этого маркера. Каждый маркер оценивался децилях, в лице отдельного оттенка, со шкалой, указывающей цвет. И ряд (пациента) и столбец (маркер) кластеризация был показан. Полный алгоритм сцепления был использован для получения иерархического кластера (или дендрограмму) путем последовательного группировки наиболее коррелированных наблюдений с использованием функции hclust в R, называемую функцией heatmap.2 доступной с библиотекой gplots статистической среды R: язык и Окружающая среда для статистических расчетов (http://www.r-project.org/). Подгруппы маркеров были определены кластеризация, что позволило сравнения профилей маркеров для пациентов.

СТС и ATC изоляция
<р> Для оценки CTC, 7,5 мл отбирали образцы крови в 10-мл эвакуированной этилендиамина кислоту (ЭДТК) трубки. Система CellSearch (Veridex) использовали для иммуно-магнитного CTC изоляции в соответствии с протоколом, описанным ранее [6] с использованием магнитных жидкостей, конъюгированных с Ab против эпителиальной молекулы клеточной адгезии. Для оценки УВД, клеточное содержимое обогащались от 50 до 100 мл асцитной жидкости центрифугированием и иммуно-магнитной изоляции опухолевых клеток проводили аналогичным образом. Несколько наборов ЦОВов были обработаны с коктейлем факторов роста (EGF, HRG, HGF и IGF1) с или без лапатиниба и PHA-665,752 комбинации ингибитора.

Результаты и обсуждение

Характеристики пациентов <бр> <р> Характеристики 434 больных ГХ представлены в таблице 1. Все пациенты получали гастрэктомий с D2 лимфоузла рассечение с 242 (55,8%) пациентов, получающих гастрэктомий промежуточных итогов. В соответствии с AJCC 2002 постановка системы, 86 пациентов имели патологическую стадии I, 116 имели II стадии, 126 имели стадию III и 106 была IV стадия (35 пациентов с метастатическим M1) GC. Во время анализа, 226 пациентов были мертвы, и 237 пациентов были задокументированы рецидив. 70 пациентов имели рак перстневидно клеток. 5-летняя общая выживаемость и безрецидивная были 52,4% и 50,0%, соответственно. Все первичные ткани GC были приобретены во время операции и сразу же замораживали для дальнейшего молекулярного анализа.

CEER на основе анализы показывают гетерогенность экспрессии HER2 и наличием HER2 усеченного варианта, желудка p95HER2, в HER2 (+) раки
<р> ранее мы уже сообщали о разработке CEER анализов на основе иммуно-микрочипов [6], [15]. Мы использовали пробу HER2 CEER основе с целью изучения состояния HER2 из HER2 (+) и HER2 (-) образцов в нашей группе GC пациентов, которые были подразделены на основании стандартного IHC HercepTest /анализа FISH. Преимущество анализов CEER на основе является их высокая чувствительность и специфичность по сравнению с анализами ВВК на основе [6]. Исходя из текущих HER2 (+) определений для ШС [13], [14], то есть образцы с оценкой HER2-IHC 3+ или 2+ и положительный Her2
статус амплификации гена, 50 из 434 (11,5%) образцов в нашей группе GC пациентов были HER2 (+) с помощью IHC HercepTest /анализа FISH (таблица S1). В отличие от этого, в соответствии с рекомендациями IHC, специфичных для рака молочной железы, только 78% (39/50) из этих пациентов были HER2 (+) (Таблица S1) с указанием различий в критериях выставления баллов для HER2 позитивности между желудка и рака молочной железы. Большинство HER2 (+) ШС (36 из 50 образцов (72%)) были кишечного подтипа, а не диффузных или смешанного типа ШС по согласованию с опубликованных докладов [13], [16], [17].
<р> CEER на основе HER2 анализ показал значительно более высокие уровни экспрессии HER2 в IHC /FISH HER2 (+) опухолей по сравнению с таковыми в HER2 (-) опухоли (со средним значением 77,9 CU против 4.3 CU, р-значение 8.18E-10), как показано на рисунке 1А. Данные HER2 CEER на основе представлена ​​в CU, стандартный функциональный блок на основе клеточной линии управления с известным выражением HER2 [6], что позволяет проводить сравнение экспрессии HER2 через образцов. Только 32/50 или 64% от IHC /FISH HER2 (+) ШС продемонстрировал экспрессию HER2 на CEER и существует значительная степень неоднородности в экспрессии HER2 в этих образцах как показали количественным CEER считываниями. Гетерогенность экспрессии HER2 может объяснить причину лишь умеренной степени согласованности (87,5%) между IHC и FISH считываниями для HER2 в тогу испытании [12]. Это расхождение будет непосредственно влиять на исход HER2-целевых терапевтических средств, таких как трастузумаб в ШС. Кроме того, из-за высокой чувствительности анализа CEER, было замечено, что ~20% от IHC /FISH HER2 (-) ШС-прежнему выражено общее HER2 хотя и при значительно более низких уровнях, чем HER2 (+) популяции пациентов
. <р> Использование CEER на основе p95HER2 анализа платформы, укороченные формы HER2 были обнаружены специально, в дополнение к полноразмерным HER2, в ГКС в первый раз. Выражение p95HER2 было проанализировано в 31/50 HER2 (+) образцов и 27/384 HER2 (-) образцов), которые продемонстрировали значительное полное выражение длины HER2 по CEER (рис 1B). Заболеваемость p95HER2 в HER2 (+) ШС был ~77% (в образцах 24/31) (таблица S1). Подобно полному выражению длины HER2, большинство выражения p95HER2 (79% от p95HER2 выражается в HER2 (+)) был обнаружен в ШС кишечного типа. Выражение p95HER2 также наблюдалось в небольшом процентном отношении к HER2 (-) ГКС (37% или 10/27 проб), которые продемонстрировали полное выражение HER2 длины. Тем не менее, среднее выражение p95HER2 в HER2 (+) образцов GC была значительно выше, чем это наблюдалось в HER2 (-) ГКС (5083,6 CU в HER2 (+) против 437,0 CU в HER2 (-), р-значение = 1.27e-05 ). p95HER2 может способствовать трастузумаб не-отзывчивости в GC опухолей, как это происходит в 70-80% HER2 рака молочной железы с гиперэкспрессией [18]. Трастузумаб плюс стандартной химиотерапии оказал общий ответ лишь 47% в HER2 (+) ШС в тогу испытании [12], указывающие наличие возможных механизмов сопротивления трастузумаб и наша неспособность точно подобрать трастузумаб ответчиков. Для того, чтобы клинически подтвердить экспрессию p95HER2 с сопротивлением трастузумаб, который был спорным, особенно в связи с последними противоречивыми результатами исследований рака груди GeparQuattro [19], строгий p95HER2 анализ уточнения с точки зрения клинически соответствующих определений диагностического анализа отрезных и применимости в клинических условиях требуется. Валидация выражения p95HER2 планируется в неоадъювантной Лапатиниб фаза II плюс химиотерапии клинических испытаний у больных GC, как некоторые исследования предполагают использование лапатиниба в p95HER2 (+) рака [20], [21].
<Р> Взятые вместе , наши данные четко определить статус HER2 в ШС и продемонстрировать полезность диагностики HER2 CEER основе в образцах GC пациента для определения их точной и полной длины усеченный выражение HER2. Развитие такой диагностики будет сильно влиять на точный выбор HER2 (+) ШС, которые реагирующих на трастузумаб и других HER2 ориентированных агентов. Ранее мы уже сообщали об использовании диагностики HER2 CEER основе у больных раком молочной железы [6], [15], что продемонстрировал более высокую чувствительность и специфичность по сравнению с IHC диагностики на базе.

рака желудка демонстрируют сопутствующую активацию пути
<р> Мы использовали пробу CEER непосредственно на образцах GC оценить наличие общего и фосфорилированных (активированных) формах нескольких сигнальных молекул, известных лекарственных целей сигнализации: они включали несколько RTKs (HER1, HER2, HER3, CMET, IGF1R) и PI3K. Типичные изображения уплотненных CEER Тропинка-массивов из восьми различных образцов показаны на рисунке 2А. Эти изображения наглядно демонстрируют гетерогенность активированных подписей пути, который преобладает в ШС. Например, как HER1 /HER2, являются coactivated в образцах 1 и 6, в то время как только HER2, активируется в образце 2, хотя HER1, HER2 и CMET экспрессируются на высоких уровнях. Пример 5 демонстрирует активацию всех 5 анализируемых RTKs включая вниз по течению PI3K и путей Shc. В следующем разделе описывается сигнального пути гетерогенность, наблюдаемую в нашей GC группе пациентов, определяемой CEER анализов.
<Р> Опухоли из 202 пациентов (46,5%) не имели обнаруживаемой активацию RTKs испытанных в нашем исследовании. активация пути шаблоны для остальных опухолей, как показано в анализа путей кластерной (Фигура 2В), которые сильно различаются некоторые ШС демонстрируя сопутствующую активацию нескольких RTKs, таких как HER2 /HER3, HER1 /2/3, HER1 /3 /CMET или HER3 /CMET в то время как другие были фосфорилируется только на один белок. Содержание опухоли всех исследованных образцов был > 70% в зависимости от их гистологического исследования. Однако выражение пан-цитокератин (пан-CK) отчетливо указывает переменная гетерогенность в эпителиальной содержание ШС. Исходя из этого профилирования, мы классифицировали когорту образца 434 ГК в соответствии с их подписями активации РТК и статус HER2

HER оси в рака желудка. (Таблица 2 &усилителя; Таблица S1).
<Р> По крайней мере, один член рецептор HER оси активировали у 41% больных ГХ. был обнаружен HER2 фосфорилирование не только в 50% HER2 (+) пациентов GC, но и в ~22% от HER2 (-) раковых образований в согласии с наблюдаемой общей экспрессии HER2, описанному ранее. 16/25 HER2 (+) образцов, демонстрировавшие активированные HER2 также выразил p95HER2. Точно так же, HER3 также фосфорилируется в более высокий процент HER2 (+) ШС (36%) по сравнению с HER2 (-) раковые заболевания (~ 24%). Тем не менее, фосфорилируется HER1 не было такого предпочтения и то же самое активируется в обоих типах GC (26% в HER2 (+) и 25% в HER2 (-)). Кроме того, большинство из HER-членов активированного GC опухолей (~64%) продемонстрировали, сопутствующее активации других RTKs, т.е. CMET или IGF1R. Гистологически, большинство из HER2 (+), кишечный тип ШС выразил активированного HER2 (в 22/36 или ~61%), за которой следует HER3 (в 13/36 или ~36%) с общим 36% ГКС кишечного типа выражая активированного HER2 пути. В целом, активация HER2 был более сконцентрирован в кишечном типа (55/154 или 35,7%) по сравнению с раки диффузного типа (43/225 или 19,1%). В противоположность этому, активированный HER1 в равной степени наблюдается и в кишечном типа (38/154 или 24,7%) и диффузного типа (58/225 или 25,8%) ШС. Активированный HER3 также присутствует то же самое (29,9% и 21,8%) между обоими классификационных подтипов Лорен.
<Р> Как функция сигнализации о HER оси киназы зависит от активированного димеризации рецептора, мы рассмотрели различные пары HER члена coactivations. Coactivation HER2, с HER3 было отдано предпочтение в HER2 (+) рака (13/50 или 26%) с 7/13 HER2: HER3 активированные ГКС без HER1 coactivation. Примерно 54% ​​HER2: HER3 coactivated HER2 (+) ШС коэкспрессируются p95HER2. С другой стороны, HER2 (-) ШС не демонстрируют предпочтение какой-либо конкретной HER-киназы димера пары со всеми тремя возможными активированными парами димеров (HER1: HER2, HER1: HER3 и HER2: HER3), выраженные в ~15% каждого из HER2 (-) образцы. Тройной активация /2/3 рецепторов HER1 наблюдалась у 11,1% ШС с незначительно выше распределения в HER2 (-) раки

CMET активированный рак желудка (таблица 3 &Amp; Таблица S1).
. <р> Подобно HER1, CMET фосфорилирования эквивалентно распределены между HER2 (+) (22%) и HER2 (-) (~25%) ГКС. Кроме того, активируется распределение CMET основано на histotype Лорен была похожа между кишечником (48/154 или 31,2%) и диффузного типа (55/225 или 24,4%) ШС.
<Р> Большинство CMET образцов активированного GC (~ 71% или 77/108) продемонстрировали сопутствующую активацию членов HER-киназы рецептора. Все образцы с фосфорилированным CMET продемонстрировал CMET
амплификации (данные не показаны). Мы исследовали предпочел ее оси рецепторы, которые перекрестно ток с CMET пути. Из 77 образцов GC, демонстрирующих CMET coactivation с HER члена, 66 образцов (~86%) были с HER1. В целом же, CMET был преимущественно coactivated с HER1 (15,2%) по сравнению с HER2 (10,1%) или HER3 (9,7%). Эти наблюдения указывают на возможное перекрестные помехи между сигнальными путями CMET и HER1 в ШС. активация CMET никогда не сосуществовали с активированной HER3, если HER1 и /или HER2 были также фосфорилируется в том же образце. Приблизительно 7% больных ГХ показал coactivation всех трех членов ее оси рецептора с CMET. Активированный CMET сосуществовали с p95HER2 выражения образцов в 5/24 и 1/10 HER2 (+) и HER2 (-) ШС соответственно

IGF1R активированные рака желудка (Таблица 4 &Amp; Таблица S1)..

Как и активации HER3, сигнальный путь движимый рецептором IGF1 был активен в более высокий процент HER2 (+) ШС (30%), чем HER2 (-) ГКС (24,7%). Кроме того, как заметил с фосфорилированным HER3, активированный IGF1R было эквивалентно распределяется между кишечником (26%) и диффузного типа (~ 24%) ШС. Такое распределение приводит нас к расследованию, если была IGF1R: HER3 coactivation в когорте GC пациента. IGF1R действительно максимально coactivated с п-HER3 особенно в HER2 (+) ШС, где 22% или 11/50 HER2 (+) ШС продемонстрировавших IGF1R: HER3 coactivation. Тем не менее, в HER2 (-) ШС, процент IGF1R coactivation с HER3 (в 51/384 образцов или 13,8%) была аналогична IGF1R coactivation с HER1 (в 53/384 образцов или 13,3%). IGF1R: HER2 coactivation (в 45/384 образцов или 11,7%) с последующим за ним. В целом, 34/434 образцы GC продемонстрировал coactivation всех членов HER оси киназ с IGF1R из которых 28 образцов также продемонстрировали CMET coactivation. Тем не менее, CMET редко совместно активировали IGF1R в отсутствии HER-члена рецептора киназы coactivation. Кроме того, C-MET: IGF1R coactivations были в основном наблюдается в HER2 (-) ШС
<р> образцы GC были иерархически сгруппированы на основе их децильным на основе профилей активации маркера (рис 2В).. Анализ показал, что CMET: HER1, HER2: HER3 и IGF1R: паттерны активации PI3K были тесно связаны с CMET: HER1 кластер образуя отчетливую подмножество.

• PLoS ONE: Экспрессия AFP и STAT3 участвует в Мышьяк Trioxide-индуцированный апоптоз и ингибирование пролиферации в AFP-про…
• PLoS ONE: функциональный Promoter -308G > вариант в фактора некроза опухоли альфа ген связан с риском и прогрессирован…