PLoS ONE: Mycoplasma hyorhinis Aktivira NLRP3 Inflammasome i potiče migraciju i invaziju želučane stanica raka

Sažetak pregled

Pozadina pregled

Mycoplasma hyorhinis pregled ( M.hyorhinis, M.hy pregled) povezan je s razvojem želuca i prostate. NLRP3 inflammasome, kompleks proteina kontrolira sazrijevanje važnih pro-inflamatornih citokina interleukina (IL) -1β i IL-18, također sudjeluje kod tumorogeneze i metastaziranja različitih vrsta karcinoma.

Metodologija /glavne nalaze pregled

Da bi razjasniti je li M.hy
promovira razvoj tumora putem inflammasome aktivacije, analizirali smo monocita za IL-1 i IL-18 na M.hy pregled izazov. Kada je izložen M.hy Netlogu, humani monociti izlagao brz i robustan IL-1 i IL-18 izlučivanje. Mi dalje utvrdila da lipidima povezane proteina membrane (LAMP) iz M.hy Netlogu bio odgovoran za IL-1 indukcije. Primjena kompetitivni inhibitori, gen specifičan shRNA i gena ciljani miševi, utvrdili smo da M.hy
inducirana IL-1β izlučivanje bilo NLRP3 ovisan In vitro pregled i in vivo pregled , aktivnost katepsina B, K ^{+ istjecanja, Ca 2 + priliv i ROS proizvodnje bili su potrebni za aktivaciju NLRP3 inflammasome u M.hy pregled. Važno je, da je IL-1β, ali ne i IL-18 proizveden iz makrofaga izazvan s M.hy
promovira želučane migraciju stanica raka i invaziju. Pregled}

Zaključci pregled

Naši podaci ukazuju da aktivacija NLRP3 inflammasome od M.hy
može biti povezana s promociju želučane metastaze raka, te anti M.hy pregled terapiju ili ograničavanje NLRP3 signalizaciju može biti učinkovit pristup za kontrolu napretka raka želuca pregled

Izvor. Xu Y, Li H, Chen W, Yao X, Y Xing, Wang X, et al. (2013) Mycoplasma hyorhinis pregled Aktivira NLRP3 Inflammasome i potiče migraciju i invaziju želučane stanica raka. PLoS ONE 8 (11): e77955. doi: 10,1371 /journal.pone.0077955 pregled

Urednik: Suresh Yenugu, Sveučilište u Hyderabad, Indija pregled

Primljeno: 5. lipnja 2013. godine; Prihvaćeno: 6. rujna 2013; Objavljeno: 6. studeni 2013 pregled

Copyright: © 2013 Xu i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo bio podržan od subvencija od 100 Talent programa kineske akademije znanosti, prirodne znanosti Foundation Kine (91029707, 31170868), temelj Šangaj Prirodne znanosti (11ZR1442600), Novo Nordisk-CAS Research Foundation, sA-SIBS program stipendiranja, kao i dotacija iz državnog Ključne programe na zarazne bolesti (2012ZX10002007-003). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

mikoplazme su pleomorfne, zidne besplatno, prokariotske organizme koji žive ili na staničnim membranama eukariotskih ili unutar stanica, i oni su najmanji organizmi sposobni za samostalno replikacije [1]. Do sada, barem 16 vrsta mikoplazme su izolirane iz ljudi [2]. Mycoplasma hyorhinis pregled ( M.hy pregled) se smatra ne-patogeni za ljude kao što to obično inficira svinje dovodi do bolesti dišnih puteva i upala prsa i zglobovima [3], [4] , Međutim, broj dokaza ukazuje na to da M.hy pregled infekcija u ljudi nema za posljedicu kliničkih rezultata. M.hy pregled pronađen je u 56% želučanog karcinoma, 55% karcinoma debelog crijeva i 52,6% od biopsije karcinoma pluća [5]. Osim toga, 36% muškaraca s benignom hiperplazijom prostate (BPH) i 52% muškaraca s rakom prostate su M.hy pregled sero-pozitivno. Ovi klinički rezultati ukazuju na moguću vezu između M.hy pregled izlaganje sa želučanim, debelog crijeva, pluća i prostate [5], [6]. Pregled

Po mikrobnih infekcija, domaćin uzorak receptori za prepoznavanje ( PRRS), kao što je osjećaj TLRs patogene i potaknuti sintezu proupalnih citokina, kao što su pro-IL-1 i pro-IL-18 preko NF-kB aktivacije. Istovremeno, druga grupa PRRS uključujući NLRP3 zaposliti adapter protein ASC i dovesti do aktivacije kaspaze-1, koji je aktivan proteaza koja cijepa oblik prekursor citokina uključujući pro-IL-1 i pro-IL-18 u zrelu, luče oblik [7]. Patogeni ili izazovni agenti uzrokovati kalij izbacivanja, oštećenja mitohondrija, mitohondrijska dnk izdanje, ROS proizvodnju, unutarstanični povećanje kalcija ili mobilnih ciklički pad AMP u urođenih imunoloških stanica, koji su svi uključeni u kaspaze-1 aktivacije [8], [9], [10 ], [11], [12], [13]. Tijekom tog procesa, NLRP3, ASC i pro-caspase-1 tvore molekularne platformu inflammasome. Do sada, broj inflammasomes su identificirani od njih, NLRP3 inflammasome utvrđeno je povezana s razvojem tumora [14], [15], iako kontroverze postoji s različitih modela [16], [17]. Ipak, IL-1β je prijavljen za stimulaciju rasta tumorskih stanica i metastaziranje induciranje nekoliko pro-metastatskih gene kao matrične metaloproteinaze i endotelnim adhezijskih molekula, kao i TGF-P, kemokina i faktora rasta [18]. U korejskoj populaciji, kombinacija povećane sluznice razine IL-1 i homozygosity za IL-1β -31T polimorfizma jednostrukog nukleotida (SNP), oba povezana s povećanim rizikom od raka želuca [18]. Nadalje, Tu et al. utvrdio da želudac specifičan izraz ljudske IL-1 u miševa transgenih dovelo do spontanog želuca upala i raka [19], što dodatno ukazuje da IL-1β može promovirati ljudske želučane karcinogeneze. Nasuprot tome, IL-18 pojačava aktivnost NK stanica, smanjuje tumorogeneze, inducira apoptozu i blokira angiogenezu kod tumorskih stanica da pokazuju anti-tumorske učinke [20], [21]. Osim toga, pronađeno je neprikladna proizvodnja IL-18 doprinijeti patogenezi raka i mogu utjecati na klinički ishod pacijenata [22]. IL-18 je uočeno da stimulira matričnu metaloproteinazu-9 proizvodnje, što rezultira povećanom migracijom i invazije koronarnih arterija stanica glatkih mišića i HL-60 mijeloidne leukemije [23], [24]. Također je izvijestio da je u serumu IL-18 razina u rak želuca skupini bolesnika bila je značajno viša nego u čir na želucu skupini bolesnika [25] i IL-18 može povećati metastaza i imunološki bijeg od raka želuca putem down-regulacije CD70 i održavanje CD44 u ljudski rak želuca stanične linije NCI-N87 i SNU16 [26]. To je također kritična posrednik VEGF-poboljšane migracija u ljudskim staničnim linijama karcinoma želuca SNU-601 [27]. Navedeni rezultati upućuju na to da Mycoplasma hyorhinis pregled može promovirati migraciju i invaziju želučanih stanica raka aktiviranjem inflammasome. Pregled

Do danas, širok spektar mikroba, uključujući viruse, bakterije, gljivice i protozoe su identificirani za aktiviranje NLRP3 inflammasome [28]. Nedavna studija pokazala je da Mycoplasma pneumoniae pregled je također bio u mogućnosti da induciraju produkciju IL-1 u ljudskim stanicama [29]. Međutim, da li M.hy pregled, što je važan čimbenik u razvoju raka želuca, kao što je gore spomenuto [5], [30], [31], aktivira NLRP3 inflammasome i da li aktivacija doprinosi raka želuca razvoj ostaju nepoznati. U ovom istraživanju, otkrili smo da M.hy pregled pokrenuo IL-1 sekrecija u NLRP3 inflammasome ovisan način, a dobiveni IL-1β inducirane migracije i invazije želučanih stanica raka. Pregled

Rezultati pregled

M.hy pregled aktivira IL-1β i IL-18 u stanica THP-1 pregled

Kako bi se utvrdilo je li M.hy pregled inducira IL -1β proizvodnja od urođenih imunoloških stanica, mi smo promatrali zreli IL-1 nivo u humane stanične linije THP-1 stanica koje su imunizirane s različitim količinama M.hy pregled. U ovom eksperimentu, jaka indukcija IL-1 na način koji ovisi o dozi uočeno (Slika 1A). Dalje, izmjerili smo pro-IL-1β razine mRNA u stanicama i zrelih IL-1β razina proteina u supernatantima kultura u različitim vremenskim točkama nakon M.hy pregled izazov. Opaženo je da su razine IL-1β mRNA izdužen i 3 sata nakon izlaganja (Slika 1B), a zreli IL-1 (Slika 1C) i IL-18 (Slika 1D) na razini proteina izdužen i 12 sati nakon izlaganja. Nadalje, THP-1 izvedeni makrofagi također su pokazali snažnu izlučivanje IL-1, IL-18, kao i drugih proupalnih citokina kao što su IL-6 i IL-8 (slika 1E, Slika S1). Za potvrdu ovakve rezultate u THP-1 stanične linije, ispitali smo IL-1 p produkciji u osnovnim ljudskim monocitima zdravih donora izazvan s M.hy pregled, gdje je također bio jako inducirana IL-1β (Slika 1F) , Ovi podaci pokazuju da M.hy pregled pokreću snažnu IL-1 i IL-18 izlučivanje iz ljudskog mijeloidne stanice. Pregled

LAMPA izvedeni iz M.hy pregled je odgovoran za IL -1β Indukcija kroz TLR2 pregled

Nakon toga smo istraživali da li je potrebno replikacija M.hy Netlogu za IL-1B proizvodnje u monocita. Kao što je prikazano na Slici 2A, M pregled .hy pregled inaktivira grijanja ili ultraljubičastim (UV) liječenje izazvanog koliko IL-1 sekrecija iz THP-1 stanica kao live M .hy pregled. To pokazuje da određeni toplinu i UV-otporna komponenta M.hy Netlogu bio odgovoran za indukciju IL-1 sekreciju. Lipida povezane proteina membrane (LAMP) obilno je izražen na površini M.hy
[32], kao i prethodna studija je pokazala da je membrana lipoproteina iz drugih vrsta Mycoplasma inducirana IL-1β izlučivanje [33]. tako smo nagađali da M.hy
izvedeni LAMP (MLAMP) može biti odgovoran za IL-1 indukcije u THP-1 stanica. Zatim se ekstrahira s SVJETLO M.hy pregled (slika 2B) i testirali sposobnost MLAMP da inducira IL-1β sekrecije iz THP-1 stanica. Otkrili smo da MLAMP jasno inducirana sekrecija IL-1 u dozi ovisan, a vodena faza M.hy pregled, ekstrakt nije bio u mogućnosti to učiniti (slika 2c). Kako bi se isključila moguća RNA i /ili onečišćenje DNK u MLAMP, tretirani smo MLAPMs s RNaze i DNase i utvrdili da MLAMP je bio glavni sastojak za IL-1 indukcije (Slika S2). Pregled

To je izvijestio da je MLAMP uglavnom aktivira NF-kB kroz TLR2 i TLR6 [34], [35]. Stoga, prvo primijenio TLR2 T2.5 neutraliziranje antitijela da blokira signal TLR2, s ConT2 služi kao izotipske kontrole [36]. Kao što je prikazano na Slici 2D, T2.5 potpunosti blokirana lučenje IL-1 p stimulirana TLR2 agonista P3CSK4 ali ne od TLR4 liganda LPS. Važno je, IL-1β iscjedak iz M.hy pregled, zaražene stanice se snažno smanjen za T2.5, što znači da TLR2 bio uključen u MLAMP pokrenuo IL-1 sekrecija u humanih monocita. Zanimljivo, IL-1β iscjedak iz M.hy
zaraženih stanica nije u potpunosti blokiran T2.5 (Slika 2D), koji je sugerirao da TLR2 neovisan signalni put je također uključena u MLAMP pokrenuo IL-1 sekrecija, koja zaslužuje daljnje istraživanje u budućnosti. pregled

M.hy pregled inducira IL-1β Izlučivanje putem aktivacije NLRP3 Inflammasome pregled

Kako bi testirali da li M.hy
inducirana IL-1β izlučivanje putem inflammasome aktivacije, prvo koristi LPS premazati THP-1 izvedenih makrofage da provjerite je li M.hy pregled može aktivirati inflammasome poput ATP ili MSU, koji su poznati aktivatori inflammasome. Kao što je prikazano na slici 3A, M pregled .hy pregled je mogao izazvati IL-1 p oslobađanje u primarnih stanica. Zatim smo ispitali dekolte kaspaze-1 i oligomerizacijom ASC, dva važna odluka za aktivaciju inflammasome. Otkrili smo da je M.hy pregled promovirao dekolte kaspaze-1 i oligomerizacijom ASC (slika 3B), što ukazuje na izravnu aktivaciju inflammasome u M.hy.

Osim toga, mi smo testirali je li M.hy
inducirana IL-1β izlučivanje ovisila je o pojedinim komponentama inflammasome. Prvo, utvrdili smo da je specifični inhibitor kaspaze-1-AC YVAD-CHO smanjio izlučivanje IL-1 u THP-1 stanicama na način ovisan o dozi (Slika 3C). Zatim, kada je specifična shRNA bio zaposlen na šutnju ekspresiju kaspaze-1 i ASC (slika 3D), proizvodnja IL-1β je jako smanjen na M.hy pregled izazov (Slika 3E), što ukazuje da je M.hy
inducirana IL-1β izlučivanje bio ovisan o kaspaze-1 i ASC. pregled

Tada smo testirali je li NLRP3 je potreban za M.hy
inducirana IL-1β izlučivanje. Prvo, otkrili smo da je inhibitor NLRP3 Glybenclamide potisnut M.hy
inducirane IL-1β sekrecije na način ovisan o dozi (Slika 3f) [37]. Kada posebna shRNA bio zaposlen za utišavanje ekspresije NLRP3 (Slika 3G), proizvodnja IL-1β snažno je smanjio na M.hy pregled izazov (Slika 3H), što ukazuje da je M.hy pregled inducirana IL-1β izlučivanje bio ovisan o NLRP3. Ona je dalje potvrđeno pomoću imunoblotinga, u kojoj je kaspaza-1 aktiviranje i IL-1β produkcija su oba NLRP3 ovisne (Slika 3i). Osim toga, mi je nadalje utvrdio da MLAMP je glavna komponenta odgovorna za aktivaciju NLRP3 inflammasome u M.hy pregled (Slika S2C). Osim toga, AIM2 inflammasome je izvijestila da se aktiviraju DNA [38], a otkrili smo da su M.hy pregled, DNA inducirane IL-1β izlučivanje putem AIM2 inflammasome (Slika S3A). Zanimljivo, M.hy
inducirana IL-1β izlučivanje uglavnom ovisi o NLRP3, dok AIM2 je samo djelomično uključeni (Slika S3A). Uzeti zajedno, ovi rezultati jasno su pokazali da M.hy
inducirana IL-1β izlučivanje putem aktivacije NLRP3 inflammasome u humane stanice. Pregled

mehanizmi u podlozi M.hy pregled Pokrenute NLRP3 Inflammasome Aktivacija pregled

Aktivacija NLRP3 inflammasome strane raznih podražaja ovisi o Katepsin B aktivnost, K ^{+ za izbacivanje, ulaska kalcija i /ili stvaranja reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) [11], [ ,,,0],12], [13], [39]. Kako bi istražili mehanizme u podlozi IL-1 izdanje, kao odgovor na M.hy pregled izazov, prvo nanosi Katepsin B-specifični inhibitor CA-074 Me i promatraju značajno ublažavanje IL-1 sekrecija na M .hy
izazov. Pri koncentraciji od 100 uM, CA-074 Me kompletno blokira IL-1β otpuštanje (Slika 4A). Ova inhibicija nije posljedica bilo kojeg toksičnog učinka na stanice kao sekrecije IL-8 u pogođena ovog inhibitora je vrlo blag (Slika 4E). Važno je, kada se stanice tretiraju s katepsina K inhibitora I, smanjenje IL-1 sekrecija nije evidentirana pri svim (Slika 4B i 4F), sugerirajući da je katepsin B aktivnost je posebno uključen u aktiviranju NLRP3 inflammasome tijekom M .hy
izazov. Osim toga, kada smo blokirali K + izbacivanja povećanjem izvanstaničnog K + koncentraciju, IL-1 sekreciju THP-1 stanica nakon M.hy pregled, izazov je bio značajno smanjen u dozi način ovisan o (Slika 4C). Ponovno, nije postojala toksični učinak s KCl kao IL-8 iz istih stanica normalna (Slika 4G). Shvatiti da li dotoka kalcija pomogla inflammasome aktivaciju, dodali smo različite doze EGTA u mediju kulture stanica i otkrili da EDTA tretman blokiran M.hy pregled inducira IL-1 sekrecija u način ovisan o dozi, a nema toksični učinak od EGTA uočeno kao što pokazuje IL-8 produkcije (Slika 4D i 4H). pregled}

Osim toga, mi testirali da li M.hy pregled izazov izazvana ROS generacija u THP-1 stanice , Za ovaj pokus, THP-1 stanice su bile najprije opterećene s redoks-osjetljivi fluorofora DCFDA a zatim izazvane M.hy pregled, ATP je uključen kao pozitivna kontrola. Kao što je prikazano na slici 5A, 16,9% CM-H2DCFDA pozitivne stanice bile su detektirane 30 minuta nakon M.hy pregled tretmana u usporedbi s 1,6% netretiranih stanica. Ovi podaci sugerirao da ROS mogu pridonijeti aktivacije NLRP3 inflammasome odgovor na M.hy pregled izazov. Da biste provjerili tu mogućnost, prethodno tretirane smo THP-1 stanice s ROS inhibitora difeniljodonijev (DPI) za 30 minuta, a zatim izazvao stanica s M.hy pregled prije mjerenja IL-1B proizvodnje 6 sati kasnije. Kao što se očekivalo, DPI dramatično smanjuje M.hy
inducirana IL-1β oslobađanje (Slika 5b). Nedavna studija pokazala je da ROS inhibitor kao što su DPI ukinuti oslobađanje IL-1 u miševa makrofagima inhibiraju ekspresiju NLRP3 gena [40]. Zbog toga smo također pratili razinu mRNA pro-IL-1 i NLRP3 pod DPI liječenja. otkrili smo da DPI značajno smanjuje ekspresiju pro-IL-1 i NLRP3 (slika 5C-D), koji je u skladu s nalazom iz mišjih stanica [40]. Osim toga, mi također ispituje aktivaciju caspase-1 i nađeno je da su niske doze (1 ili 10 uM) u DPI tretman ne utječe na aktivaciju kaspaze-1, a 100 uM DPI inhibirao kaspaze-1 aktiviranje (slika 5e). To je pokazao da u ljudskim stanicama DPI ometa aktivaciju NLRP3 inflammasome putem inhibicije NLRP3 transkripcije, kao i kaspaza-1 aktivnost, kada se primjenjuju visoke doze. Zajedno, ovi podaci ukazuju na to da aktivnost katepsina B, K ^{+ izbacivanja, Ca 2 + priliv i ROS doprinijeli aktivacije NLRP3 inflammasome odgovor na M.hy pregled izazov. Pregled}

M.hy pregled Aktivira NLRP3 Inflammasome In vivo

Kada se miš podrijetlom iz koštane srži dendritičke stanice (BMDCs) su zaražene s M.hy pregled , trajno indukcija IL-1β uočeno (Slika 6A). Daljnji pokusi na BMDCs izolirani iz divljeg tipa (WT) miševa ili miševi za kaspazu-1, ASC ili NLRP3 s M.hy pregled izazov je potvrdila da M.hy pregled indukciju IL 1β je NLRP3 inflammasome ovisna (Slika 6b). Nadalje, sistemska inokulacija M.hy pregled kod WT miševa inducirane IL-1β produkcije u serumu i peritonealni ispirak tekućine (PLF), ali ne u miševa koji nemaju ASC ili NLRP3 (Slika 6C-D). Zanimljivo, bazalna razina IL-1 u AS deficijentnih miševa je očito veći nego kod WT ili NLRP3 deficijentnih miševa, ali podražaj M.hy pregled nije dalje povećati izlučivanje IL-1 u miševe (Slika 6C-D). Zajedno, ovi rezultati potvrdili su da M.hy također
aktivira NLRP3 inflammasome u miševa In vitro pregled i in vivo pregled. Pregled

M. hy pregled inducirane IL-1β Promiče želučane stanica tumora migraciju i invaziju pregled

Navedeni podaci jasno pokazuju da je M.hy pregled bio u stanju izazvati IL-1 p produkciji od urođenih imunoloških stanica kroz NLRP3 inflammasome aktivaciju. Rane studije epidemijske otkriva moguću ulogu mikoplazme u razvoju raka želuca [5]. I Mycoplasma hyorhinis pregled je pokazalo se da potiču migraciju tumorskih stanica, invaziju i metastaziranje in vitro
i in vivo pregled [41]. Mi smo pretpostavili da može postojati neki drugi mehanizam za ovu promociju, a to je M.hy pregled može promovirati želučane karcinogeneze i /ili metastaza promicanjem IL-1 p produkciji. A mi je potvrdio da je M.hy
promovira želučane migraciju stanica raka i invaziju (Slika S5). Budući M.hy pregled je pokazano da inficira stanice raka želučanog ([41] Slika S4), tako je moguće da se M.hy pregled mogu inducirati aktivaciju inflammasome u stanicama raka izravno. Međutim, bez aktivacije inflammasome nije detektiran u stanicama karcinoma želuca (Slika S6). Pregled

sljedeći određuje učinak humani rekombinantni IL-1 (rIL-1B) na želučanu stanica raka karcinogeneze u testu formacije kolonije koje otkrila je da je rIL-1β nije utjecala na širenje raka želuca stanične linije MGC-803 (Slika S7). Budući da IL-1β bio prijavljen za promicanje metastaze drugih tumora [18], provjerili smo učinke rIL-1B o migraciji i invaziji MGC-803 stanica. Naši rezultati su pokazali da je MGC-803 migraciju i invaziju su pojačana sa rIL-1B liječenja (Slika 7A i 7c), dok je tretman s rIL-18 nije pokazao nikakav učinak (slika 7b i 7d). Dalje, tretira se ove želučane stanice raka supernatantima kultura iz M.hy
izazvao THP-1 izvedenih makrofaga ili makrofaga uz odsutnost NLRP3, ASC i kaspaze-1 za migracije i invazije testu. Naši rezultati su pokazali da su supernatanti kultura iz M.hy
izazvao otimati makrofaga jako poboljšane migracija i invazija želučanih stanica raka, a supernatanti kultura iz NLRP3, ASC ili kaspaze-1 obaranje makrofagi nisu, vjerojatno zbog smanjenog izlučivanja IL-1 (Slika 8A i 8C). Ova poboljšana migracija i invazija MGC-803 stanica je ukinuta tretiranjem stanica s anti-IL-1 Mab (Slika 8B i 8D). Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju da M.hy
inducirane migracije i invaziju želučanog raka stanične linije MGC-803 promicanjem IL-1 sekreciju iz monocita stanica. Štoviše, naši podaci pokazuju da M.hy
inducirana aktivacija inflammasome može promovirati M.hy pregled odgovor (Slika S8), što može stvoriti pozitivnu povratnu informaciju i na kraju dovodi do kroniciteta bolesti.

Rasprava pregled

mikoplazme se razlikovali od drugih bakterija po maloj veličini, minuta genoma i nedostatak stanične stijenke. Mnogi mikoplazme uspostaviti kolonizacije i infekcije putem pridržavanje domaćin tkiva. Budući da je njihova dinamična površina arhitektura antigenski i funkcionalno svestran, mikoplazme su sposobni izbjegavanja imunog sustava domaćina napad i prilagodbe mnogih staništa i uzrokovati kronične bolesti [32]. Od identifikacije M.hy pregled od svinjske 1962., malo istraživanje je provedeno na ovom patogena dok je utvrđeno da je povezan s nekoliko oblika raka kod ljudi [5], [41], [42], [ ,,,0],43]. U novije vrijeme, znanstvenici su otkrili da M.hy pregled protein P37 je odgovoran za promicanje stanica raka invazivnosti i metastaziranje [30], [44]. Osim ove izravne mehanizma, ovaj mikrob također može izazvati tumorigenezi ili metastaza neizravno putem lokalne kroničnog upalnog procesa. Poznato je da IL-1β je važan pro-upalni citokin koji potiče rast stanica raka debelog crijeva i poboljšava invazivnost i metastaziranje B16 stanica melanoma [19], [45]. Prekomjerna ekspresija IL-1B je nađeno da inducira želuca upala i rak kod miševa [19]. U ovoj studiji istraživali smo da li je NLRP3 inflammasome, koji kontrolira IL-1 sazrijevanje, aktivirana je M.hy Netlogu, i da li je ta aktivacija može doprinijeti M.hy
povezan želučane metastaziranje , Naši rezultati pokazuju da je M.hy pregled aktivirao NLRP3 inflammasome In vitro pregled i in vivo pregled, te promicanje želučane migracije stanica raka i invaziju M .hy pregled je bio ovisan o aktivaciji NLRP3 inflammasome. Osim NLRP3, otkrili smo da M.hy pregled, DNA također aktivirao AIM2 inflammasome, ali MLAMP aktivacija NLRP3 bila dominantna komponenta za IL-1 indukcije M.hy.

nedavno je objavljeno da je acilirana lipopeptid od topline-ubili mikoplazme Acholeplasma laidlawii pregled (HKAL) inducirana IL-1β proizvodnje kroz NLRP7 inflammasome u ljudskim stanicama, dok su ukupni HKAL inducirana IL-1β izlučivanje bio djelomično NLRP3 ovisna [46], što znači da više inflammasomes može aktivirati određeni mikoplazme. Naši podaci ne isključuje moguću uključenost NLRP7 u M.hy
inducirana IL-1β proizvodnje, ali M.hy pregled uglavnom aktivirao NLRP3 inflammasome, jer je IL-1β izlučivanje bilo gotovo u potpunosti ukinuta u NLRP3 ušutkao stanica (Slika 3 sata i 3i). pregled

Rane studije predložio da ROS aktivirala NLRP3 inflammasome aktiviranjem kaspaze-1 [47]. Međutim, nedavno istraživanje je pokazalo da inhibitori ROS ometali transkripciju IL-1 i NLRP3, ali ne utječe aktivacija caspase-1 u mišjih stanica [40]. U našoj studiji, iako ROS inhibicija s niskom dozom DPI (10 uM) značajno smanjuju proizvodnju IL-1 nakon M.hy pregled izazov, to nije inhibira kaspaze-1 dekolte, na marker za inflammasome aktivacije. Međutim, kada se primjenjuju visoke doze DPI (100 m), kaspaze-1 cijepanje je jasno inhibirana (Slika 5E), što sugerira da visoka doza DPI može potisnuti u zbor inflammasome kompleksa, iako ne možemo isključiti mogućnost da je taj učinak moglo su rezultirali iz NLRP3 mRNA ukidanje odnosu na početne vrijednosti (Slika 5D). Vrlo je vjerojatno da je inhibitor ROS mogu interferirati s obje pro-IL-1B sinteze i kaspaza-1 aktivacije. Pregled

Kako M.hy pregled promovira ROS proizvodnju u makrofage i dalje izmiče. Nedostatak stanične stijenke od M.hy pregled neposredan dodir mikoplazma membranskog i membranom stanice domaćina, a taj kontakt može dovesti do stapanja mikoplazme s eukariotske stanice domaćina. To fuzija može ne samo dovesti do Mycoplasma komponente isporuku u stanicu domaćina, ali također se omogući umetanje komponente mikoplazma membranu u membranu eukariotske stanice domaćina. Nedavno, M.hy pregled membrane je utvrđeno da posjeduju fosfolipaze A (PLA) koji mogu biti uključeni u proces plazma membrane ometanja koja se javlja nakon invazije stanica domaćina [48], [49]. Tijekom tog procesa, stanice domaćini mogu proizvesti ROS. Bilo bi vrijedno istražuju je li PLA je potreban za M.hy
izazvana ROS proizvodnju i IL-1 sekreciju. Pregled

Kao što pokazuje našim podacima, lizosomskog rupture, K ^{+ Istjecanje, Ca 2 + priliv i ROS su svi uključeni u M.hy
inducirana aktivacija NLRP3. Kao što je objavljeno prije, K + istjecanja i fagolizosomalnu rupture mogu izazvati Ca 2 + priliv, dok Ca 2 + Priliv može uzrokovati disfunkciju mitohondrija, što rezultira otpuštanjem oksidira mitohondrijske DNA (mtDNA) Into the citosolu gdje se vežu i aktivirati NLRP3 inflammasome [9], [12]. Mitohondriji se čini da djeluje kao središnje čvorište za integraciju različitih signala osjeća NLRP3, ali relativni doprinos ROS i mtDNA za aktivaciju NLRP3 inflammasome još uvijek nije jasno do sada [9]. Pregled}

Iako je M .hy pregled nije jako zarazan, može utvrditi kronične infekcije. Postupnim i progresivnim interakciji sa stanicama domaćinima, to izaziva kromosomske nestabilnosti i malignu transformaciju, čime se potiče rast tumora, migraciju ili invaziju [50], [51]. M.hy pregled P37 protein promovira želuca stanica raka, karcinom prostate i melanom staničnih linija invazivnosti [30], [31]. Osim toga, upalni mikro-okruženje kao što je proizvodnja IL-1 može doprinijeti ovom postupku [19]. Naše istraživanje pokazalo je da M.hy
inducirana IL-1β promovira migraciju i invaziju želučanih stanica raka, a M.hy
inducirana IL-18 nije doprinio migracije i invazije želučane stanice raka, što je razlikuje od drugih izvješća [26], [27]. Moguće objašnjenje je da IL-18 može promovirali želučane stanice raka migraciju i invaziju preko regulaciju CD70, CD44 i VEGF ekspresije u stanice imunološkog sustava, koja zaslužuje naše daljnje istraživanje [26]. Drugo objašnjenje moglo bi biti da je doza rIL-18 se koristi (150 ng /ml) je puno veći nego što smo koristili [27]. Štoviše, IL-1β promovirala migraciju i invaziju stanica raka želučanog može biti posredovan pomoću matrične metaloproteinazne-9 (MMP9) u drugi pretražuju opisano [52]. Međutim, da biste dobili izravne i čvrste dokaze i odgovarajuće mehanizme o vezi između aktivacije NLRP3 inflammasome potaknuta M.hy
i želuca metastaze raka, odgovarajućih životinjskih modela kao što su in vivo
invazija tumora za ispitivanje [53] i strpljivi studije su potrebne za daljnje studije u budućnosti. pregled

Materijali i metode

Kultura Cell pregled

THP-1 stanice, PMA-inducirana makrofagi i rak želuca stanica MGC-803 bili su održavani u RPMI 1640 mediju s osnovnim dodataka. Humani monociti su izolirani Percol TM centrifugiranjem u gradijentu gustoće (GE Healthcare, Bio-znanosti, Švedska) iz ljudskih mononuklearnih stanica periferne krvi (PBMC) dobivene iz Šangaja Blood Center (Shanghai, Kina). Pregled

M.hy pregled Procijedite i PCR za detekciju pregled

M.hy pregled, soja se koristi u našoj studiji je dobiven iz kontaminirane stanične kulture. detekcija mycoplasm provodi se kroz dvije runde PCR u mediju za kulturu stanica [54]: Prvo, PCR izvoditi s četiri primerima 5'-ACACCATGGGAGYTGGTAAT-3 ', 5'-CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT-3', 5'-AAAGTGGGCAATACCCAC GC-3 ', 5'-TCACGCTTAGATGCTTTCAGCG-3 'u kojem su stanice kultivirane medij kao predložak. Drugo, uzeti 1 ul gornjeg PCR proizvoda kao šablone i pokrenuti PCR s primerima 5'-tri GTGSGGMTGGATCACCTCCT-3 ', 5'-GCATCCACCAWAWACY CTTT-3', 5'-CCACTGTGTGCCCTTTGTTCCT-3 '. Prva i druga PCR radi pod istim uvjetima ciklusa. Zatim smo sekvencirana PCR produkt i dobiveno slijedeće sekvence: ACTCTTACTTAATTTAAAAGTTAATACAACTTTAATATT GCCTATTATTGCTAAAGATAAATATCTTAAGGTATTTTAATATTGGTAATCTATTTTAGAAATTTAATTTAAAAATTAAACTCGGTTATAAAAAAGATCGTTGAAATAATAAATATGAAGTTAATCATATTGTTATTTGCTATTCAGTTTTCAAAGAACTATAATTGAGAACTTAAAGCTCTCAAAACTAGACACGAATCGATTATGTAATAAGTCAATTAAGACTAACGGAAAGCGGAAAAAGAAGGTGATCCGTCCCCACG. Do eksplozije u NCBI bazi podataka, dobili smo informaciju da je mikoplazma M.hy pregled. Može biti SK76, GDL-1 ili MCLD soj. Pregled

M.hy pregled Kultura, DNA Vađenje i priprema MLAMP pregled

M.hy pregled bio uzgaja u modificirani SP-4 medij koji sadrži 20% novorođenčadi goveđeg seruma, 10% ekstrakta kvasca, 1% glukoze, 0,00024% phenolsulfonphthalein i 1000 IU /ml penicilina. Ekstrakcija DNA iz M.hy Netlogu provedeno je u skladu s uputama s reagensima koje Shanghai Lifefeng Biotechnology Co., Ltd. M.hy pregled određena je kao promjena boje jedinice (CCU) po mililitar kao što je opisano [55]. Ekstrakcija MLAMP provodi se kao što je opisano [34]. Pregled

realnom vremenu PCR pregled

NLRP3 i IL-1β mRNA određene su kvantitativno u realnom vremenu PCR. Relativno kvantificiranje gena su normalizirani na endogenog kontrole ß-aktin putem formule [2 ^{-ΔCt (ciljni gen-β-aktin)]. Primeri korišteni bili su: Homo sapiens (HS) IL-1β, 5'-CACGATGCACCTGTACGATCA- (naprijed) 3 ', 5'-GTTGCTCCATATCC TGTCCCT- (reverse) 3'; P-aktin, 5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG- (naprijed) 3 ', 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC- (reverse) 3'; NLRP3, 5'-AAGGGCCATGGACTATTTCC- (naprijed) 3 ', 5'-GACTCCACCCGATGACAGTT- (natrag) 3'. M.hy pregled, DNA primjeraka dertermined kvantitativnom realnom vremenu PCR s metodologijom standardne krivulje za apsolutnim brojkama kopiranja. Specifični početnici za M.hy pregled su:. 5'CGATTCGTGTCTAGTTTTGAG - (naprijed) 3 ', 5'ATTGCCTATTATTGCTAAAG - (natrag) 3' pregled}

ELISA pregled

analizirani su supernatanti iz kulture stanica, mišjem serumu i miša peritonealni ispirku za citokina IL-1, IL-18, IL-6 ili izlučivanje IL-8 ELISA-om (BD Biosciences), u skladu s uputama proizvođača. pregled

generiranje THP-1 stanica koje eksprimiraju shRNAs ciljanje genima od interesa Netlogu

shRNA vektora protiv ljudskog NLRP3, kaspaze-1 i ASC, a njihovi otimati vektora su darovi od dr Jürg Tschopp [56]. O generaciji THP-1 stanica koje eksprimiraju shRNAs ukratko nt GATGCGGAAGCTCTTCAGTTTCA ljudskog ASC kodirajuće sekvence, nt CAGGTTTGACTATCTGTTCT ljudske sekvence NLRP3 kodiranje, nt GTGAAGAGATCCTTCTGTA od 3 'UTR humanog caspase-1 su umetnuti u pSUPER. Pol III promotor shRNA kazete iz tih vektora i iz laminA /C specifična kontrola pSUPER konstrukt ubačeni su u lentivirusni vektor pAB286.1, derivat phr koji sadrži SV40-puromicin acetil transferaza kazetu stanice radi odabira antibiotike.

• PLoS ONE: Negativna Node Točka Poboljšanje Prognostički Predviđanje za sedmo izdanje TNM klasifikacije za želučani Cancer
• PLoS ONE: Prirodoslovni malignih Bone Disease u rak želuca: Konačni rezultati za multicentrično koštane metastaze Survey