Ploche ONE: Román proteomiky-Based Clinical Diagnostics technológie Identifikuje Heterogenita v aktivovaných signálnych dráh v karcinómov žalúdku

abstraktné

Účel

Cieľom tejto štúdie bolo využiť proteomiky na báze Collaborative Enzým Enhanced Jalový (CEER) imunologický vyšetrovať proteínové fosforylácie tyrozínu ako diagnostické markery u karcinómov žalúdka (GC ).

experimentálneho dizajnu

proteínové lyzáty z čerstvo zmrazených 434 pokročilom štádiu GC boli analyzované na fosforylácii HER1, HER2, HER3, p95HER2, cMet, IGF1R a PI3K. Aktivačný vzory dráha boli oddelené na základe nádoru HER2 stave. Hierarchické zhlukovanie bola použitá pre určenie dráh coactivations v GC. Prognostický význam dráhy aktivácia vzorov bola stanovená korelácia choroba-bez dobu prežitia rôznych podskupín GC pomocou analýzy prežitie Kaplan-Meier. CEER bol tiež použitý na určenie prítomnosti tyrozínu fosforylovaná signálnych kaskád v cirkulujúcich nádorových buniek (CTC) a ascites nádorové bunky (ATC).

Výsledky

využitím nových diagnostických imunologického testu, CEER, my demonštrovať prítomnosť p95HER2 a súčasne aktivovaných signálnych dráh v nádorových tkanivách GC, CTC ATC a izolované od pacientov s GC prvýkrát. p95HER2 je vyjadrená v% z ~ 77 HER2 (+) GC. Približne 54% z GC majú aktivovanú HER1, HER2, HER3, cMet alebo IGF1R a vykazujú horšiu prognózu ako tie, u ktorých sa tieto receptorové tyrozín Kinase (RTK) sa neaktivuje. Hierarchické zhlukovanie RTK odhaľuje spoluúčasť zhlukovaniu fosforylovaného HER1: cMet HER2: HER3 a IGF1R-PI3K. Coactivation z HER1 s cMet činí GCS s prežitím kratšou bez ochorenia v porovnaní s iba cMet aktivovaný GCS.

Závery

Naša štúdia poukazuje na užitočnosť nové sprievodné diagnostické techniky, ktorá má CEER silné implikácie pre vývoj liečiv a terapeutického monitorovania. CEER sa používa k lepšiemu pochopeniu aktivovaných signálnych dráh vo vyspelých GC, ktorý môže významne zlepšiť svoju klinickú správu prostredníctvom presného výberu pacientov cielených liečiv

Citácia :. Lee J, Kim S, P Kim, Liu X, Lee T, Kim KM, et al. (2013) Román proteomiky-Based Clinical Diagnostics Technology Identifikuje Heterogenita v aktivovaných signálnych dráh v karcinómov žalúdku. PLoS ONE 8 (1): e54644. doi: 10,1371 /journal.pone.0054644

Editor: Anthony W. I. Lo, čínsky University of Hong Kong, Hong Kong

prijatá: 20. septembra 2012; Prijaté: 13.prosince 2012; Uverejnené: 25.januára 2013

Copyright: © 2013 Lee et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Autori nemajú žiadnu podporu ani finančné prostriedky hlásiť

Konflikt záujmov :. Kým PK, XL, TL, NH, GH, AK, AJ, GM, GL a SS sú zamestnaní Prometheus Laboratories, to nič nemení autorov ' dodržaní všetkých zásad ploche jeden na zdieľanie dát a materiálov.

Úvod

Molekulárno cielené agenti zrýchlil oblasti onkológie. Vzhľadom na to, že približne polovica z tyrozínkinázy zložky ľudského kino je zapojený do ľudských nádorov, nie je prekvapujúce, že veľká časť súčasných liečiv cielených na rôzne kinázy [1], [2]. Coactivation z receptorové tyrozínkinázy (RTK), bola pozorovaná u podskupín rôznych druhov rakoviny, ako je multiformný glioblastóm [3], rakoviny prsníka [2], [4], [5], [6], [7], karcinómu pľúc [8 ], [9], rakoviny hlavy a krku [7] a rakovina žalúdka [4], [5], [6] a tým zapletať je to nevyhnutné pre progresiu nádoru a prežitie. Tieto pozorovania poskytujú dostatočné klinické zdôvodnenie pre skríning aktivovaných RTK v rakoviny, ktoré by potom mohli riadiť terapeutickú zacielenie a potenciálne poskytnúť vedomosti pre racionálnu kombinačných liečebných postupov. Avšak, potom analyzuje výraz alebo aktivačný stav jedného RTK, ktorá môže byť špecifický cieľový proteín pre konkrétny liek je nedostatočná tak často dokonca pacienti nereagujú na terapiu bez ohľadu na expresiu cieľového výberu pacientov. Niekoľko potenciálne problémy by mohla byť zodpovedná za tento nedostatok terapeutický prospech z cielených činidiel, napríklad, 1) súbežné aktiváciu paralelných alebo alternatívnych ciest, ktoré obísť cielený proteín (y), a 2) priebežné zmeny v molekulárnej a patologické rysy neoplastických tkaniva počas progresie rakoviny. Z tohto dôvodu by bolo ideálne, aby diagnostický nástroj spoločník, ktorý by mohol byť aplikovaný na obmedzenom množstve klinických vzoriek pre zachytenie celkovej zložitosti fosforylovaných signálnych sietí v neoplastické tkanive Okrem priameho cieľu RTK proteínu pre sledovanie "vyvíjajúce sa" choroba .

Cielená fosforylácie analýza klinických vzoriek bola sťažená vzhľadom na nedostatok ľahko použiteľných klinických testoch, ktoré sú dostatočne citlivé, aby fungovali v obmedzenom množstve klinických tkanív. Už skôr sme popísali vývoj nových bezdotykového imunoanalýza s, Collaborative Enzyme Enhanced Reaktívne-imunologický test (CEER, obr S1) [6], ktorý je vhodný pre analýzu ako celkovú expresiu a stav aktivácie kaskád proteínových signalizácie. CEER môže byť vykonaná v multiplexním spôsobom priamo z klinických vzoriek, ktoré môžu byť k dispozícii v obmedzenom množstve. Test CEER využíva tvorbu jedinečný immuno-komplex vyžaduje spoločnú lokalizáciu dvoch detekčných enzýmom konjugovaný protilátok po cieľovej proteíny boli zachytené na mikročipu. Tento formát umožňuje efektívne a citlivú detekciu RTK rovnako ako následných dráh proteínov až na úroveň jednotlivých buniek (o citlivosti cca 100 zeptomoles). V tejto štúdii sme využili CEER testu študovať zložitosť signalizačné dráhe karcinómov žalúdka (GC).

GC sú hlavnou príčinou úmrtí na rakovinu po celom svete s výskytom 18,9 /100000 prípadov za rok a úmrtnosti rýchlosť 14,7 /100.000 ročne [10] a sú najčastejšie zhubný nádor v Kórei [11]. Metastatický GC zostáva terapeutickú výzvu pre onkológmi kvôli jeho zlou prognózou. V súčasnej dobe, trastuzumab je aktívna iba zacilující činidlo, ktoré bolo preukázané, že sú účinné pre GC v randomizovanej klinickej štúdii fázy III [12]. Kým aktivácia niekoľkých RTK bola hlásená u GC, ich vplyv na GC prognózu nie je známy. To je dôležité pre vývoj a aplikáciu liečiv pre klinické vedenie GC.

V tejto štúdii sme použili multiplexové CEER platformu pre stanovenie hladín aktivovaných RTK (HER1, HER2, skrátené varianty HER2, tj p95HER2, HER3, cMet, PI3K a IGF1R) v 434 čerstvej mrazenej GC tkanív a pokúšal sa roztriediť pacientmi GC do potenciálnych podskupín na základe ich proteínových vzorkách aktivácia dráhy. Pozorovali sme niekoľko signál proteínové aktivácia v podskupín GC nádorov, ktoré majú vplyv na prežitie bez ochorenia (DFS) u týchto pacientov. Preto sme hypotézu, že redundantné dráha aktivácia vstupy by mohli viesť k zostatkovej signalizácie downstream v GC, čím sa obmedzuje protirakovinovú účinnosť v monoterapii zameraných proti jednotlivých RTK. Nakoniec sme vyvinuli potenciálne mocnej metodiku, ktorá môže umožniť lekárom sledovať baseline a vyvíjajúci sa zmeny v nádorových aktivácie RTK profilov v priebehu liečby pomocou cirkulujúcich nádorových buniek (CTC) a malígnych buniek izolovaných z peritoneálnej tekutiny (ascites nádorových buniek alebo ATC ). Celkovo vzaté, naša štúdia poskytuje dôkazy o súčasnom aktivácia RTK v GC ľudských tkanivách okrem ustanovujúce CEER ako účinný nástroj pre klinickú diagnostiku a sledovanie aktivácia RTK počas liečby GC alebo progresie ochorenia.

materiály a metódy

Pacient kohorty a tkanivových vzoriek Procurement

štúdia bola vykonaná po schválení zo strany Samsung Medical Center Institutional Review Board (SMC IRB) informovaný súhlas zbavenie použitím archívnych tkanív so spätnou klinických dát. Primárne vzorky nádorov boli všetky získané od spoločnosti Samsung Medical Center. Všetci pacienti podstúpili gastrektómii s radikálnou lymfadenektómia s kuratívnym zámerom. Od marca 2001 do februára 2005, 447 čerstvé mrazené tkanivo získané zo 434 pacientov boli získané z chirurgicky resekcii primárnych nádorov žalúdka a boli k dispozícii pre konečnú analýzu. Všetky čerstvé mrazené tkanivá boli odobraté (v < 30 minút) na operačné pole a boli bleskovo okamžite zmrazený a skladované v kvapalnom dusíku až do neskoršie použitie. Vzorky nádoru bola potvrdená na prítomnosť > 70% plochy nádoru patológom. Pre analýzu, malé kúsky mrazené tkaniva (10 um časť x 3), sa pripraví za použitia prechilled žiletku a lyžovanie v 100 ul lyzačného pufra. Získané lyzáty boli skladované pri -80 ° C až do vykonania analýzy

Histopatologické aktualizácie a HER2 stanovenie stavu

Všetky dostupné H &. E-zafarbené rezy boli centrálne hodnotilo dvoma patológmi (ID, KKM ) pri experimentálnom patológie jadra Samsung Cancer Research Institute. Všetky nádorové vzorky boli od chirurgicky resekcii primárnych nádorov žalúdka. Stav HER2 bola stanovená IHC a FISH. IHC analýza bola vykonaná s použitím HercepTest ™ (DAKO, Glostrup, Dánsko). HER2 expresné hladiny bielkoviny boli hodnotené ako 0 až 3+, podľa odporúčania konsenzom panel na HER2 mení na GC [13] [14]. Pre ryby, bolo použité PathVysion HER2 DNA kit sonda (Abbott, Des Plaines, IL). Ariola analýza obrazu systém bol použitý pre počítanie hybridizačný signály (Genetix, San Jose, USA). Všetky vzorky s pomerom HER2 /CEP17 medzi 1,8 a 2,2 sa hodnotila ručne počítaním viac ako 60 neprekrývajúce sa bunky. Pomery >, 2.2, 1.8 až 2,2, OR 1,8 boli klasifikované ako pozitívne, nejednoznačné, alebo negatívne pre amplifikáciu, v danom poradí. Chromozomálne 17 polysomy bol definovaný ako CEP17 signál, ktorý mal viac ako šesť kópií v priemere na bunku. Z celkového počtu 447 vzoriek, 434 vzoriek boli zahrnuté do konečnej analýze.

Collaborative enzým Enhanced Reaktívne-imunologický test (CEER)

CEER sklíčka bola vytlačená, inkubované s GC lyzáty a spracované ako je popísané vyššie [ ,,,0],6]. Sklíčka bola naskenovaná v štyrmi nastaveniami fotonásobičmi (PMT) zisk zvýšiť efektívne dynamický rozsah. Dáta bola dosadená do piatich parametrov rovnice odvodená ako funkcia koncentrácie capture-protilátka a PMT a prezentované v počítaných jednotiek (MJ).

Multiplexný-microarray tlač

Zachytenie protilátky boli vytlačené. na sklíčka nitrocelulózových potiahnutá (ONCYTE® Grace Bio-Labs) s využitím bezkontaktnej tlačiarní (Nanoplotter, Gesi). Priemer škvrna bola približne 175 um. Sklíčka boli udržiavané v suchom komore pri teplote 4 ° C. Približne 500 pl odchytu Abs boli vytlačené v troch vyhotoveniach na sériových koncentráciou roztoku 1 mg /ml, 0,5 mg /ml a 0,25 mg /ml. Čistený myšou-IgG slúžili ako negatívne kontroly. Immuno-array konfigurácie posuvné sú znázornené na obrázku S1.

protilátok časovanie a čistenie.

cieľovo špecifické protilátky (myšia monoklonálna proti špecifickým epitopom v oblasti ľudských signálnych proteínov) a zodpovedajúcich detekčných enzýmy, oxidáza glukózy (GO), alebo s chrenovou peroxidázou (HRP), boli aktivované s bi-funkčné síťovadlo, sukcinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyklohexán-1-karboxylátu (SMCC), a získa sa v spojení protilátka-enzým konjugátov. Konjugáty boli čistené pomocou HPLC. Aktivity protilátok v čistených konjugáty boli určené pomocou ELISA hospodárskej súťaže a aktivity enzýmov post-konjugácie boli detekované pomocou funkčných testoch špecifických pre každý detektor enzým.

CEER testy.

Immuno-microarray sklíčka sa opláchnu 2X s TBST (50 mM Tris /150 mM NaCl /0,1% Tween-20, pH 02 /7-04 /7), blokovali sa 80 ul Whatman Blokovacie pufor po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti, potom premytá 2x s TBST. Sériovo rozriedené lyzátu kontrol alebo vzorky v 80 ul riediacim pufra (2% BSA /0,1% TritonX-100 /TBS, pH 2 /7-4 /07) boli pridané do určených čiastkových polí na sklíčka a inkubované po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Sklíčka premytá 4X (3 min. Každá), a detektor Abs sa v 80 ul reakčného pufra a inkubuje sa po dobu 2 hodín pri teplote miestnosti. Po umývaní kĺže s TBST pre odstránenie nenaviazaného detektor Abs, 80 ul biotín-tyramidovým roztoku (5 ug /ml v 50 mM glukóza /PBS), pripravený z 400 ug /ml v roztoku etanolu (Perkin-Elmer Life Science) bol pridaný a inkubuje sa s ním po dobu 15 minút v tme. GO /HRP-sprostredkované tyramidový proces amplifikácie signálu bola ukončená premytím TBST 4X, 3 min každý. Lokálne depozície biotín-tyramidovým bola detekovaná inkubáciou streptavidínom (SA) -Alexa647 (Invitrogen) pri 0,5 ug /ml v 2% BSA /0,1% Triton /TBS po dobu 40 min. Po dokončení inkubácie bola sklíčka premytá 4X TBST, vysuší a uchovávané v tme, kým boli zobrazené mikročipy skenera.

Pre analýzu dát CEER, sklíčka boli skenované na štyroch nastavení PMT zisk pre zvýšenie efektívnu dynamiku rozsah. Pozadie korigovaná intenzity signálu boli spriemerované pre spoty tlačených trikrát. Niekoľko kritériá sa použili na filtrovanie dát pre ďalšiu analýzu, vrátane limitov na mieste stopy, variačného koeficientu pre bodové opakovanie a celkovo pad pozadia. Pre každý test, štandardná krivka bola vytvorená zo sériovo riedených bunkových lyzátov pripravených z kontrolných bunkových línií sa dobre charakterizovaných prenosu signálu proteínov. Dáta bola dosadená do piatich parametrov rovnice odvodené ako funkcia koncentrácie capture protilátok a PMT. Štandardná krivka pre každú značku sa hodí ako funkcia intenzity signálu protokolu, merané ako relatívna fluorescenčná jednotky (RFU) proti log koncentrácie bunkových lyzátov a vztiahnuté na štandardných bunkových línií. Napríklad, štandardná krivka sériovo riedených bunkových lyzátov pripravených z BT474 bol použitý pre normalizáciu expresie HER2 a stupeň fosforylácie v každej vzorke (obr S2). Z tohto dôvodu, vzorka s 1 CU HER2 expresie má RFU hodnotu ekvivalentnú RFU hodnotou 1 štandardného referenčného BT474 bunky. Ako referenčný bunky majú 1 ~ 2 × 10 ^{6 HER1 alebo HER2 receptorov na bunku s približne 10% fosforylovaných receptorov, 1 CU predstavuje vyjadrenie 1 ~ 2 × 10 6 RTK alebo 1 ~ 2 × 10 5 fosforylovaných RTK [6]. Limity detekcie (LOD) Cu Bolo určené, že menej ako 1 CU pre expresiu a aktiváciu HER2. Jednotlivé predpovede z každého riedenia a zisk boli spriemerované do jedného, ​​finálne predikcie.}

skrátený HER2 obohacovanie uránu

Full-length P185-HER2 receptory boli vyčerpané z nádorového tkaniva lyzátov za použitia magnetických guľôčok viazanej protilátky špecifické pre extracelulárnu doménu (ECD), HER2, ako je znázornené na obrázku S3. Výsledný P185-HER2 vyčerpané lyzáty, ktoré obsahovali obohatených skrátenej bielkoviny HER2 (t-HER2) receptora chýba ECD, boli použité pre následnú kvantifikáciu t-HER2 expresie a fosforylácie s použitím príslušných CEER testy. Bola použitá hraničná hodnota 500 CU bola použitá na skóre pre p95HER2 pozitivitu na 20 ug tkanivá analyzované. Celková p95HER2 test odpočet bol vzhľadom k signálov generovaných zo štandardných kriviek vytvorených pomocou regulácie bunkového lyzátu z rakoviny prsníka bunkovej línie BT474.

bunkových kultúrach a činidlá

CEER kontrolný test bunkovej línie , MDA-MB-468, T47D, HCC827 a buniek BT474 s rôznym stupňom ErbB-RTK expresie boli získané z ATCC a boli kultivované pri 37 ° C v 5% CO _{2 - pre MDA-MB-468 (Dulbeccova minimálnym esenciálnym medium (DMEM) + 10% FBS), BT474 (DMEM + 10% FBS), a HCC827 a T47D (RPMI 1640 + 10% FBS, 0,2 U /ml hovädzieho inzulínu). Bunky boli spočítané a premyje sa 1 x PBS pred stimuláciou rastového faktora. MDA-MB-468 bunky boli stimulované 100 nM je epidermálny rastový faktor (EGF) a transformačný rastový faktor a (TGFa), Bunky T47D boli stimulované 20 nM heregulin P (HRGβ) alebo 100 ng /ml inzulínu podobný rastový faktor-1 (IGF1) v rastovom médiu bez séra počas 5 alebo 15 minút. Stimulované bunky sa premyjú 1 x PBS a potom lyžovanie (lyzačný pufer: 50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Trition X-100 a 2 mM Na 3VO 4) a uchovávané na ľade po dobu 30 min pred prijatím supernatantu pre nasledujúci test, alebo aby sa pri -80 ° C.}

stanovenie CEER markerom a teplotné mapa zhlukovaniu

pozitivity pre daný biologický marker bol definovaný ako väčší ako tretí kvartil pre jednotlivé biomarkeru v populácii pacientov tejto štúdie. Pacientky boli hodnotené na základe hodnoty CU z testu CEER pre danú biomarkeru. Títo pacienti väčší než v treťom kvartile cutoff boli považované za najviac ohrozenú mať zvýšené hladiny biomarkerov a teda potenciálne aktivovaných signálnych dráh. Následná analýza prežitie bolo vykonané s cieľom posúdiť výpovednú kvalitu týchto slepých.

biomarker profil nádorových vzoriek bola reprezentovaná teplotné mape. Každá bunka sa zafarbené na základe hodnosti decilové aktivácii tohto markeru. Každá značka bol zaradený podľa deciles, zastúpená výrazným odtieňom, s stupnice udávajúce farbu. Oboje bolo dokázané, že mnoho (pacient) a kolóna (značka) clustering. Kompletné väzba algoritmus bol použitý pre získanie hierarchickej klastra (alebo dendrogram) postupným zoskupenie najviac korelujú pozorovania pomocou funkcie hclust do výskumu, s názvom funkciou heatmap.2 k dispozícii s gplots knižnice štatistického životné prostredie R: jazyk a životné prostredie pre štatistické výpočty (http://www.r-project.org/). Podskupiny markerov boli definované klastrov, ktorá dovolila porovnanie markerov profilov pre pacientov.

CTC a ATC izolácie

Pre vyhodnotenie CTC, 7,5 ml krvných vzoriek boli čerpané do 10 ml evakuovanej etyléndiamín kyselina (EDTA) rúrky. CellSearch systém (Veridex) bol použitý pre imuno-magnetické izolácie CTC podľa protokolu popísaného skôr [6] za použitia ferrofluids konjugovanej s Ab proti epitelové bunkové adhézie molekuly. Pre vyhodnotenie ATC, bunkové obsahy boli obohatené od 50 do 100 ml ascitu odstreďovaním a izolácie imuno-magnetické nádorových buniek bola vykonaná podobným spôsobom. Násobok zapadne ATC boli liečení kokteilov rastových faktorov (EGF, HRG, HGF a IGF1) s alebo bez lapatinib a PHA-665,752 kombinácii inhibítora.

Výsledky a diskusia

Charakteristiky pacientov

Charakteristika 434 pacientov GC sú uvedené v tabuľke 1. Všetci pacienti dostávali gastrectomies D2 lymfadenektómia s 242 (55,8%) pacientov užívajúcich medzisúčet gastrectomies. Podľa AJCC staging systém 2002, 86 pacientov malo patologickou štádiu I, 116 mal etapa II, 126 mal III.etapa a 106 mal Etapa IV (35 pacientov s metastatickým M1) GC. V čase analýzy 226 pacientov bolo mŕtvych a 237 pacientov bola dokumentovaná opakovania. 70 pacientov malo karcinóm pečatný prsteň buniek. 5-ročnej celkovej ceny a prežitie bez známok ochorenia bola 52,4% a 50,0%, resp. Všetky primárne GC tkanivá boli nadobudnuté v čase chirurgického zákroku, a okamžite zmrazený pre budúce molekulárnu analýzu.

testy CEER báze ukazujú heterogénnosť HER2 expresie a prítomnosti HER2 zrezaného varianty, p95HER2, v HER2 (+) žalúdka rakoviny

už skôr sme popísali vývoj CEER testov imunodifúzny mikročipy založené [6], [15]. Použili sme testu HER2 CEER založeného na vyšetrovať stav HER2 z HER2 (+) a HER2 (-) vzoriek v našom GC pacienta kohorty, ktoré boli segregované ktorý vychádza zo štandardu IHC HercepTest /analýzy FISH. Výhodou testov CEER báze je ich vyššia citlivosť a špecifickosť v porovnaní s testami IHC na báze [6]. Na súčasnom HER2 (+) definícií pre GC založené [13], [14], tj vzorky s HER2-IHC skóre 3+ alebo 2+ a pozitívna HER2
stav amplifikácie génu, 50 z 434 (11,5%) vzoriek v našej GC pacienta kohorty boli HER2 (+) pomocou IHC HercepTest /analýzy FISH (tabuľka S1). Na rozdiel od toho v súlade s pokynmi IHC ktoré sú špecifické pre rakoviny prsníka, iba 78% (39/50) z týchto pacientov boli HER2 (+) (Tabuľka S1) indikujúca rozdiely v bodovacích kritérií pre HER2 pozitivity medzi rakoviny žalúdka a prsníka. Väčšina HER2 (+) GC (36 z 50 vzoriek (72%)) boli črevné subtypu skôr než difúznych alebo zmiešaný typ GC v dohode s publikovaných správ [13], [16], [17].

HER2 test CEER báze preukázali podstatne vyššie úrovne expresie HER2 v IHC /FISH HER2 (+) nádorov v porovnaní s tými, v HER2 (-) nádory (s priemernou hodnotou 77,9 CU vs. 4,3 CU, p-hodnota 8.18-10), ako je znázornené na obrázku 1A. Dáta HER2 CEER báze je uvedený v CU, štandardné funkčná jednotka na základe bunkovej línii riadi sa známym HER2 výrazom [6], ktorá umožňuje porovnanie HER2 expresie naprieč vzorkami. Iba 32/50 alebo 64% z IHC /FISH HER2 (+) GCs preukázaná HER2 expresiu CEER a došlo k výraznému úroveň heterogenity HER2 expresiu v týchto vzorkách, ako odhalil kvantitatívnych CEER odpočty. Heterogenita HER2 expresie môže vysvetliť dôvod len mierny stupeň konkordancia (87,5%) medzi IHC a FISH odpočty pre HER2 v procese Toga [12]. Tento rozpor by malo priamy vplyv na výsledok liečiv HER2 cielené, ako je trastuzumab v GC. Okrem toho, vzhľadom k vysokej citlivosti testu CEER, bolo zaznamenané, že ~ 20% z IHC /FISH HER2 (-) GC stále vyjadrené celkovú HER2 hoci na zreteľne nižšej úrovni, než je HER2 (+) populácie pacientov
.

Použitie CEER založenú p95HER2 testu na platformu, skrátené formy HER2 bola špecificky zistené, okrem celej dĺžke HER2, v GC prvýkrát. p95HER2 expresie bola analyzovaná v 31/50 HER2 (+) vzoriek a 27/384 HER2 (-) vzoriek), ktorá preukázala významný plné vyjadrenie dĺžka HER2 podľa CEER (obrázok 1B). Výskyt p95HER2 v HER2 (+) GC bola ~ 77% (v 24/31 vzoriek) (tabuľka S1). Podobne ako pri plnej vyjadrenie dĺžky HER2, väčšina p95HER2 výrazu (79% vyjadrené v p95HER2 HER2 (+)) bola zistená v GC črevnej typu. p95HER2 expresie bol tiež pozorovaný v malom percente HER2 (-) GC (37% alebo 10/27 vzorky), ktoré preukázali plnej dĺžke HER2 expresiu. Avšak, priemerná p95HER2 výraz v HER2 vzorkách GC (+) bola významne vyššia ako u HER2 (-) GC (5083,6 Cu v HER2 (+) 437,0 vs UK HER2 (-), hodnota p = 1.27-05 ). p95HER2 môže prispieť k trastuzumabu nereagovanie na GC nádorov, ako to robí v 70-80% HER2 karcinómov prsníka [18]. Trastuzumab a štandardné chemoterapiou tavené celkovú odozvu len 47% v roku HER2 (+) GCS pri riadení Toga [12] označujúca existenciu možných mechanizmov rezistencie trastuzumab a naša neschopnosť presne vybrať trastuzumab záchranárom. Aby bolo možné klinicky overiť p95HER2 výraz s odporom trastuzumabom, ktorá bola kontroverzná najmä kvôli nedávnym rozporných záverov zo štúdií s rakovinou prsníka GeparQuattro [19], prísny p95HER2 test upresnenia, pokiaľ ide o klinicky relevantných diagnostická metóda cut-off stanovenie a použiteľnosť v klinickej praxi je nutné. Validácia p95HER2 prejavu je plánované v neoadjuvantná lapatinibu fázy II s chemoterapiou klinickej štúdii u pacientov GC ako niekoľko štúdií naznačuje, že užívanie lapatinibu v p95HER2 (+) rakoviny [20], [21].

Dohromady naše výsledky jasne definujú stav HER2 v GC a preukázať užitočnosť HER2 diagnostiky CEER založených vo vzorkách GC pacienta na určenie ich presnosť po celej dĺžke a skrátený HER2 expresie. Vývoj takýchto diagnostiky silne ovplyvniť presný výber HER2 (+), GC, ktoré sú odozvou na trastuzumab a ďalšie HER2 zacielenia činidiel. Už skôr sme popísali použitie HER2 diagnostiky CEER založených u pacientov s rakovinou prsníka [6], [15], ktoré preukázali vyššiu citlivosť a špecifickosť v porovnaní s diagnostikou IHC báze.

karcinómov žalúdka preukázať súčasne aktivácia signálnych dráh

sme použili test CEER priamo na vzorkách GC na zistenie prítomnosti celkových a fosforylovaných (aktivovaného) formy niekoľkých signálnych molekúl, ktoré sú známe liekové ciele: zahŕňali niekoľko RTK (HER1, HER2, HER3, cMet, IGF1R) a PI3K. Reprezentatívne obrazy multiplexných CEER dráhu polí z ôsmich rôznych vzoriek sú uvedené na obrázku 2A. Tieto obrázky jasne ukazujú heterogénnosť aktivovaných dráhy podpisov, ktorý je prevládajúci v GC. Napríklad, ako HER1 /HER2 sú coactivated vo vzorkách 1 a 6, zatiaľ čo iba HER2 je aktivovaný vzorky 2, aj keď HER1, HER2 a cMet sú vyjadrené na vysokej úrovni. Vzorka 5 demonštruje aktiváciu všetkých 5 analyzovaných RTK vrátane nadväzujúcich PI3K a SHC dráh. Nasledujúca časť opisuje heterogénnosť signalizačné dráhy pozorovaný v našom súbore pacientov GC, ako je určený CEER testami.

Nádory zo 202 pacientov (46,5%) malo žiadny zistiteľný aktiváciu testovaných v našej štúdii RTK. aktivácia dráhy vzory pre zvyšok nádorov, ako je znázornené na analýze cestou zhlukovaniu (obrázok 2B), sa značne líšia s niektorými GC preukáže súčasne aktiváciu rôznych RTK, ako HER2 /HER3, HER1 /2/3, HER1 /3 /cMet alebo HER3 /cMet, zatiaľ čo iné boli fosforylované iba na jednom proteínu. Obsah nádoru vo všetkých analyzovaných vzorkách bolo > 70% na základe ich histologické vyšetrenie. Avšak výraz pán-cytokeratin (pán-CK) bol výrazne variabilné naznačuje rôznorodosť v epitelovej obsahu GC. Na tomto profilovanie, sme kategórií ukážkový kohortu 434 GC podľa ich aktivačných podpisy RTK a stavu HER2

HER os karcinómov žalúdka (tabuľka č. 2 &Tabuľka S1).

Aspoň jeden člen receptora HER osi bol aktivovaný v 41% pacientov GC. HER2 fosforylácie bola zistená nielen u 50% pacientov GC HER2 (+), ale aj v ~ 22% HER2 (-) rakoviny v súlade s pozorovanou celkovej HER2 expresie popísané vyššie. 16/25 HER2 (+) vzorky, ktoré preukázali aktivovanej HER2 takisto vyjadril p95HER2. Rovnako tak, HER3 bola tiež fosforylovaná na vyššie percento HER2 (+) GC (36%) v porovnaní s HER2 (-) rakoviny (~ 24%). Avšak, fosforylovaný HER1 nemal takú prednosť a bol ekvivalentne aktivovaný v oboch typov GC (26% v HER2 (+) a 25% v HER2 (-)). Okrem toho, väčšina z HER člen aktivovaný GC nádorov (~ 64%) preukázala súčasne aktiváciu ďalších RTK, tj cMet alebo IGF1R. Histologicky, väčšina HER2 (+), intestinálnu GC typ vyjadrený aktivovaného HER2 (v 22/36 alebo ~ 61%) nasledovaný HER3 (v 13/36 alebo ~ 36%) s celkovým 36% GC črevnej typ exprimujúcich aktivovaný HER2 dráhy. Celkovo možno povedať, aktivácia HER2 bol viac koncentruje do črevného typu (55/154, alebo 35,7%) v porovnaní s difúznou typu rakoviny (43/225, alebo 19,1%) sa. Na rozdiel od toho aktivovaný HER1 bola rovnako pozorovalo ako črevnú typu (38/154, alebo 24,7%) a difúzneho typu (58/225, alebo 25,8%), GC. Aktivované HER3 bol tiež prítomný ekvivalentne (29,9% a 21,8%) medzi oboma klasifikácie podtypov Lauren.

Vzhľadom k tomu, signalizácia funkcie HER osi kinázy je závislá na aktívnom dimerizáciu receptora, sme sa zamerali na rôzne pary z jej členov coactivations. Coactivation HER2 s HER3 bola daná prednosť v HER2 (+) rakoviny (13/50 alebo 26%) s 7/13 HER2: HER3 aktivovanej GCS bez HER1 coactivation. Približne 54% z HER2: HER3 coactivated HER2 (+) GCs koexprimován p95HER2. Na druhej strane, HER2 (-) GC nepreukázala prednosť pre konkrétny HER kinázy diméru páru so všetkými tromi možnými aktivovaných dimerizovaných párov (HER1: HER2, HER1: HER3 a HER2: HER3), vyjadrený v% ~ 15 každom z HER2 (-) vzorky. Triple aktivácia /2/3 receptory HER1 bola pozorovaná u 11,1% GC s nepatrne vyššie distribúcie v HER2 (-) rakoviny

cMet aktivovaný karcinómov žalúdka (tabuľka 3 dvojica A a Tabuľka S1).
.

Podobne ako HER1, cMet fosforylácie bola ekvivalentne rozdelí medzi HER2 (+) (22%) a HER2 (-) (~ 25%) GCS. Okrem toho aktivuje cMet distribúcia založená na Lauren histotype bola podobná medzi črevné (48/154, alebo 31,2%) a difúzna typu (55/225, alebo 24,4%) GC.

Väčšina cMet vzoriek aktivovaný GC (~ 71% alebo 77/108) preukázal súbežnú aktivácii z jej členov kinázy receptorov. Všetky vzorky s fosforylovanej cMet preukázaná cMet
amplifikácie (dáta nie sú ukázaná). Skúmali sme prednosť HER os receptory, ktoré cross-talk s cMet dráhy. Vzoriek 77 GC demonštrujúcich si cMet coactivation s HER člena 66 vzoriek (~ 86%) boli s HER1. Celkovo príliš, cMet sa prednostne coactivated s HER1 (15,2%) v porovnaní s HER2 (10,1%) alebo HER3 (9,7%). Tieto pozorovania naznačujú možnú presluch medzi cMet a HER1 signálnych dráh v GC. Aktivácia cMet nikdy koexistovali s aktívnym HER3, ak HER1 a /alebo HER2 boli fosforylované na tej istej vzorke. Približne 7% pacientov GC preukázala coactivation všetkých troch členov HER os receptora s cMet. Aktivované cMet koexistovali s p95HER2 vyjadrenie vzoriek v 5/24 a 1/10 HER2 (+) a HER2 (-) GCS, resp

IGF1R aktivovanej karcinómov žalúdka (Tabuľka 4 &Co. tabuľka S1) ..

Podobne ako u aktivácia HER3, signálne dráhy poháňaný receptorom IGF1 bol aktívny v vyššom percentom HER2 (+) GC (30%) než u HER2 (-) GC (24,7%). Okrem toho, ako bolo pozorované u fosforylovaného HER3, aktivovaný IGF1R bol rovnocenne distribuovaný medzi črevné (26%) a difúzneho typu (~ 24%) GC. Toto rozdelenie nás vedie k preskúmať, či došlo k IGF1R: HER3 coactivation v kohorte GC pacienta. IGF1R skutočne maximálne coactivated s p-HER3 a to najmä v HER2 (+), GC, kde 22% alebo 11/50 HER2 (+) GC preukázala IGF1R: HER3 coactivation. Avšak, v HER2 (-) GC, percento IGF1R coactivation s HER3 (v 51/384 vzoriek alebo 13,8%) bol podobný IGF1R coactivation s HER1 (v 53/384 vzoriek alebo 13,3%). IGF1R: HER2 coactivation (v 45/384 vzoriek alebo 11,7%) za nasledoval. Celkovo možno povedať, 34/434 vzorky GC preukázala coactivation všetkých členov HER osi kinázy s IGF1R z toho 28 vzoriek tiež preukázali cMet coactivation. Avšak, cMet bola zriedka súčasne aktivované IGF1R v neprítomnosti HER člen receptor kinázy coactivation. Okrem toho, c-MET: IGF1R coactivations boli primárne pozorované u HER2 (-) GCs

vzorky GC boli hierarchicky zoskupené na základe ich decil založené na aktivačných značka profilov (obrázok 2b) .. Analýza ukázala, že cMet: HER1, HER2: HER3 a IGF1R: aktivácia PI3K vzory boli v úzkej korelácii s cMet: HER1 zhluk tvoriť zreteľnou podskupinu.

• Ploche ONE: Expresia AFP a STAT3 sa podieľa na arsenitým indukovanej apoptózy a inhibíciu proliferácie v AFP produkujúce rakovina žalúdka Cells
• Ploche ONE: Funkčné Promoter -308G > varianta vo faktoru nekrózy nádorov alfa gén je spojené s rizikom a progresiu rakoviny žalúdka v čínskej Population