PLoS ONE: Mycoplasma hyorhinis activeert de NLRP3 inflammasoom en bevordert de migratie en invasie van maagkanker Cells

De abstracte

Achtergrond

Mycoplasma hyorhinis
( M.hyorhinis, M.hy
) is geassocieerd met de ontwikkeling van maag- en prostaatkanker. De NLRP3 inflammasoom, een eiwitcomplex regelen van de rijping van belangrijke proinflammatoire cytokinen interleukine (IL) -1β en IL-18, is ook betrokken bij het ontstaan ​​van tumoren en metastase van verschillende kankers.

Methodologie /voornaamste bevindingen

Om te verduidelijken of M.hy
gepromoot tumorontwikkeling via inflammasoom activering, analyseerden we monocyten voor IL-1β en IL-18 productie na M.hy
uitdaging. Bij blootstelling aan M.hy
, humane monocyten vertoonden een snelle en robuuste IL-1β en IL-18 secretie. Verder hebben we vastgesteld dat de lipide-geassocieerde membraaneiwit (LAMP) van M.hy
was verantwoordelijk voor IL-1β inductie. Het toepassen van competitieve remmers, genspecifieke shRNA en gen-gerichte muizen, geverifieerd we dat M.hy
geïnduceerde IL-1β secretie was NLRP3-afhankelijke In vitro Kopen en In vivo
. Cathepsine B-activiteit, K ^{+ efflux, Ca 2 + influx en ROS productie waren allemaal nodig is voor de NLRP3 inflammasoom activering door M.hy
. Belangrijker nog, het is IL-1β, maar niet IL-18 geproduceerd uit macrofagen uitgedaagd met M.hy
bevorderd maagkanker cel migratie en invasie.}

Conclusies

Onze gegevens suggereren dat de activering van de NLRP3 inflammasoom door M.hy
kan worden geassocieerd met de promotie van maagkanker metastase, en anti- M.hy
therapie of beperken NLRP3 signalering kan effectieve aanpak voor de controle zijn van maagkanker vooruitgang

Visum:. Xu Y, Li H, Chen w, Yao X, Y Xing, Wang X, et al. (2013) Mycoplasma hyorhinis
activeert de NLRP3 inflammasoom en bevordert de migratie en invasie van maagkanker Cells. PLoS ONE 8 (11): e77955. doi: 10.1371 /journal.pone.0077955

Editor: Suresh Yenugu, Universiteit van Hyderabad, India

Ontvangen: 5 juni 2013; Aanvaard: 6 september 2013; Gepubliceerd: 6 november 2013

Copyright: © 2013 Xu et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door subsidies van 100 Talent Programma van de Chinese Academie van Wetenschappen, Natural Science Foundation of China (91029707, 31170868), Shanghai Natural Science Foundation (11ZR1442600), Novo Nordisk-CAS Research Foundation, SA-SIBS Scholarship Program, alsook subsidies van de National Key Programs op Infectieziektebestrijding (2012ZX10002007-003). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Mycoplasma's pleomorfe, muur vrij, prokaryotische organismen die hetzij op de eukaryotische cel membranen of in de cellen bevinden, en ze zijn de kleinste organismen die zelfreplicatie [1]. Tot op heden zijn ten minste 16 mycoplasma species geïsoleerd uit mensen [2]. Mycoplasma hyorhinis
( M.hy
) werd als niet-pathogeen voor mensen zoals meestal infecteert varkens leidt tot luchtwegen en ontsteking van de borst en verbindingen [3], [4] . Echter, de opslag bewijs suggereert dat M.hy
infectie bij de mens komt tot klinische uitkomsten. M.hy
werd gevonden in 56% van maagcarcinoom, 55% van coloncarcinoom en 52,6% van longcarcinoom biopsieën [5]. Bovendien is 36% van de mannen met benigne prostaathyperplasie (BPH) en 52% van de mannen met prostaatkanker zijn M.hy
sero-positief. Deze klinische bevindingen suggereren een mogelijk verband tussen de M.hy
belichting met maag-, darm-, long- en prostaatkanker [5], [6].

Bij de microbiële infectie, gastheer patroonherkenning receptoren ( PRRS) zoals TLR's detecteren pathogenen en leiden tot de synthese van pro-inflammatoire cytokinen zoals pro-IL-1β en pro-IL-18 via NF-KB activering. Tegelijkertijd andere groep PRRS waaronder NLRP3 rekruteren adapter eiwit ASC en leiden tot de activatie van caspase-1, die actief protease dat splitst de voorloper vorm van cytokinen waaronder pro-IL-1β en pro-IL-18 tot volwassen, afgescheiden vorm [7]. Pathogenen of uitdagende stoffen vrijkomen kalium- efflux, mitochondria schade mitochondria DNA afgifte, ROS productie, intracellulair calcium verhogen of cellulaire cyclische AMP daling aangeboren immuuncellen, die alle betrokken zijn bij caspase-1 activering [8], [9], [10 ], [11], [12], [13]. Tijdens dit proces, de NLRP3, ASC en pro-caspase-1 vormen een moleculaire platform genaamd inflammasoom. Tot nu toe zijn een aantal inflammasomen geïdentificeerd, daarvan, de NLRP3 inflammasoom is gevonden worden bij tumorontwikkeling [14], [15], alhoewel controverse bestaat uit verschillende modellen [16], [17]. Niettemin werd IL-1β gemeld tumorcelgroei en metastase bevorderen door het induceren van verschillende pro-metastatische genen zoals matrix metalloproteïnasen en endotheliale adhesiemoleculen, en TGF-β, chemokines en groeifactoren [18]. In een Koreaanse populatie, worden de combinatie van verhoogde mucosale IL-1β niveau homozygotie voor IL-1β -31T enkele nucleotide polymorfisme (SNP) beide geassocieerd met een verhoogd risico op maagkanker [18]. Bovendien Tu et al. gevonden dat maag-specifieke expressie van humaan IL-1β in transgene muizen tot spontane maagontsteking en kanker [19], verder suggereert dat IL-1β menselijke maagkanker kunnen bevorderen. Daarentegen IL-18 versterkt NK celactiviteit, vermindert het ontstaan ​​van tumoren, apoptose en remt angiogenese in tumorcellen anti-tumor effecten uitoefent [20], [21]. Bovendien, een onjuiste productie van IL-18 bleek bij te dragen tot de pathogenese van kanker en kan de klinische uitkomst van patiënten [22] beïnvloeden. IL-18 werd gemeld te stimuleren matrix metalloprotease-9 productie, wat resulteert in een verhoogde migratie en invasie in coronaire gladde spiercellen en HL-60 myeloïde leukemie-cellen [23], [24]. Ook werd gemeld dat het serum IL-18 niveau maagkanker patiëntengroep was significant hoger dan die maagzweren patiëntengroep [25] en IL-18 kan metastase en immune escape maagkanker vergroten door de neerwaartse regulatie van CD70 en onderhoud van CD44 in menselijke maagkanker cellijn NCI-N87 en SNU16 [26]. Het is ook een belangrijke mediator van VEGF-versterkte migratie in menselijke maagkanker cellijnen SNU-601 [27]. Bovenstaande resultaten suggereren dat Mycoplasma hyorhinis
kan migratie en invasie van maagkanker cellen te bevorderen door activering inflammasoom.

Tot op heden, een breed scala van microben zoals virussen, bacteriën, schimmels en protozoa zijn geïdentificeerd aan de NLRP3 inflammasoom [28] te activeren. Een recente studie toonde aan dat Mycoplasma pneumoniae
kon ook IL-1β productie in humane cellen [29] induceren. Echter, of M.hy
, wat een belangrijke factor in de maag kankerontwikkeling zoals bovenstaand [5], [30], [31], activeert de NLRP3 inflammasoom en of deze activering bijdraagt ​​aan de genoemde maagkanker ontwikkeling onbekend blijven. In deze studie vonden we dat M.hy
geactiveerd IL-1β secretie in een NLRP3 inflammasoom-afhankelijke manier, en de daaruit voortvloeiende IL-1β geïnduceerde migratie en invasie van maagkanker cellen.

resultaten

M.hy
Triggers IL-1β en IL-18 productie in THP-1-cellen

Om te bepalen of M.hy
induceert IL -1β productie van aangeboren immuuncellen, gevolgd we volwassen IL-1β niveaus in menselijke monocytische cellijn THP-1-cellen uitgedaagd met verschillende hoeveelheden M.hy
. In dit experiment werd een sterke inductie van IL-1β in een dosis-afhankelijke wijze werd waargenomen (Figuur 1A). Vervolgens maten we de pro-IL-1β mRNA in de cellen en rijpe IL-1β proteïne niveaus in de kweeksupernatanten op verschillende tijdstippen na M.hy
uitdaging. Er werd waargenomen dat IL-1β mRNA niveau bereikte bij 3 uur na blootstelling (Figuur 1B) en volwassen IL-1β (figuur 1C) en IL-18 (figuur 1D) eiwitniveaus piekte op 12 uur na blootstelling. Bovendien THP-1 afgeleide macrofagen vertoonden robuust secretie van IL-1β, IL-18 en andere cytokines zoals IL-6 en IL-8 (Figuur 1E, figuur S1). Om de bovenstaande bevindingen in THP-1-cellijn te bevestigen, we de IL-1β productie in primaire humane monocyten van gezonde donoren uitgedaagd met onderzocht M.hy
, waarbij IL-1β werd ook sterk geïnduceerd (Figuur 1F) . Deze gegevens gaven aan dat M.hy
geactiveerd robuuste IL-1β en IL-18 secretie van menselijke myeloïde cellen.

LAMP afkomstig van M.hy
is verantwoordelijk voor IL -1β Inductie door middel van TLR2

Vervolgens hebben we onderzocht of de replicatie van de M.hy
voor IL-1β productie in monocyten nodig was. Zoals getoond in Figuur 2A, M
.hy
geïnactiveerd door verhitting of ultraviolet (UV) door behandeling geïnduceerde zoveel IL-1β secretie van THP-1-cellen als levend M .hy
. Dit wijst erop dat bepaalde hitte- en UV-bestendig onderdeel van de M.hy
was verantwoordelijk voor de inductie van IL-1β secretie. Lipide-geassocieerde membraaneiwit (LAMP) is overvloedig op het oppervlak van de M.hy
[32], en eerdere studie bleek dat membraan lipoproteïnen uit andere mycoplasma species-geïnduceerde IL-1β secretie [33]. Wij dus gespeculeerd dat M.hy
afgeleid LAMP (MLAMP) verantwoordelijk kunnen zijn voor de IL-1β-inductie in THP-1-cellen zijn. Vervolgens hebben we gewonnen LAMP uit M.hy
(Figuur 2B) en getest het vermogen van MLAMP aan IL-1β secretie induceren in THP-1-cellen. We vonden dat MLAMP duidelijk geïnduceerde secretie van IL-1β op een dosis-afhankelijke manier, terwijl de waterige fase van M.hy
extract was niet in staat om dit te doen (Figuur 2C). Om de mogelijke RNA en /of DNA-besmetting in MLAMP te sluiten, we behandelden de MLAPMs met RNase en DNase en vond dat MLAMP was de belangrijkste component voor IL-1β inductie (figuur S2).

Er werd gemeld dat MLAMP voornamelijk geactiveerde NF-KB door middel van TLR2 en TLR6 [34], [35]. Daarom hebben we eerst toegepast TLR2 een neutraliserend antilichaam T2.5 de TLR2 signaalblok, met ConT2 dient als een isotype controle [36]. Zoals getoond in figuur 2D, T2.5 blokkeerde de IL-1β secretie gestimuleerd door TLR2 agonist P3CSK4 ze niet de TLR4-ligand LPS. Belangrijk is dat IL-1β secretie van M.hy
geïnfecteerde cellen werd sterk verminderd door T2.5, wat aangeeft dat TLR2 betrokken was bij MLAMP geactiveerd IL-1β secretie in menselijke monocyten. Interessant is dat IL-1β secretie van M.hy
geïnfecteerde cellen niet volledig geblokkeerd door T2.5 (figuur 2D), die suggereerde dat TLR2-onafhankelijke signaalweg ook betrokken was bij MLAMP geactiveerd IL-1β secretie, die verder onderzoek in de toekomst verdient.

M.hy
induceert IL-1β secretie door middel van activering van de NLRP3 inflammasoom

Om te testen of M.hy
geïnduceerde IL-1β secretie door middel van inflammasoom activering, we voor het eerst gebruikt LPS gegrond THP-1 afgeleide macrofagen om te controleren of M.hy
inflammasoom kan activeren, zoals ATP of MSU, die bekend staan ​​inflammasoom activators. Zoals getoond in figuur 3A, M
.hy
kon IL-1β afgifte induceren in de geprimede cellen. Vervolgens hebben we onderzocht de splitsing van caspase-1 en oligomerisatie van ASC, twee belangrijke makers voor inflammasoom activering. We vonden dat M.hy
bevorderde de splitsing van caspase-1 en oligomerisatie van ASC (Figuur 3B), wat wijst op een directe activatie van inflammasoom door M.hy.

Verder hebben we getest of M.hy
geïnduceerde IL-1β secretie was afhankelijk van bepaalde inflammasoom componenten. Ten eerste, bleek dat de specifieke caspase-1-remmer AC-YVAD-CHO verlaagde IL-1β secretie in THP-1-cellen op een dosis-afhankelijke wijze (Figuur 3C). Vervolgens, wanneer specifieke shRNA werd gebruikt om de expressie van caspase-1 en ASC (figuur 3D) tot zwijgen te brengen, IL-1β productie sterk afgenomen bij M.hy
challenge (figuur 3E), wat aangeeft dat M.hy
geïnduceerde IL-1β secretie was afhankelijk van caspase-1 en ASC.

dan hebben we getest of NLRP3 nodig was voor M.hy
geïnduceerde IL-1β secretie. Ten eerste, bleek dat de NLRP3 remmer Glybenclamide onderdrukt M.hy
geïnduceerde IL-1β secretie in een dosis-afhankelijke wijze (Figuur 3F) [37]. Wanneer specifieke shRNA werd gebruikt om de expressie van NLRP3 (figuur 3G) tot zwijgen te brengen, werd IL-1β productie sterk afgenomen bij M.hy
challenge (Figuur 3H), wat aangeeft dat M.hy
geïnduceerde IL-1β secretie afhankelijk NLRP3. Dit werd verder bevestigd door immunoblotting, waarbij de caspase-1 activering en IL-1β productie waren beide NLRP3 afhankelijk (Figuur 3I). Bovendien vonden we verder dat MLAMP was de belangrijkste component die verantwoordelijk is voor NLRP3 inflammasoom activering door M.hy
(figuur S2C). Bovendien werd AIM2 inflammasoom gemeld worden geactiveerd door DNA [38], en we vonden dat M.hy
DNA induceerde IL-1β secretie via AIM2 inflammasoom (Figuur S3A). Interessant, M.hy
geïnduceerde IL-1β secretie was vooral afhankelijk van NLRP3, terwijl AIM2 was slechts gedeeltelijk betrokken (Figuur S3A). Tezamen bieden deze resultaten duidelijk aangetoond dat M.hy
geïnduceerde IL-1β secretie door het activeren van de NLRP3 inflammasoom in menselijke monocytische cellen.

onderliggende mechanismen M.hy
geactiveerd NLRP3 inflammasoom Activering

Activering van NLRP3 inflammasoom door verschillende stimuli afhankelijk cathepsine B activiteit, K ^{+ efflux, calcium influx en /of productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) [11], [ ,,,0],12], [13], [39]. Om de mechanismen die ten grondslag liggen aan IL-1β release in reactie op de M.hy
uitdaging, we voor het eerst toegepast cathepsine B-specifieke remmer CA-074 Me verkennen en zagen een aanzienlijke verzwakking van IL-1β secretie bij M .hy
uitdaging. Bij een concentratie van 100 uM, CA-074 Me blokkeerde IL-1β afgifte (figuur 4A). Deze remming was niet op een toxisch effect op de cellen IL-8 secretie die door deze remmer was zeer mild (Figuur 4E). Belangrijk, wanneer de cellen werden behandeld met cathepsine K inhibitor I was de daling van IL-1β secretie was niet evident helemaal (figuur 4B en 4F), wat suggereert dat de cathepsine B activiteit specifiek was bij NLRP3 inflammasoom activatie tijdens M .hy
uitdaging. Bovendien, wanneer we K + efflux geblokkeerd door verhoging van de extracellulaire K + concentratie IL-1β secretie door THP-1 cellen na M.hy
uitdaging was significant verminderd in een dosis- afhankelijke wijze (Figuur 4C). Opnieuw was er geen toxisch effect van KCL IL-8 productie van dezelfde cellen normaal (Figuur 4G). Om erachter te komen of calcium influx geholpen inflammasoom activering, we verschillende doses EGTA toegevoegd in de cel kweekmedium en vond dat EGTA behandeling geblokkeerd M.hy
geïnduceerde IL-1β secretie in een dosis-afhankelijke manier, en geen toxische effect van EGTA werd waargenomen zoals blijkt uit de IL-8 productie (figuur 4D en 4H).}

Verder hebben we getest of M.hy
uitdaging geïnduceerde ROS generatie in THP-1-cellen . Voor deze test werden THP-1 cellen eerst geladen met de redox-gevoelige fluorofoor DCFDA en vervolgens geprikkeld met M.hy
, ATP werd meegenomen als positieve controle. Zoals getoond in figuur 5A, werden 16,9% CM-H2DCFDA positieve cellen waargenomen 30 minuten na M.hy
behandeling in vergelijking met 1,6% in onbehandelde cellen. Deze gegevens suggereerden dat ROS kunnen bijdragen aan NLRP3 inflammasoom activering in reactie op de M.hy
uitdaging. Om deze mogelijkheid te controleren, we voorbehandelde THP-1 cellen met ROS remmer difenyljodonium- (DPI) gedurende 30 minuten, en vervolgens uitgedaagd de cellen met M.hy
voor meting van IL-1β productie 6 uur later. Zoals verwacht, DPI drastisch verminderd M.hy
geïnduceerde IL-1β afgifte (Figuur 5B). Een recente studie toonde aan dat ROS remmer zoals DPI opgeheven IL-1β afgifte in muizen macrofagen door remming NLRP3 genexpressie [40]. Daarom hebben we bewaakt ook het mRNA niveau van pro-IL-1β en NLRP3 onder DPI behandeling. We vonden dat DPI sterk verminderde de expressie van pro-IL-1β en NLRP3 (Figuur 5C-D), die in overeenstemming met de bevinding van muizencellen [40] was. Bovendien onderzochten we ook de activatie van caspase-1 en gevonden dat lage doses (1 of 10 uM) van DPI behandeling beïnvloedde de caspase-1 activering terwijl 100 pM remde DPI caspase-1 activering (Figuur 5E). Dit toonde aan dat in menselijke cellen DPI verstoord NLRP3 inflammasoom activering door remming van transcriptie NLRP3 alsook caspase-1 activiteit wanneer hoge dosis werd toegepast. Tezamen zijn deze gegevens suggereren dat cathepsine B-activiteit, K ^{+ efflux, Ca 2 + influx en ROS allemaal bijgedragen aan NLRP3 inflammasoom activering in reactie op de M.hy
uitdaging.}

M.hy
activeert NLRP3 inflammasoom in vivo

Als de muis beenmerg afgeleide dendritische cellen (BMDCs) werden geïnfecteerd met M.hy
een aanhoudende IL-1β-inductie werd waargenomen (Figuur 6A). Verdere experimenten op BMDCs geïsoleerd van wild-type (WT) muizen of deficiënte muizen voor het caspase-1, ASC of NLRP3 met M.hy
uitdaging bevestigd dat M.hy
inductie van IL 1β was NLRP3 inflammasoom afhankelijk (figuur 6B). Bovendien systemische inoculatie van M.hy
in WT-muizen geïnduceerd IL-1β productie in serum en peritoneale lavage vloeistof (PLF), maar niet in muizen die ASC of NLRP3 (Figuur 6C-D). Interessant is dat de basale concentratie IL-1β in ASC deficiënte muizen was duidelijk hoger dan in WT of NLRP3 deficiënte muizen, maar prikkeling met M.hy
niet verder de afscheiding van IL-1β in deze muizen niet verhoogde (Figuur 6C-D). Tezamen zijn deze bevindingen bevestigd dat M.hy ook
geactiveerd NLRP3 inflammasoom bij muizen In vitro Kopen en In vivo
.

M. hy
geïnduceerde IL-1β Bevordert maagtumor Cell Migratie en invasie

De bovenstaande gegevens is duidelijk gebleken dat M.hy
was in staat om IL-1β productie te induceren van aangeboren immuunsysteem cellen door NLRP3 inflammasoom activatie. Epidemie vroege studies toonden een mogelijke rol van mycoplasma bij de ontwikkeling van maagkanker [5]. En Mycoplasma hyorhinis
werd aangetoond dat de tumorcel migratie, invasie en metastase In vitro
en het bevorderen van In vivo
[41]. Onze hypothese was dat er een ander mechanisme kunnen bestaan ​​voor deze promotie, en dat is dat M.hy
kan maag carcinogenese en /of metastase bevorderen door het bevorderen van IL-1β productie. En we hebben bevestigd dat M.hy
bevorderd maagkanker cel migratie en invasie (Figuur S5). Aangezien M.hy
werd aangetoond maagkanker cellen te infecteren ([41], figuur S4), is het dus mogelijk dat M.hy
kan inflammasoom activatie in kankercellen direct induceren. Er werd echter geen inflammasoom activatie waargenomen bij maagkanker cellen (Figuur S6).

We bepaalden de volgende effecten van menselijk recombinant IL-1β (rIL-1β) op maagkanker cel carcinogenese in een kolonievorming assay, die bleek dat rIL-1β de proliferatie van maagkanker cellijn MGC-803 (Figuur S7) niet heeft beïnvloed. Aangezien IL-1β werd gemeld metastase van andere tumoren [18] bevorderen, keken we de effecten van rIL-1β op de migratie en invasie van MGC-803 cellen. Onze resultaten toonden dat de MGC-803 migratie en invasie werden verbeterd met rIL-1β behandeling (Figuur 7A en 7C), terwijl behandeling met rIL-18 geen effect (Figuur 7B en 7D) vertoonden. Vervolgens hebben we behandelen deze maagkanker cellen met de kweeksupernatanten van M.hy
uitgedaagd THP-1 afgeleide macrofagen of macrofagen met silencing van NLRP3, ASC en caspase-1 voor migratie en invasie assay. Onze resultaten toonden aan dat de kweeksupernatanten van M.hy
uitgedaagd scramble macrofaag-cellen sterk verbeterde migratie en invasie van maagkanker cellen, terwijl de kweeksupernatanten uit de NLRP3, ASC of caspase-1 knockdown macrofagen niet, waarschijnlijk vanwege de verminderde IL-1β secretie (figuur 8A en 8C). Deze verbeterde migratie en invasie van MGC-803 cellen werd afgeschaft door behandeling van de cellen met anti-IL-1β mAb (Figuur 8B en 8D). Bij elkaar genomen, onze resultaten toonden aan dat M.hy
geïnduceerde migratie en invasie van maagkanker cellijn MGC-803 door het bevorderen van IL-1β secretie van monocytische cellen. Bovendien, onze gegevens blijkt dat M.hy
geïnduceerde inflammasoom activering kan bevorderen M.hy
replicatie (figuur S8), die een positieve feedback kan creëren en uiteindelijk leidt tot chroniciteit van de ziekte.

Discussie

Mycoplasma's onderscheiden zich van andere bacteriën door kleine omvang, minuut genoom en het ontbreken van de celwand. Veel mycoplasma vast kolonisatie en infectie via de naleving van de weefsels te hosten. Omdat hun dynamische oppervlak architectuur is antigeen en functioneel veelzijdig, mycoplasma's zijn in staat om zich te onttrekken aan gastheer immune aanval en aan te passen aan vele habitats en leiden tot chronische ziekten [32]. Sinds de identificatie van M.hy
van varkens in 1962, was er weinig onderzoek op deze ziekteverwekker uitgevoerd totdat het werd in verband gebracht met een aantal menselijke kankers [5], [41], [42], [ ,,,0],43]. Meer recent hebben wetenschappers dat M.hy
eiwit p37 is verantwoordelijk voor het bevorderen kankercellen invasiviteit en metastase [30], [44]. Naast deze directe mechanisme kan deze microbe ook het ontstaan ​​van tumoren of metastase te induceren indirect via een lokaal chronisch ontstekingsproces. Het is bekend dat IL-1β is een belangrijk pro-inflammatoir cytokine dat groei van darmkankercellen bevordert en verbetert invasiviteit en metastase van B16 melanoma cellen [19], [45]. Overexpressie van IL-1β bleek maagontsteking en kanker bij muizen [19] induceren. In deze studie hebben we onderzocht of de NLRP3 inflammasoom, die IL-1β rijping regelt, werd geactiveerd door M.hy
, en of deze activering kan bijdragen aan de M.hy
gerelateerde maag- metastase . Onze resultaten toonden aan dat M.hy
geactiveerd de NLRP3 inflammasoom In vitro Kopen en In vivo
, en de bevordering van maagkanker cel migratie en invasie door M .hy
was afhankelijk van NLRP3 inflammasoom activering. Naast NLRP3, vonden we dat M.hy
DNA ook geactiveerd de AIM2 inflammasoom, maar MLAMP activering van NLRP3 was het dominerende bestanddeel voor IL-1β inductie door M.hy.

Het is onlangs gemeld dat geacyleerde lipopeptide van door verhitting gedood mycoplasma Acholeplasma laidlawii
(HKAL) geïnduceerde IL-1β productie tot NLRP7 inflammasoom in menselijke cellen, terwijl de totale HKAL geïnduceerde IL-1β secretie was gedeeltelijk afhankelijk NLRP3 [46], wat aangeeft dat meerdere inflammasomen kan worden geactiveerd door bepaalde mycoplasma. Onze gegevens sloot niet uit dat de mogelijke betrokkenheid van NLRP7 in M.hy
geïnduceerde IL-1β productie, maar M.hy
vooral geactiveerd de NLRP3 inflammasoom, omdat de IL-1β secretie was vrijwel volledig afgeschaft in de NLRP3 tot zwijgen cellen (Figuur 3H en 3I). voorgestelde

de vroege studies die ROS geactiveerd de NLRP3 inflammasoom door het activeren van caspase-1 [47]. Echter, recent onderzoek bleek dat ROS remmers verstoord de transcriptie van IL-1β en NLRP3, maar niet beïnvloed activatie van caspase-1 in muizencellen [40]. In onze studie, hoewel ROS remming met een lage dosis DPI (10 M) significant de IL-1β productie bij verminderde M.hy
uitdaging, heeft zij niet de caspase-1 splitsing, de markering van inflammasoom activering te remmen. Wanneer echter hoge dosis DPI (100 uM) werd toegepast, caspase-1 splitsingsplaats werd duidelijk geremd (Figuur 5E), wat suggereert dat hoge dosis DPI het samenstel van inflammasoom complex kan onderdrukken, hoewel we de mogelijkheid niet kunnen uitsluiten dat dit effect zou zijn het gevolg van de NLRP3 mRNA afschaffing van de uitgangswaarde (figuur 5D). Het is waarschijnlijk dat de ROS remmer storende zowel pro-IL-1β synthese en caspase-1 activering.

Hoe M.hy
bevordert ROS productie in macrofagen ongrijpbaar. Het gebrek aan celwand van M.hy
maakt direct contact tussen het membraan en mycoplasma gastheercelmembraan en dit contact kan leiden tot fusie van mycoplasma met eukaryote gastheercel. Deze fusie kan niet alleen leiden tot mycoplasma componenten leveren in de gastheercel, maar ook in staat insertie van de mycoplasma membraan componenten in het membraan van de eukaryote gastheercel. Onlangs M.hy
membranen bleken te bezitten fosfolipase (PLA) die betrokken kunnen zijn bij de plasmamembraan verstoring proces dat optreedt bij de invasie van gastheercellen [48], [49]. Tijdens dit proces kunnen de gastheercellen ROS produceren. Het is nuttig te onderzoeken of PLA is vereist voor de M.hy
veroorzaakte ROS productie en IL-1β uitscheiding.

Zoals blijkt uit onze gegevens lysosomale breuk, K ^{+ uitstroom, Ca 2 + influx en ROS waren allemaal betrokken bij de M.hy
geïnduceerde NLRP3 activering. Zoals eerder gemeld, K + efflux en phagolysosomal scheuring veroorzaken Ca 2 + influx, terwijl Ca 2 + influx kan disfunctie van mitochondria, wat leidt tot afgifte van geoxideerde mitochondriaal DNA (mtDNA) in het veroorzaken cytosol, waar het bindt aan en activeert de NLRP3 inflammasoom [9], [12]. Mitochondriën lijkt op te treden als een centrale hub voor de integratie van diverse signalen waargenomen door NLRP3, maar de relatieve bijdrage van ROS en mtDNA voor NLRP3 inflammasoom activering is nog steeds niet duidelijk is tot op heden [9].}

Hoewel de M .hy
is niet zeer virulente, kan het chronische infectie vast te stellen. Door een geleidelijke en progressieve interactie met gastheercellen, induceert chromosomale instabiliteit en kwaadaardige transformatie, dus het bevorderen van tumorgroei, migratie of invasie [50], [51]. De M.hy
p37 eiwit bevorderd maagkanker cel, prostaatkanker en melanoom cellijnen invasiviteit [30], [31]. Bovendien kan de pro-inflammatoire micromilieu zoals IL-1β productie ook bij aan dit proces [19]. Onze studie bleek dat M.hy
geïnduceerde IL-1β bevorderd migratie en invasie van de maagkanker cellen, terwijl de M.hy
geïnduceerde IL-18 niet heeft bijgedragen tot de migratie en invasie van maagkanker cellen die verschillen van andere rapporten [26], [27] was. Een mogelijke verklaring is dat IL-18 maagkanker cellen migratie en invasie kunnen hebben bevorderd via de regulatie van CD70, CD44 en VEGF expressie in immuuncellen, die ons verder onderzoek [26] verdient. Een andere verklaring is dat de dosis van rIL-18 vroeger (150 ng /ml) is veel hoger dan wat we gebruikt [27]. Bovendien IL-1β bevorderd migratie en invasie van maagkanker cellen worden gemedieerd door matrix metalloproteïnase-9 (MMP9) andere onderzoekers [52] beschreven. Echter, om directe en meer solide bewijsmateriaal en de bijbehorende mechanismen over het verband tussen NLRP3 inflammasoom activering getriggerd door M.hy, Kopen en maagkanker metastase, geschikte dierlijke modellen zoals de In vivo
tumorinvasie assay [53] en patiëntstudies nodig voor verder onderzoek in de toekomst.

Materialen en Werkwijzen

Celkweek

THP-1-cellen, PMA-geïnduceerde macrofagen en maagkanker cel MGC-803 werden in RPMI 1640 medium met essentiële supplementen onderhouden. Menselijke monocyten werden geïsoleerd door Percol TM dichtheid-gradiënt centrifugeren (GE Healthcare, Bio-wetenschappen, Zweden) menselijke perifere mononucleaire bloedcellen (PBMCs) verkregen uit Shanghai Blood Center (Shanghai, China).

M.hy
Strain en PCR Detection

M.hy
gebruikte stam in onze studie werd verkregen uit besmette celkweek. Mycoplasma detectie werd uitgevoerd door middel van twee ronden van PCR met celkweekmedium [54] uitgevoerd: Eerst laat PCR met vier primers 5'-ACACCATGGGAGYTGGTAAT-3 ', 5'-CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT-3', 5'-AAAGTGGGCAATACCCAC GC-3 ', 5'-TCACGCTTAGATGCTTTCAGCG-3 'met mobiele kweekmedium als template. Ten tweede, neemt 1 ui van de bovenstaande PCR-product als matrijs en lopen met drie PCR primers 5'-GTGSGGMTGGATCACCTCCT-3 ', 5'-GCATCCACCAWAWACY CTTT-3', 5'-CCACTGTGTGCCCTTTGTTCCT-3 '. De eerste en tweede PCR uitgevoerd onder dezelfde cyclus conditie. Vervolgens sequentie we het PCR-product verkregen en de volgende sequenties: ACTCTTACTTAATTTAAAAGTTAATACAACTTTAATATT GCCTATTATTGCTAAAGATAAATATCTTAAGGTATTTTAATATTGGTAATCTATTTTAGAAATTTAATTTAAAAATTAAACTCGGTTATAAAAAAGATCGTTGAAATAATAAATATGAAGTTAATCATATTGTTATTTGCTATTCAGTTTTCAAAGAACTATAATTGAGAACTTAAAGCTCTCAAAACTAGACACGAATCGATTATGTAATAAGTCAATTAAGACTAACGGAAAGCGGAAAAAGAAGGTGATCCGTCCCCACG. Door BLAST in NCBI databank, verkregen we de informatie die de mycoplasma is M.hy
. Het kan SK76 zijn, GDL-1 of MCLD stam.

M.hy
Cultuur, DNA-extractie en MLAMP Voorbereiding

M.hy
WAS gekweekt in gemodificeerd SP-4 medium bevattende 20% pasgeboren kalfsserum, 10% gistextract, 1% glucose, 0.00024% phenolsulfonphthalein en 1000 IU /ml penicilline. DNA-extractie van M.hy
werd uitgevoerd volgens de instructies van de reagentia die door Shanghai Lifefeng Biotechnologie Co, Ltd M.hy
werd gekwantificeerd als kleurverandering eenheden (CCU) per milliliter zoals beschreven [55]. De winning van MLAMP werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [34].

Real-time PCR

NLRP3 en IL-1β mRNA expressie werd bepaald door kwantitatieve real-time PCR. De relatieve kwantificatie van de genen werden genormaliseerd tegen een endogene controle β-actine via formule [2 ^{-ΔCt (doelgen-β-actine)]. De gebruikte primers waren: Homo sapiens (hs) IL-1β, 5'-CACGATGCACCTGTACGATCA- (forward) 3 ', 5'-GTTGCTCCATATCC TGTCCCT- (achteruit) 3; P-actine 5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG- (forward) 3 ', 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC- (achteruit) 3; NLRP3, 5'-AAGGGCCATGGACTATTTCC- (forward) 3 ', 5'-GACTCCACCCGATGACAGTT- (achteruit) 3'. M.hy
DNA exemplaren werden dertermined door Kwantitatieve real-time PCR met standaard-curve methodologie voor het absolute kopie-aantallen. De specifieke primers voor M.hy
waren:. 5'CGATTCGTGTCTAGTTTTGAG - (vooruit) 3 ', 5'-ATTGCCTATTATTGCTAAAG - (achteruit) 3'}

ELISA

supernatanten van gekweekte cellen, muizenserum en muis peritoneale lavage vloeistof werd geanalyseerd op cytokinen IL-1β, IL-18, IL-6 of IL-8 secretie door ELISA (BD Biosciences) volgens de instructies van de fabrikant.

generatie van THP-1 cellen die shRNAs Targeting genen van belang

shRNA vectoren tegen menselijke NLRP3, caspase-1 en ASC, en hun scramble vectoren zijn geschenken van Dr. Jurg Tschopp [56]. De generatie van THP-1 cellen die shRNAs kort, nt GATGCGGAAGCTCTTCAGTTTCA menselijke ASC coderende sequentie, nt CAGGTTTGACTATCTGTTCT menselijke NLRP3 coderende sequentie, nt GTGAAGAGATCCTTCTGTA van de 3 'UTR van humaan caspase-1 werden in pSUPER. Pol III promoter shRNA cassettes van deze vectoren en een lamine A /C-specifieke pSUPER controleconstruct werden in de lentivirale vector pAB286.1, een derivaat van PHR die een SV40-puromycine acetyltransferase cassette voor antibioticumselectie bevat.

• PLoS ONE: Negatieve Node Count Verbetering Voorspellende Voorspelling van de zevende editie van de TNM classificatie voor Gastric Cancer
• PLoS ONE: Natural History Kwaadaardige botziekte bij maagkanker: Final Resultaten van een Multicenter botmetastase Survey