PLoS ONE: Mycoplasma hyorhinis Aktyvuoja NLRP3 Inflammasome ir skatina migracija ir invazija skrandžio vėžio ląsteles

Anotacija

Fonas

, Mycoplasma hyorhinis
( M.hyorhinis, M.hy
) yra susijęs su raidos skrandžio ir prostatos vėžio. NLRP3 inflammasome, baltymų kompleksas kontroliuoti brendimą svarbių PRO-uždegiminių citokinų interleukino (IL) -1β ir IL-18, taip pat dalyvauja Tumorigenesis ir metastazių įvairių vėžio.

Metodologija /Pagrindinės išvados

Jei išsiaiškinti, ar M.hy
skatinamas naviko vystymąsi per inflammasome aktyvavimo, mes analizuojami monocitų IL-1β ir IL-18 gamybos nuo M.hy
įspėtas. Veikiamas M.hy
, žmogaus monocitų eksponuojami greitą ir patikimą IL-1β ir IL-18 sekreciją. Mes taip pat nustatė, kad lipidų susijęs membranos baltymo (lempos) iš M.hy
buvo atsakingas už IL-1β indukcija. Taikant konkurenciniai inhibitoriai, genų specifinis shRNR ir genų skirta pelėms, mes patikrinti, kad M.hy
sukeltas IL-1β sekrecija buvo NLRP3 priklausomas in vitro parsisiųsti ir vivo
, Katepsino B veikla, K ^{+ ištekėjimo Ca 2 + antplūdžio ir ROS gamyba buvo visi reikalingi NLRP3 inflammasome aktyvavimo M.hy
. Svarbu tai, kad jis yra IL-1β bet ne IL-18 pagamintas iš makrofagų juslėmis M.hy
skatinama skrandžio vėžio ląstelių migraciją ir invazija.}

Išvados

Mūsų duomenys rodo, kad iš NLRP3 inflammasome aktyvacijos M.hy pervežimas gali būti susijęs su jo skatinimo skrandžio vėžio metastazių ir kovos M.hy
terapija arba apriboti NLRP3 signalizacijos gali būti veiksmingas būdas kontroliuoti skrandžio vėžio eigą

nurodomoji dalis:. Xu Y Li O Chen W Yao X Xing Y Wang X et al., (2013), Mycoplasma hyorhinis
Aktyvuoja NLRP3 Inflammasome ir skatina migracija ir invazija skrandžio vėžio ląsteles. PLoS ONE 8 (11): e77955. Doi: 10,1371 /journal.pone.0077955

redaktorius: Suresh Yenugu universiteto Hyderabad, Indija

Įstojo: Birželis 5, 2013 m Priimtas rugsėjo 6, 2013 m Paskelbta: Lapkričio 6, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Xu et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė dotacijų iš 100 Talentų programa Kinijos mokslų akademijos Gamtos mokslų fondo Kinijos (91029707, 31170868), Šanchajus Gamtos mokslų pamatas (11ZR1442600), "Novo Nordisk", CAS tyrimų fondas, SA-finansų įstaigos Mokėjimo stipendijų programa, taip pat subsidijos iš nacionalinių pagrindinių programas infekcinė liga (2012ZX10002007-003). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

mikoplazmos pleomorfinės, sienų nemokama, prokariotų organizmai, kurie gyvena arba ant eukariotinių ląstelių membranas arba ląstelių viduje, ir jie yra mažiausi mikroorganizmai, galintys savarankiškai daugintis [1]. Iki šiol, bent jau 16 mikoplazmos rūšys buvo išskirtos iš žmonėms [2]. , Mycoplasma hyorhinis
( M.hy
) buvo laikoma ne patogeniškas žmonėms, nes ji paprastai užkrečia kiaules pirmaujanti kvėpavimo takų ligos ir uždegimas krūtinės ir sąnarių [3], [4] , Tačiau kaupti duomenys rodo, kad M.hy
infekcija žmonėms nėra sukelti klinikinius rezultatus. M.hy
buvo rasta 56% skrandžio karcinoma, 55% storosios žarnos karcinoma, ir 52,6% nuo plaučių karcinoma biopsijų [5]. Be to, 36% vyrų su gerybine prostatos hiperplazija (GPH), ir 52% vyrų, sergantiems prostatos vėžiu yra M.hy
serumo teigiamas. Šie klinikiniai duomenys rodo galimą ryšį tarp M.hy
ekspozicija su skrandžio, storosios žarnos, plaučių ir prostatos vėžio [5], [6].

Upon mikrobų infekcijos, priimančiosios atpažinimo receptorius ( PRRS), pavyzdžiui, TLRs pajusti patogenų ir iššauktų Pro-uždegiminių citokinų, tokių kaip pro-IL-1β ir pro-IL-18 per NF-κB aktyvavimo sintezę. Tuo pačiu metu, kitą PRRS įskaitant NLRP3 grupė įdarbinti adapteris baltymų ASC ir veda į kaspazės-1 aktyvacija, kuris yra veiklioji proteazės, kad skaldant pirmtakas forma citokinų, įskaitant pro-IL-1β ir pro-IL-18 į brandžios, išskiriami forma [7]. Patogenai ar sudėtingas agentai sukelti kalio efliuksą, mitochondrijas žalą, mitochondrijas DNR spaudai, ROS gamybą, ląstelėje kalcio padidėjimą arba akytos ciklinio AMP sumažėjo įgimtų imuninių ląstelių, kurios yra visų dalyvaujančių kaspazės-1 aktyvavimo [8], [9], [10 ], [11], [12], [13]. Šio proceso metu NLRP3, ASC ir pro-kaspazės-1 forma molekulinis platforma vadinama inflammasome. Iki šiol buvo nustatyta keletas Inflamasomos skaičius, iš jų, NLRP3 inflammasome buvo nustatyta, susijusios su naviko vystymosi [14], [15], nors ginčas egzistuoja iš įvairių modelių [16], [17]. Vis dėlto, IL-1β buvo pranešė, skatinti auglio ląstelių augimą ir metastazes, sukeliant kelias Pro-neišplitusios genus, pavyzdžiui, matrikso metaloproteinazių ir endotelio adhezijos molekulių, taip pat TGF-beta, chemokinus ir augimo faktorių [18]. Be Korėjos gyventojų, padidėjusios gleivinės IL-1β lygio ir homozigotiškumo derinys IL-1β -31T vieno nukleotido polimorfizmo (SNP) yra tiek susijęs su padidėjusia rizika skrandžio vėžio [18]. Be to, An et al. nustatė, kad skrandžio-konkreti išraiška žmogaus IL-1β transgeninių pelių buvo spontaniškas skrandžio uždegimas ir vėžio [19], taip pat rodo, kad IL-1β gali skatinti žmogaus skrandžio kancerogenezės. Priešingai, IL-18 pagerina NK ląstelių aktyvumą, sumažina tumorigenezei, indukuoja apoptozę ir slopina angiogenezę sustiprinimui auglio ląstelių daryti antinavikinį poveikį, [20], [21]. Be to, buvo nustatyta, jog netinkamas gamyba IL-18 prisidėti prie vėžio patogenezės ir gali turėti įtakos klinikinei baigčiai pacientų [22]. IL-18 buvo pranešta skatinti matricos metaloproteinazės-9 gamybą, todėl padidėja migracijos ir invazijos vainikinių arterijų lygiųjų raumenų ląstelių ir HL-60 mieloleukemija ląstelių [23], [24]. Ji taip pat buvo pranešė, kad serumo IL-18 lygis skrandžio vėžiu sergančių pacientų grupėje buvo žymiai didesnis nei ta, skrandžio opa pacientų grupės [25] ir IL-18 gali padidinti metastazių ir imuninę neištrūktų į skrandžio vėžio per žemyn reguliavimo CD70 ir priežiūra CD44 žmogiškųjų skrandžio vėžio ląstelių linijos NVI-N87 ir SNU16 [26]. Jis taip pat yra svarbus tarpininkas VEGF padidinto migracijos žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų SNU-601 [27]. Pirmiau pateiktos išvados rodo, kad , Mycoplasma hyorhinis
gali skatinti migracijos ir invazija skrandžio vėžio ląstelių aktyvavimo inflammasome.

Iki šiol, platus spektras mikrobų, įskaitant virusus, bakterijas, grybelius ir pirmuonių buvę identifikuoti aktyvuoti NLRP3 inflammasome [28]. Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad , Mycoplasma pneumoniae
taip pat galėjo sukelti IL-1β gamybą žmogaus ląstelių [29]. Tačiau, ar M.hy
, kuris yra svarbus veiksnys skrandžio vėžio išsivystymo kaip minėta [5], [30], [31], aktyvina NLRP3 inflammasome ir ar šis aktyvavimo prisideda prie skrandžio vėžio plėtra lieka nežinomi. Šiame tyrime mes nustatėme, kad M.hy
sukėlė IL-1β sekreciją į NLRP3 inflammasome priklausomu būdu, ir gautas IL-1β sukelta migracija ir invazija skrandžio vėžio ląsteles.

rezultatai

M.hy
paleidiklius IL-1β ir IL-18 gamyba THP-1 ląstelių

Norėdami nustatyti, ar M.hy
skatina IL -1β gamyba iš įgimtų imuninių ląstelių, mes stebimi brandus IL-1β lygį žmogaus monocitinę ląstelių linijos THP-1 ląstelių užginčytos su skirtingomis sumomis, M.hy
. Šio eksperimento metu, stiprus indukcija IL-1β priklausomai nuo dozės priklausomu būdu buvo stebimas (1a pav). Be to, mes matuojamas PRO-IL-1β iRNR kiekį ląstelėse ir brandžių IL-1β baltymų koncentracijos Kultūra nuopile skirtingais laiko momentais po M.hy
įspėtas. Buvo pastebėta, kad IL-1β iRNR lygiui pasiekė 3 valandas po užkrėtimo (1B pav) ir brandaus IL-1β (1C pav) ir IL-18 (1D pav) baltymų koncentracijos pasiekė 12 valandų po užkrėtimo. Be to, THP-1 gautus makrofagai taip pat eksponuojami tvirtą sekreciją IL-1β, IL-18, taip pat kitus uždegiminius citokinus, tokių kaip IL-6 ir IL-8 (1E figūra, S1 paveiksle). Norėdami patvirtinti pirmiau išvadas THP-1 ląstelių liniją, mes išnagrinėjo IL-1β gamybą pradinėse žmogaus monocitų sveikų donorų juslėmis, M.hy
, kurioje IL-1β taip pat buvo stipriai sukeltas (1F paveikslas) , Šie duomenys rodo, kad M.hy
sukėlė tvirtą IL-1β ir IL-18 sekreciją iš žmogaus kaulų čiulpais ląsteles.

ŽIBINTAS kilęs iš M.hy
yra atsakingas už IL -1β indukcija per TLR2

Kitas mes ištirti, ar buvo reikalaujama replikacija M.hy
IL-1β gamybos monocitų. Kaip parodyta 2A pav M
.hy
inaktyvuoja šildymo arba ultravioletinių (UV) gydymo sukeltas kiek IL-1β sekrecija iš THP-1 ląstelių kaip gyvą M .hy
. Tai rodo, kad tam tikras termiškai ir UV- atsparus komponentas M.hy
buvo atsakingas už indukcijos IL-1β sekrecijos. Lipidų susijęs membranos baltymo (lempos) yra gausiai išreiškė remiantis M.hy pervežimas [32] paviršiaus, o ankstesnė tyrimas nustatė, kad membrana lipoproteinų iš kitų Mycoplasma rūšys sukeltas IL-1β sekreciją [33]. Mes taip spėliojo, kad M.hy
kilęs LEMPOS (MLAMP) gali būti atsakingas už IL-1β indukcijos THP-1 ląstelių. Mes tada išgaunamas LAMP iš M.hy
(2b pav) ir išbandė MLAMP gebėjimą sukelti IL-1β sekreciją THP-1 ląstelių. Mes nustatėme, kad MLAMP aiškiai sukeltas sekreciją IL-1β A dozės priklausomu būdu, o vandeninė fazė M.hy
ekstraktas nebuvo suteikta galimybė tai padaryti (2c pav.) Norėdami pašalinti galimą RNR ir /arba DNR užteršimo MLAMP, mes gydė MLAPMs su RNaze ir DNaze ir nustatė, kad MLAMP buvo pagrindinis komponentas IL-1β indukcijos (S2 pav.)

Buvo pranešta, kad MLAMP daugiausia aktyvuota NF-κB per TLR2 ir TLR6 [34], [35]. Todėl mes pirmą kartą pritaikė TLR2 neutralizuojančių antikūnų T2.5 blokuoti TLR2 signalą, su ConT2 tarnauja kaip izotipo kontrolės [36]. Kaip parodyta 2D paveiksle, T2.5 visiškai užblokuotas IL-1β sekreciją stimuliuoja TLR2 agonisto P3CSK4 tačiau ne pagal TLR4 ligandas LPS. Svarbu tai, kad IL-1β sekrecija iš M.hy
infekuotų ląstelių buvo stipriai sumažintas T2.5, nurodant, kad TLR2 dalyvavo MLAMP sukėlė IL-1β sekreciją žmogaus monocitų. Įdomu tai, kad IL-1β sekrecija iš M.hy
infekuotų ląstelių nebuvo visiškai užblokuotas T2.5 (2d pav), kurie leidžia manyti, kad TLR2 nepriklausomas signalizacijos kelias taip pat dalyvavo MLAMP sukėlė IL-1β sekreciją, kurie nusipelno tolesnio tyrimo ateityje.

M.hy
skatina IL-1β Sekrecija per aktyvavimo NLRP3 Inflammasome

Norėdami patikrinti, ar M.hy
sukeltas IL-1β sekrecijos per inflammasome aktyvavimo, mes pirmą kartą panaudotas LPS gruntuotas THP-1 gautus makrofagus patikrinti, ar M.hy
galite įjungti inflammasome kaip ATP ar MSU, kuri yra žinomos inflammasome aktyvatorių. Kaip parodyta 3A pav M
.hy
galėjo sukelti IL-1β išsiskyrimą gruntuotas ląsteles. Kitas mes išnagrinėjo kaspazės-1 ir oligomerizuoti ASC skilimo, du svarbūs virimo aparatai dėl inflammasome aktyvacijos. Mes nustatėme, kad M.hy
skatino kaspazės-1 ir oligomerizuoti ASC (3b pav) skilimo, nurodant tiesioginį aktyvavimo inflammasome M.hy.

Be to, mes patikrinome, ar M.hy
sukeltas IL-1β sekrecija buvo priklausoma nuo tam tikrų inflammasome komponentų. Pirma, mes nustatėme, kad konkretus kaspazės-1 inhibitorius AC-YVAD-CHO sumažėjo IL-1β sekreciją THP-1 ląstelių priklausomai nuo dozės priklausomu būdu (Fig.3C). Be to, kai konkretus shRNR dirbo nutildyti kaspazės-1 ir ASC (3D paveikslas) išraišką, IL-1β gamyba labai sumažėjo nuo M.hy
iššūkis (3E paveikslas) rodo, kad M.hy
sukeltas IL-1β sekrecija buvo priklausoma nuo kaspazė-1 ir ASC.

Tada mes patikrinome, ar NLRP3 reikėjo M.hy
sukeltas IL-1β sekreciją. Pirma, mes nustatėme, kad NLRP3 inhibitorius Glybenclamide slopino M.hy
sukeltas IL-1β sekreciją dozės priklausomu būdu (3F pav) [37]. Kai konkretus shRNR dirbo nutildyti iš NLRP3 (3G pav) išraišką, IL-1β gamyba labai sumažėjo nuo M.hy
iššūkis (3H paveikslas) rodo, kad M.hy
sukeltas IL-1β sekrecija buvo priklausoma nuo NLRP3. Tai dar kartą patvirtino munoblotingu, kurioje kaspazės-1 aktyvavimo ir IL-1β gamyba abu NLRP3 priklausomos (3i paveikslą). Be to, mes taip pat nustatė, kad MLAMP buvo pagrindinis komponentas atsakingas už NLRP3 inflammasome aktyvavimo M.hy
(S2C paveikslą). Be to, AIM2 inflammasome buvo pranešta, kad aktyvuoja DNR [38], ir mes nustatėme, kad M.hy
DNR sukeltas IL-1β sekrecijai AIM2 inflammasome (S3A pav.) Įdomu tai, kad M.hy
sukeltas IL-1β sekrecija buvo daugiausia priklauso nuo NLRP3, o AIM2 buvo tik iš dalies dalyvauja (S3A pav.) Kartu paėmus, šie rezultatai aiškiai parodė, kad M.hy
sukeltas IL-1β sekreciją per aktyvavimo NLRP3 inflammasome žmogaus monocitine ląsteles.

mechanizmus, sukeliančius M.hy
sukėlė NLRP3 inflammasome aktyvinimas

aktyvinimas NLRP3 inflammasome pagal įvairius dirgiklius priklauso nuo katepsino B veikla, K ^{+ ištekėjimo, kalcio antplūdžio ir /ar gamybos reaktyviųjų deguonies formų (ROS) [11], [ ,,,0],12], [13], [39]. Ištirti mechanizmus, sukeliančius IL-1β spaudai reaguojant į M.hy
iššūkis, mes pirmą kartą taikomos katepsino B specifinis inhibitorius CA-074 Aš ir pastebėjo didelį slopinimas IL-1β sekrecija ant M .hy
iššūkis. Esant 100 mikromolių koncentracijos, CA-074 man visiškai užblokuotas IL-1β spaudai (4a paveikslas). Šis slopinimas buvo ne dėl jokio toksinio poveikio į ląsteles kaip IL-8 sekrecijos susijusio su šia inhibitoriaus buvo labai lengvas (4E pav). Svarbu tai, kad, kai ląstelės buvo gydomi katepsino K inhibitoriais Aš, IL-1β sekrecijos sumažėjimas nebuvo akivaizdu, ne visiems (4B ir 4F paveikslą), tai rodo, kad katepsino B veikla buvo specialiai įtrauktas į NLRP3 inflammasome aktyvavimo M per .hy
iššūkis. Be to, kai mes užblokuotas K + ištekėjimo didinant ekstraląsteliną K + koncentracija, IL-1β sekreciją pagal THP-1 ląstelių upon M.hy
iššūkis buvo žymiai sumažintos dozės priklausomu būdu (4C pav.) Vėl, nebuvo toksinis poveikis iš KCl kaip IL-8 gamybos iš tų pačių ląstelių buvo normalus (4G pav). Norėdami išsiaiškinti, ar kalcio patekimą padėjo inflammasome aktyvavimo, mes pridėjome įvairių dozių EGTA į ląstelių kultūros terpės, ir nustatė, kad EGTA gydymas užblokuotas M.hy
indukuotų IL-1β sekreciją dozės priklausomu būdu, ir nėra toksiškas poveikis iš EGTA buvo pastebėta, kaip matyti iš IL-8 gamybą (4d pav ir 4H).}

Be to, mes patikrinome, ar M.hy
iššūkis sukeltas ROS susidarymas THP-1 ląstelių , Dėl šios tyrimą, THP-1 ląstelės buvo pirmą kartą buvo pakrautas su redokso jautrus fluoroforo DCFDA ir tada ginčijo su M.hy
, ATF buvo įtrauktas kaip teigiamos kontrolės. Kaip parodyta 5A paveiksle, 16,9% CM-H2DCFDA teigiamų ląstelių buvo aptikta 30 minučių po M.hy
gydymas, palyginti su 1,6% neapdorotų ląsteles. Šie duomenys rodo, kad ROS gali prisidėti prie NLRP3 inflammasome aktyvavimo reaguojant į M.hy
įspėtas. Norėdami patikrinti šią galimybę, mes iš anksto apdorojamas THP-1 ląstelių ROS inhibitorių diphenyliodonium (dpi) 30 minučių, tada ginčijo ląsteles M.hy
Prieš matuojant IL-1β gamybos vėliau 6 val. Kaip ir tikėtasi, DPI dramatiškai sumažino M.hy
sukeltas IL-1β spaudai (5b pav.) Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad ROS inhibitorius, pavyzdžiui, DPI panaikinta IL-1β išsiskyrimą pelės makrofagų slopindamas NLRP3 genų ekspresiją [40]. Todėl mes taip pat stebėjo iRNR lygio PRO-IL-1β ir NLRP3 pagal DPI gydymą. Mes nustatėme, kad DPI ženkliai sumažino PRO-IL-1β ir NLRP3 (pav 5C-D) išraišką, kuri buvo suderinta su išvada nuo pelių ląstelių [40]. Be to, mes taip pat nagrinėjo kaspaze 1 aktyvacijos ir nustatė, kad mažos dozės (1 arba 10 mkm) ir DPI gydymo neturėjo įtakos kaspazės-1 aktyvavimo o 100 mkm iš DPI slopinamas kaspazės-1 aktyvinimas (5E pav). Tai įrodo, kad žmogaus ląstelėse DPI įsikišo NLRP3 inflammasome aktyvavimo slopindami NLRP3 transkripcija taip pat kaspazės-1 aktyvumui, kai buvo taikoma didelė dozė. Bendrai, šie duomenys rodo, kad katepsino B veikla, K ^{+ ištekėjimo Ca 2 + antplūdžio ir ROS prisidėjo prie NLRP3 inflammasome aktyvavimo reaguojant į M.hy
įspėtas.}

M.hy
Aktyvuoja NLRP3 Inflammasome vivo

pelių kaulų čiulpų kilęs dendritinės ląstelės (BMDCs) buvo užsikrėtę M.hy
, ilgalaikis IL-1β indukcija buvo pastebėta (6a pav.) Daugiau eksperimentai BMDCs išskirti iš laukinio tipo (WT) pelių ar peles už kaspazė-1, ASC ar NLRP3 su M.hy
iššūkis patvirtino, kad M.hy
indukcija IL 1β buvo NLRP3 inflammasome priklausoma (6b pav.) Be to, sisteminė Sėjimas M.hy
WT pelių sukeltų IL-1β gamybą serume ir pilvaplėvės plovimas skysčio (PIF), bet ne pelių trūksta ASC ar NLRP3 (pav 6C-D). Įdomu tai, kad bazinių lygis IL-1β į ASC nepakankamo pelių buvo aiškiai didesnis nei, kad WT arba NLRP3 trūkumas pelių, bet iššūkis su M.hy
nebuvo toliau didinti IL-1β sekreciją tokių pelių (pav 6C-D). Apibendrinant, šios išvados patvirtino, kad M.hy pat
aktyvuota NLRP3 inflammasome pelėms in vitro, parsisiųsti ir vivo
.

M. HY
sukeltas IL-1β skatina skrandžio naviko ląstelių migraciją ir invazija

pirmiau pateikti duomenys aiškiai rodo, kad M.hy
galėjo sukelti IL-1β gamybą iš įgimto imuniteto ląsteles per NLRP3 inflammasome aktyvacijos. Ankstyvi epidemijos tyrimai atskleidė galimą vaidmenį Mycoplasma į skrandžio vėžio [5] plėtrai. Ir , Mycoplasma hyorhinis
buvo įrodyta, kad skatinti naviko ląstelių migraciją, invazija ir metastazes in vitro parsisiųsti ir vivo
[41]. Mes iškėlė hipotezę, kad gali egzistuoti kitą mechanizmą šioje akcijoje, kuri yra tai, kad M.hy
gali skatinti skrandžio kancerogenezės ir /arba metastazes skatinant IL-1β gamybą. Ir mes patvirtino, kad M.hy
skatinama skrandžio vėžio ląstelių migraciją ir invazija (S5 pav). Nuo M.hy
buvo įrodyta, kad užkrėsti skrandžio vėžio ląsteles ([41], S4 "paveikslas), taigi jis yra įmanoma, kad M.hy
gali sukelti inflammasome aktyvavimo vėžinių ląstelių tiesiogiai. Tačiau nė inflammasome aktyvacijos buvo aptiktas skrandžio vėžio ląstelių (S6 pav.)

Kitas nustatomas žmogaus rekombinantinis IL-1β (RIL-1β) poveikį skrandžio vėžio ląstelių kancerogenezėje gyvenvietėje formavimo metodu, kuris parodė, kad RIL-1β neturėjo įtakos skrandžio vėžio ląstelių linijos MGC-803 (S7 pav) proliferaciją. Nuo IL-1β buvo pranešta skatinti metastazių kitų navikų [18], mes patikrino RIL-1β poveikį migracijos ir invazijos į MSV-803 ląstelių. Mūsų rezultatai parodė, kad MSV-803 migracija ir invazija buvo sustiprintas RIL-1β gydymo (7a pav ir 7c), o gydymas RIL-18 neparodė jokio poveikio (7b ir 7d pav.) Be to, mes traktuojami šiuos skrandžio vėžio ląstelių kultūros nuopile iš M.hy
ginčijo THP-1 gautus makrofagus ar makrofagus su nuslopinami iš NLRP3, ASC ir kaspazė-1 migracijos ir invazijos metodu. Mūsų rezultatai parodė, kad kultūros supernatantai iš M.hy
ginčijo peštynės makrofagų ląstelių stipriai patobulintas migracija ir invazija skrandžio vėžio ląsteles, o kultūros supernatantai iš NLRP3, ASC ar kaspazės-1 triuškinantis makrofagų nebuvo, tikėtina, dėl sumažėjusio IL-1β sekrecijos (8a pav ir 8c). Tai sustiprino migracija ir invazija į MSV-803 ląstelių buvo panaikinta apdorojant ląsteles su anti-IL-1β mAb (8b ir 8D paveikslą). Kartu paėmus, mūsų rezultatai parodė, kad M.hy
sukeltos migracijos ir invazija skrandžio vėžio ląstelių linijos MSV-803 skatinant IL-1β išsiskyrimą iš monocitine ląsteles. Be to, mūsų duomenys rodo, kad M.hy
sukeltas inflammasome aktyvavimo gali skatinti M.hy
replikacija (S8 pav), kuri gali sukelti teigiamą grįžtamąjį ryšį ir galiausiai veda prie ilgalaikiškumo liga.

Diskusijos

mikoplazmos atskirti save nuo kitų bakterijų mažų dydžio, minučių genomo ir ląstelių sienelės trūkumo. Daugelis mikoplazmos nustatyti kolonizaciją ir infekcijos per laikymusi šeimininko audinių. Nes jų dinamiškas paviršius architektūra yra antigenai ir funkciškai universalus, mikoplazmos gali išvengti šeimininko imuninę ataką ir prisitaikyti prie daugelio buveinių ir sukelti lėtinės ligos [32]. Nuo M.hy
identifikavimo nuo kiaulių 1962 m, mažai tyrimas buvo atliktas šio patogeno iki ji buvo nustatyta, kad būti susietas su keliomis žmogaus vėžio [5], [41], [42], [ ,,,0],43]. Visai neseniai mokslininkai nustatė, kad M.hy
baltymų 37 psl buvo atsakingas už skatinimą vėžinių ląstelių yra invazinis ir metastazes [30], [44]. Be šio tiesioginio mechanizmo, šis mikrobas taip pat gali sukelti tumorigenezei arba metastazes netiesiogiai per vietos lėtinė uždegiminė procese. Tai gerai žinoma, kad IL-1β yra svarbus Pro-uždegiminių citokinų, kuris skatina augimą gaubtinės žarnos vėžio ląsteles ir pagerina invazinis ir metastazes B16 melanomos ląstelių [19], [45]. buvo nustatyta padidėjusi IL-1β sukelti skrandžio uždegimą ir vėžį pelėms [19]. Šiame tyrime mes ištirti, ar NLRP3 inflammasome, kuri kontroliuoja IL-1β brendimą, buvo aktyvuota M.hy
, ir ar tai aktyvavimas gali prisidėti prie M.hy
susijęs skrandžio metastazių , Mūsų rezultatai parodė, kad M.hy
aktyvuota NLRP3 inflammasome in vitro parsisiųsti ir vivo
ir skrandžio vėžio ląstelių migracijos ir invazijos skatinimas M .hy
buvo priklausoma nuo NLRP3 inflammasome aktyvacijos. Be NLRP3, mes nustatėme, kad M.hy
DNR taip pat aktyvuota AIM2 inflammasome, bet MLAMP aktyvavimo NLRP3 buvo dominuojantis IL-1β indukcijos M.hy.

neseniai buvo pranešta, kad acilinima lipopeptidas iš karščiui žuvo mikoplazmas, acholeplasma laidlawii
(HKAL) sukeltas IL-1β gamyba per NLRP7 inflammasome žmogaus ląstelių, o iš viso HKAL sukeltas IL-1β sekrecija buvo iš dalies NLRP3 priklauso [46] rodo, kad daug Inflamasomos galima suaktyvinti tam tikros mikoplazmas. Mūsų duomenų neatmetė galimybe dalyvauti NLRP7 į M.hy
sukeltas IL-1β gamybą, tačiau M.hy
daugiausia aktyvuota NLRP3 inflammasome, nes IL-1β sekrecija buvo beveik visiškai panaikinta NLRP3 nutildė ląstelių (3H ir 3i pav.)

Ankstyvasis tyrimai pasiūlė, kad ROS aktyvuota NLRP3 inflammasome aktyvuojant kaspaze-1 [47]. Tačiau naujausi tyrimai parodė, kad ROS inhibitoriai įsikišo į IL-1β ir NLRP3 transkripcija, bet ne paveiktą aktyvacijos kaspazės-1 pelių ląstelių [40]. Mūsų tyrimo duomenimis, nors ROS slopinimas su doze DPI (10 m) gerokai sumažino IL-1β gamybą ant M.hy
iššūkis, jis neslopina kaspazės-1 skilimo, kad inflammasome aktyvavimo žymeklį. Tačiau, kai buvo taikoma didelė dozė DPI (100 mikromolių), kaspazės-1 skaldymas buvo aiškiai slopinamas (5E paveikslas), o tai rodo, kad aukštos dozė DPI gali slopinti inflammasome komplekso surinkimas, nors mes negalime atmesti galimybės, kad šis poveikis gali buvo lėmė NLRP3 iRNR panaikinti nuo pradinio (5d pav.) Tikėtina, kad ROS inhibitorius gali trukdyti tiek pro-IL-1β sintezės ir kaspazės-1 aktyvacijos.

Kaip M.hy
skatina ROS gamybą makrofagų išlieka silpnas. Iš ląstelių sienelių nebuvimas iš M.hy
leidžia tiesioginio sąlyčio Mycoplasma membranos ir priimančiosios ląstelės membranos, ir tai kontaktas gali sukelti sintezės Mycoplasma su eukariotinių šeimininko ląstelę. Šitas susiliejimas gali ne tik sukelti Mycoplasma komponentų teikiančių į ląstelę-šeimininkę, bet taip pat būtų įmanoma įterpti Mycoplasma membranos komponentus į eukariotinio šeimininko ląstelėje membranos. Neseniai buvo rasta M.hy
membranos turėti fosfolipazę A (PLA), kurios gali būti įtrauktos į plazminės membranos sutrikimų procesas, vykstantis ant šeimininko ląsteles [48] invazija, [49]. Šio proceso metu ląstelės-šeimininkės gali sukelti ROS. Būtų verta tiria, ar PLA reikalingas M.hy
sukeltas ROS gamybą ir IL-1β sekreciją.

Kaip liudija mūsų duomenimis, lizosominio plyšimas K ^{+ ištekėjimo Ca 2 + antplūdžio ir ROS visi buvo įtraukti į M.hy
sukeltas NLRP3 aktyvacijos. Kaip pranešė anksčiau, K + išsiurbimo ir fagolizosominis plyšimas gali sukelti Ca 2 + antplūdžio, o Ca 2 + antplūdis gali sukelti sutrikusi mitochondrijas, kuris sukelia išleidimo oksiduoti mitochondrijų DNR (mtDNA) įtraukus į citozolyje, kur ji jungiasi su ir aktyvuoti NLRP3 inflammasome [9], [12]. Mitochondrijos atrodo veikti kaip centrinė centru integracijos įvairių signalų jaučia NLRP3, bet santykinis indėlis ROS ir mtDNA už NLRP3 inflammasome aktyvavimo vis dar neaišku iki šiol [9].}

Nors M .hy
nėra labai pavojinga, ji gali nustatyti lėtinės infekcijos. Laipsniškas ir laipsniškai sąveikos su šeimininko ląsteles, ji skatina chromosomų nestabilumo ir piktybinę transformaciją, taip skatinant naviko augimą, migracijos ar invazija [50], [51]. M.hy
37 psl baltymas skatina skrandžio vėžio ląstelių, prostatos karcinomos ir melanomos ląstelių linijos invazijos [30], [31]. Be to, prouždegiminis mikro-aplinka, tokių kaip IL-1β gamybos taip pat gali prisidėti prie šio proceso [19]. Mūsų tyrimas parodė, kad M.hy
sukeltas IL-1β skatinama migracijos ir invazija į skrandžio vėžio ląsteles, o M.hy
sukeltas IL-18 nebuvo prisidėti prie migracijos ir invazija skrandžio vėžio ląstelės, kurios skyrėsi nuo kitų ataskaitų [26], [27]. Galimas paaiškinimas yra tai, kad IL-18 galėjo skatinama skrandžio vėžio ląstelių migraciją ir invazija per iš CD70, CD44 reguliavimo ir VEGF raiškos imuninių ląstelių, kurios nusipelno mūsų tolesnį tyrimą [26]. Kitas paaiškinimas galėtų būti, kad RIL-18 dozė jie naudojami (150 ng /ml) yra daug didesnis nei tai, ką mes naudojamas [27]. Be to, IL-1β skatinama migracijos ir invazija į skrandžio vėžio ląstelių galima tarpininkaujant matricos metaloproteinazės-9 (MMP9) kiti tyrėjai pranešė [52]. Tačiau, norint gauti tiesioginę ir daugiau svarių įrodymų ir atitinkamas priemones, apie ryšį tarp NLRP3 inflammasome aktyvavimo sukėlė M.hy, parsisiųsti ir skrandžio vėžio metastazėmis atitinkamų gyvūnų modelių, tokių kaip in vivo,
naviko invazija analizes [53] ir pacientų tyrimai yra reikalingi tolesnei analizei ateityje.

medžiagos ir metodai

Mobilusis kultūra

THP-1 ląstelės, PMA-sukeltas makrofagų ir skrandžio vėžio ląstelių MSV-803 buvo prižiūrimi RPMI 1640 terpėje su esminiais papildų. Žmogaus monocitai buvo izoliuotas Percol TM tankio gradiento centrifuguojant (GE Healthcare ", bio-mokslai, Švedija) iš žmogaus periferinio kraujo mononuklearų ląstelių (PKVL) gauti iš Šanchajaus Kraujo centras (Šanchajus, Kinija).

M.hy
deformacijų ir PGR aptikimas

M.hy
padermė naudojama mūsų tyrime buvo gauta iš užteršto ląstelių kultūroje. Mikoplazmos aptikimo buvo atliktas dviem etapais PGR su ląstelių kultūros terpės, [54]: Pirma, paleisti PGR su keturiais pradmenų 5'-ACACCATGGGAGYTGGTAAT-3 ', 5'-CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT-3', 5'-AAAGTGGGCAATACCCAC GC-3 ', 5'-TCACGCTTAGATGCTTTCAGCG-3 "su ląstelių kultūringas terpėje šabloną. Antra, imtis 1 įxL pirmiau PGR produkto kaip šabloną ir paleisti PGR su trimis pradmenų 5'-GTGSGGMTGGATCACCTCCT-3 ', 5'-GCATCCACCAWAWACY CTTT-3', 5'-CCACTGTGTGCCCTTTGTTCCT-3 '. Pirmojo ir antrojo PGR pagal tą pačią ciklo sąlyga. Tada mes sekos PGR produktą ir gauti šias sekas: ACTCTTACTTAATTTAAAAGTTAATACAACTTTAATATT GCCTATTATTGCTAAAGATAAATATCTTAAGGTATTTTAATATTGGTAATCTATTTTAGAAATTTAATTTAAAAATTAAACTCGGTTATAAAAAAGATCGTTGAAATAATAAATATGAAGTTAATCATATTGTTATTTGCTATTCAGTTTTCAAAGAACTATAATTGAGAACTTAAAGCTCTCAAAACTAGACACGAATCGATTATGTAATAAGTCAATTAAGACTAACGGAAAGCGGAAAAAGAAGGTGATCCGTCCCCACG. Iki Nuvalyti NCBI duomenų bazėje, gavome informacijos, kad mikoplazmos yra M.hy
. Tai gali būti SK76, LDK-1 arba MCLD padermės.

M.hy
Kultūra, DNR išskyrimo ir MLAMP paruošimas

M.hy
buvo auginami modifikuoti SP-4 terpė su 20% naujagimių veršelių serumo, 10% mielių ekstrakto, 1% gliukozės, kiekio 0.00024% phenolsulfonphthalein ir 1000 TV /ml penicilino. DNR išskyrimas iš M.hy
buvo atliekami pagal su reagentais teikiamų Šanchajaus Lifefeng Biotechnology Co., Ltd. instrukcijas M.hy
buvo įvertintas kaip spalvos pokytis vienetų (ccu) per mililitre, kaip aprašyta [55]. Iš MLAMP gavyba buvo atliktas taip, kaip aprašyta anksčiau [34].

Realaus laiko PGR

NLRP3 ir IL-1β iRNR raiška lėmė Kiekybinis realaus laiko PGR. Santykinis kiekybinis genų buvo normalizuotas prieš endogeninio kontrolės beta-aktino per formulę [2 ^{-ΔCt (taikinio geno-β-aktino)]. Naudojami pradmenys buvo: Homo sapiens (hr) IL-1β, 5'-CACGATGCACCTGTACGATCA- (pirmyn) 3 ', 5'-GTTGCTCCATATCC TGTCCCT- (reversas) 3 "; beta-aktino, 5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG- (pirmyn) 3 ', 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC- (reversas) 3 "; NLRP3, 5'-AAGGGCCATGGACTATTTCC- (pirmyn) 3 ', 5'-GACTCCACCCGATGACAGTT- (reversas) 3 ". M.hy
DNR kopijų buvo dertermined kiekybiniais realaus laiko PGR su standartinės kreivės metodikos absoliučių kopijų skaičiaus. Konkretūs gruntai M.hy
buvo. 5'-CGATTCGTGTCTAGTTTTGAG - (pirmyn) 3 ', 5'-ATTGCCTATTATTGCTAAAG - (reversas) 3'}

IFA

supernatantai iš išaugintų ląstelių pelės serumo ir pelės pilvaplėvės plovimas skysčio buvo analizuojami prouždegiminio citokino IL-1β, IL-18, IL-6, arba IL-8 sekreciją ELISA (BD Biosciences) pagal gamintojo instrukcijas.

karta THP-1 ląstelių išreiškiantys shRNAs nukreipimą genų vietos

shRNR vektorių prieš žmogaus NLRP3, kaspazė-1 ir ASC ir jų plaktai vektoriai yra dovanos iš dr Jurg Tschopp [56]. Apie THP-1 ląstelių išreiškė kartos shRNAs, trumpai, NT GATGCGGAAGCTCTTCAGTTTCA žmogaus ASC kodavimo sekos, NT CAGGTTTGACTATCTGTTCT žmogaus NLRP3 kodavimo sekos, NT GTGAAGAGATCCTTCTGTA iš 3 "UTR žmogaus kaspazė-1 buvo įtraukta į pSUPER. Pol III rengėjas shRNR kasetės iš šių vektorių ir iš Lamin A /C konkrečių pSUPER kontrolė konstruktas buvo įdėta į lentiviruso vektoriaus pAB286.1, iš PHR darinys, kuriame yra SV40-puromicino tricinacetiltransferazę kasetę už antibiotikų parinkimas.

• PLoS ONE: Neigiamas Mazgas Grafas tobulinimas prognostinis Prognozė Septintosios Edition iš TNM klasifikaciją skrandžio Cancer
• PLoS ONE: Gamtos istorijos piktybinis kaulų liga, skrandžio vėžiu: galutiniai rezultatai yra multicentrinius Kaulų Metastazė Survey