PLoS ONE: Mycoplasma hyorhinis Активизирует NLRP3 инфламмасома и способствует миграции и инвазии клеток рака желудка

Абстрактный

Фон

Mycoplasma hyorhinis
( M.hyorhinis, M.hy
) связано с развитием язвы желудка и рака простаты. NLRP3 инфламмасома, белковый комплекс управления созреванию важных провоспалительных цитокинов интерлейкина (IL) -1β и IL-18, также участвует в онкогенеза и метастазирования различных видов рака.

Методология /Основные выводы
<р> Для уточнения M.hy
способствовали развитию опухоли с помощью инфламмасома активации, мы проанализировали ли моноциты для IL-1 и производства IL-18 при M.hy
вызов. При воздействии на M.hy
, моноциты человека демонстрировали быстрый и надежный IL-1 и секрецию IL-18. Кроме того, мы определили, что липидный-ассоциированный мембранный белок (LAMP) из M.hy
был ответственен за IL-1 индукции. Применение конкурентных ингибиторов, ген специфических shRNA и ген целевых мышей, мы проверили, что M.hy
индуцированной IL-1β секрецию NLRP3-зависимой в пробирке
и В естественных условиях
, Катепсина B активность, K + отлив, Ca 2 + приток и производство ROS были все необходимые для активации инфламмасома NLRP3 с помощью M.hy
. Важно отметить, что IL-1β, но не IL-18 производится из макрофагов, зараженных M.hy
желудка способствует миграции раковых клеток и инвазию.

Выводы
<р> Наши данные позволяют предположить, что активация инфламмасома NLRP3 на M.hy
может быть связано с его продвижения желудочного раковых метастаз, и анти- M.hy
терапия или ограничение сигнализации NLRP3 может быть эффективным подходом для контроля желудочного прогресса рака
<р> Образец цитирования:. Сюй Y, Li H, W Чен, Яо X, Y Син, Ван X и др. (2013) Mycoplasma hyorhinis
Активизирует NLRP3 инфламмасома и способствует миграции и инвазии клеток рака желудка. PLoS ONE 8 (11): e77955. DOI: 10.1371 /journal.pone.0077955
<р> Редактор: Суреш Yenugu, Университет Хайдарабад, Индия
<р> Поступило: 5 июня 2013 года; Принято: 6 сентября, 2013 года; Опубликовано: 6 ноября 2013
<р> Copyright: © 2013 Xu и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа была поддержана грантами от 100 талантов программы китайской академии наук, фонд естественных наук Китая (91029707, 31170868), Шанхай фонд естественных наук (11ZR1442600), Ново Нордиск-CAS Research Foundation, SA-SIBS стипендиальная программа, а также гранты от ключевых национальных программ по инфекционным заболеваниям (2012ZX10002007-003). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> микоплазмы плеоморфные, настенные бесплатно, прокариотические организмы, которые находятся либо на эукариотических клеточных мембран или внутри клеток, и они маленькие организмы, способные к самостоятельной репликации [1]. На сегодняшний день, по крайней мере 16 видов микоплазм, были выделены от человека [2]. Mycoplasma hyorhinis
( M.hy
) считался не патогенными для человека, как это обычно заражает свиней приводит к болезни дыхательных путей и воспаление грудной клетки и суставов [3], [4] , Тем не менее, накапливая данные свидетельствуют о том, что M.hy
инфекции в организме человека действительно приводит к клиническим результатам. M.hy
был обнаружен у 56% рака желудка, 55% карциномы толстой кишки и 52,6% от рака легких биопсии [5]. Кроме того, 36% мужчин с доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ) и 52% мужчин с раком простаты M.hy
серо- положителен. Эти клинические данные свидетельствуют о возможной связи между M.hy
экспозиции с желудочными, толстой кишки, легких и рака простаты [5], [6].

Upon микробной инфекции, принимающей модели распознавания рецепторов ( PRRs), такие как TLR, толку патогены и инициировать синтез провоспалительных цитокинов, таких как про-IL-1 β и про-IL-18 посредством активации NF-kB. В то же время, другая группа РРСС включая NLRP3 набирать адаптер белка ASC и приводят к активации каспазы-1, который представляет собой активную протеазу, которая расщепляет форма предшественником цитокинов, включая про-IL-1 β и про-IL-18 в зрелом, секретируемой форме [7]. Возбудители или сложные агенты вызывают вытекание калия, повреждение митохондрий, митохондрии высвобождение ДНК, образование активных форм кислорода, внутриклеточное увеличение кальция или клеточный снижение циклического АМФ в врожденных иммунных клеток, которые все участвующие в активации каспазы-1 [8], [9], [10 ], [11], [12], [13]. В ходе этого процесса NLRP3, ASC и про-каспазы-1 образуют молекулярную платформу под названием инфламмасома. До сих пор, ряд инфламмасома были идентифицированы, из них, инфламмасома NLRP3 было установлено, связано с развитием опухоли [14], [15], хотя существует некоторое противоречие между разных моделей [16], [17]. Тем не менее, IL-1β, как сообщается, способствуют росту клеток и метастазирования опухолей путем индукции несколько про-метастатические генов, таких как металлопротеиназы матрикса и эндотелиальных молекул адгезии, а также TGF-бета, хемокинов и факторов роста [18]. В корейской популяции, сочетание повышенной слизистых оболочек уровня IL-1 и гомозиготности для IL-1β -31T одного нуклеотидного полиморфизма (SNP), оба связаны с повышенным риском развития рака желудка [18]. Кроме того, Ту и др. обнаружили, что желудок-специфическую экспрессию человеческого IL-1 у трансгенных мышей привело к спонтанному желудка воспаления и рака [19], далее предположить, что IL-1β может способствовать канцерогенез желудка человека. В противоположность этому, IL-18 усиливает активность NK-клеток, уменьшает туморогенез, индуцирует апоптоз и ингибирует ангиогенез в опухолевых клетках оказывать противоопухолевые эффекты [20], [21]. Кроме того, было обнаружено несоответствующей производство IL-18, чтобы внести свой вклад в патогенезе рака предстательной и могут влиять на клинические результаты у пациентов [22]. IL-18 было сообщено, чтобы стимулировать матричной металлопротеазы-9 производства, что приводит к увеличению миграции и вторжения в коронарной артерии гладкомышечных клеток и HL-60 миелоидной лейкемии клеток [23], [24]. Было также сообщено, что в сыворотке крови IL-18 уровень при раке желудка группе пациентов была значительно выше, чем при язвенной болезни желудка группе пациентов [25] и IL-18 может увеличить метастазирование и иммунной побег рака желудка через понижающую регуляцию CD70 и содержание CD44 в линии клеток рака желудка человек NCI-N87 и SNU16 [26]. Это также является важным медиатором миграции VEGF-расширение в желудочном линиях раковых клеток человека СНУ-601 [27]. Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что Mycoplasma hyorhinis
может способствовать миграции и инвазии клеток рака желудка путем активации инфламмасома.

На сегодняшний день широкий спектр микробов, включая вирусы, бактерии, грибы и простейшие было определены для активации NLRP3 инфламмасома [28]. Недавнее исследование показало, что микоплазма пневмонии
также способна индуцировать продукцию IL-1 в клетках человека [29]. Тем не менее, является ли <ЕМ> M.hy
, что является важным фактором в развитии рака желудка, как упоминалось выше [5], [30], [31], активирует инфламмасома NLRP3 и способствует ли эта активация к раку желудка развития остаются неизвестными. В этом исследовании мы обнаружили, что M.hy
вызвал IL-1 секрецию в NLRP3 инфламмасома-зависимым способом, и полученный IL-1β индуцированной миграции и вторжение клеток рака желудка.

Результаты

M.hy
Триггеры IL-1β и IL-18 Производство в ТНР-1 клеток
<р> Для того, чтобы определить, является ли <еМ> M.hy
индуцирует IL -1β производства от врожденных иммунных клеток, мы провели мониторинг зрелых уровни IL-1 в линии клеток человека моноцитарного ТНР-1 клетки заражали различными количествами M.hy
. В этом эксперименте, сильной индукции IL-1, в зависимости от дозы наблюдалось (Рис. 1А) Далее, мы измерили про-IL-1β уровни мРНК в клетках и зрелых уровней белка IL-1β в супернатантах культуры в различные моменты времени после M.hy
вызов. Было обнаружено, что уровни IL-1β мРНК достиг максимума через 3 часа после того, как вызов (Фиг.1В) и зрелого IL-1 (рис 1C) и ИЛ-18 (рис 1D) уровни белка достигло максимума в 12 часов после заражения. Кроме того, THP-1, полученные макрофаги также демонстрируют надежные секрецию IL-1, IL-18, а также других воспалительных цитокинов, таких как IL-6 и IL-8 (рис 1E, рис S1). Чтобы подтвердить вышеуказанные выводы, содержащиеся в ТНР-1 клеточной линии, мы исследовали продукцию IL-1 в первичных человеческих моноцитов от здоровых доноров, зараженных M.hy
, в котором IL-1β был также сильно индуцируется (рис 1F) , Эти данные указывают на то, что M.hy
вызвал устойчивую IL-1 и секрецию IL-18 из миелоидных клеток человека.

ЛАМПА получается из M.hy
отвечает за IL -1β Индукционная через TLR2

Далее мы исследовали, был ли требуется репликация M.hy
для IL-1 производства в моноцитов. Как показано на рисунке 2А, ​​ M
.hy
инактивированной нагреванием или ультрафиолетовым (УФ) лечения индуцированной столько IL-1 секреции из ТНР-1 клеток в качестве живой M .hy
. Это свидетельствует о том, что некоторые термо- и устойчивый компонент M.hy
УФ- был ответственен за индукции IL-1 секреции. Липидный-ассоциированный мембранный белок (LAMP) в большом количестве экспрессируется на поверхности M.hy
[32], и предыдущее исследование показало, что мембранные липопротеины из других видов микоплазм индуцированной IL-1β секрецию [33]. Таким образом, мы предположили, что M.hy
полученный ЛАМПА (MLAMP) может нести ответственность за IL-1 индукции в клетках ТНР-1. Затем мы извлечь лампу из M.hy
(рис 2В) и протестировали способность MLAMP индуцировать IL-1β секрецию в клетках ТНР-1. Мы обнаружили, что MLAMP явно индуцированной секреции IL-1 в зависимости от дозы, в то время как водная фаза M.hy
экстракт был не в состоянии сделать так (рисунок 2в). Чтобы исключить возможную РНК и /или загрязнения ДНК в MLAMP, мы относились к MLAPMs с РНКазы и ДНКазы и обнаружили, что MLAMP был основным компонентом для IL-1 индукции (рис S2).
<Р> Было сообщено, что MLAMP в основном активированный NF-kB через TLR2 и TLR6 [34], [35]. Таким образом, мы впервые применили TLR2 T2.5 нейтрализующие антитела блокировать сигнал TLR2, с CONT2, выступающей в качестве контроля изотипа [36]. Как показано на рисунке 2D, T2.5 полностью блокировали секрецию IL-1, стимулированную TLR2 агониста P3CSK4 но не лиганда LPS TLR4. Важно отметить, что IL-1β секрета из M.hy
инфицированных клеток сильно уменьшается T2.5, указывая, что TLR2 был вовлечен в MLAMP вызвало IL-1 секрецию в человеческих моноцитов. Интересно, что IL-1β секрета из M.hy
инфицированных клеток не была полностью блокирована T2.5 (рис 2D), который предположил, что TLR2-независимый сигнальный путь также был вовлечен в MLAMP вызвало IL-1 секреции, которая заслуживает дальнейшего исследования в будущем.

M.hy
индуцирует IL-1β секреция посредством активации NLRP3 инфламмасома
<р> Чтобы проверить, является ли M.hy <бр> индуцированное IL-1β секреции через инфламмасома активации, мы впервые использовали LPS загрунтованных ТНР-1, полученные макрофаги, чтобы проверить, если M.hy
может активировать инфламмасома как АТФ или МГУ, которые известны инфламмасома активаторов. Как показано на рисунке 3А, M
.hy
была способна индуцировать IL-1 высвобождения в загрунтованных клетках. Далее мы исследовали расщепление каспазы-1 и олигомеризации ASC, два важных органов в целях активации инфламмасома. Мы обнаружили, что M.hy
способствовало расщепление каспазы-1 и олигомеризации ASC (рис 3B), что указывает на прямую активацию инфламмасома с помощью M.hy.

<Р> Кроме того, мы тестировали EM> M.hy
индуцируется ли M.hy
вызов (Рисунок 3E), указывая, что M.hy
индуцированной IL-1β секреции зависит от каспазы-1 и ASC.
<р> Затем мы тестировали, был ли необходим NLRP3 для M.hy
индуцированное IL-1β секрецию. Во-первых, мы обнаружили, что ингибитор NLRP3 глибенкламид подавляются M.hy
индуцированной IL-1β секрецию в зависимости от дозы (рис 3F) [37]. Когда конкретный shRNA использовали для подавления экспрессии NLRP3 (рис 3G), производство IL-1β сильно уменьшилось на M.hy
вызов (Рисунок 3Н), указывая, что M.hy
индуцированной секреции IL-1β зависит от NLRP3. Это было дополнительно подтверждено с помощью иммуноблоттинга, в котором активация каспазы-1 и ИЛ-1β производства оба NLRP3 зависимыми (рис 3I). Кроме того, мы также обнаружили, что MLAMP был основной компонент, отвечающий за активацию инфламмасома NLRP3 на M.hy
(рис S2C). Кроме того, было сообщено AIM2 инфламмасома быть активированы с помощью ДНК [38], и мы обнаружили, что M.hy
ДНК индуцированных IL-1β секрецию с помощью AIM2 инфламмасома (рис S3A). Интересно, что M.hy
индуцированной IL-1β секрецию в основном зависит от NLRP3, в то время как AIM2 лишь частично вовлечен (рис S3A). Взятые вместе, эти результаты ясно показали, что M.hy
индуцированное IL-1β секреции посредством активации инфламмасома NLRP3 в моноцитами человека.

Механизмы, лежащие M.hy
Срабатывает NLRP3 инфламмасома Активация
<р> Активация NLRP3 инфламмасома с помощью различных стимулов зависит от активности катепсина B, K + эффлюксного, приток кальция и /или производство активных форм кислорода (ROS) [11], [ ,,,0],12], [13], [39]. Для того, чтобы исследовать механизмы, лежащие в основе IL-1 релиз в ответ на M.hy
вызов, мы впервые применили катепсина B-специфический ингибитор CA-074 Me и наблюдали значительное ослабление IL-1 секреции при M .hy
вызов. При концентрации 100 мкМ, CA-074 Me полностью заблокирован ИЛ-1β-релиз (рис 4A). Это ингибирование не из-за какой-либо токсического эффекта на клетки, как секрецию IL-8, пострадавших от этого ингибитора был очень мягким (рис 4Е). Важно отметить, что, когда клетки обрабатывали катепсина K ингибитора I, снижение IL-1 секреции не было видно на всех (фиг.4В и 4F), предполагая, что катепсина B активность была специально участвует в активации инфламмасома NLRP3 во время M .hy
вызов. Кроме того, когда мы блокировали K + оттоком за счет увеличения внеклеточной K +, концентрация IL-1 секрецию ТНР-1 клеток при M.hy
задача была значительно уменьшена в от дозы зависимым образом (рис 4C). Опять же, не было никакого токсический эффект от KCL, как производство IL-8 из тех же клеток, была нормальной (рис 4G). Для того, чтобы выяснить, помогло ли приток кальция инфламмасома активации, мы добавили различные дозы EGTA в среде для культивирования клеток и обнаружили, что лечение EGTA заблокирован M.hy
-индуцированное IL-1 секрецию в зависимости от дозы, и не наблюдалось токсический эффект от EGTA, о чем свидетельствует IL-8 производства (рис 4D и 4H).
<р> Кроме того, мы проверили, действительно ли <ЕМ> M.hy
вызов индуцированная РОС в ТНР-1 клеток , Для этого анализа клетки ТНР-1 впервые были загружены с окислительно-восстановительным чувствительных флуорофора DCFDA и затем заражали <ЕМ> M.hy
, АТФ был включен в качестве положительного контроля. Как показано на рисунке 5А, 16,9% СМ-H2DCFDA положительные клетки были обнаружены через 30 минут после M.hy
лечение по сравнению с необработанными клетками в 1,6%. Эти данные свидетельствуют о том, что ROS может способствовать активации инфламмасома NLRP3 в ответ на M.hy
вызов. Чтобы проверить эту возможность, мы предварительно обработанные клетки ТНР-1 с ингибитором ROS diphenyliodonium (DPI) в течение 30 минут, а затем бросили вызов клетки с M.hy
перед измерением IL-1 производства 6 часов спустя. Как и следовало ожидать, DPI резко снижается M.hy
индуцированное IL-1β-релиз (рис 5б). Недавнее исследование показало, что ингибитор ROS, такие как DPI отменило высвобождение IL-1 в макрофагах мышей путем ингибирования экспрессии гена NLRP3 [40]. Таким образом, мы также контролировали уровень мРНК про-IL-1 и NLRP3 при обработке DPI. Мы обнаружили, что ДОИ заметно снижала экспрессию про-IL-1 β и NLRP3 (5С-D), что согласуется с выводом из клеток мыши [40]. Кроме того, мы также исследовали активацию каспазы-1 и обнаружили, что низкие дозы (1 или 10 мкМ) лечения DPI не влияет на активацию каспазы-1 в то время как 100 мкМ ингибирует активацию ДОИ каспазы-1 (рис 5е). Это свидетельствует о том, что в человеческих клетках DPI вмешивались с активацией инфламмасома NLRP3 путем ингибирования NLRP3 транскрипции, а также активность каспазы-1 активности, когда была применена высокая доза. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что активность катепсина B, K + оттоком, Ca 2 + приток и ROS все это способствовало активации инфламмасома NLRP3 в ответ на M.hy
вызов.

M.hy
Активизирует NLRP3 инфламмасома в естественных условиях

<р> Когда мышь из костного мозга дендритные клетки (BMDCs) были заражены M.hy
, устойчивый индукции IL-1β наблюдалось (рис 6A). Дальнейшие эксперименты по BMDCs изолированы от дикого типа (WT) мышей или мышей, дефицитные по каспазы-1, ASC или NLRP3 с M.hy
вызов подтвердил, что M.hy
индукция ИЛ 1β был NLRP3 инфламмасома зависимой (рис 6В). Кроме того, системная прививка M.hy
у мышей WT индуцированных IL-1β производства в сыворотке крови и перитонеального лаважа (PLF), но не у мышей, не имеющих ASC или NLRP3 (рис 6C-D). Интересно, что базальный уровень IL-1 в КУС дефицитных мышей была явно выше, чем в WT или NLRP3 дефицитных мышей, но проблема с M.hy
не приводит к дальнейшему увеличению секреции IL-1 в таких мышей (Рисунок 6C-D). В совокупности эти результаты подтвердили, что M.hy
также активируется NLRP3 инфламмасома у мышей в пробирке
и В естественных условиях
.

M. гип
индуцированные IL-1β способствует Желудочный Опухоль миграции клеток и вторжения
<р> Приведенные выше данные ясно показывают, что M.hy
была способна индуцировать IL-1 производства от врожденных иммунных клеток через NLRP3 инфламмасома активации. Ранние исследования показали, эпидемические возможную роль микоплазм в развитии рака [5] желудка. И Mycoplasma hyorhinis
была продемонстрирована для содействия миграции опухолевых клеток, инвазию и метастазирование в пробирке
и В естественных условиях
[41]. Мы предположили, что может существовать другой механизм для продвижения, который является, что <ЕМ> M.hy
может способствовать рака желудка и /или метастазирование путем продвижения IL-1 производства. И мы подтвердили, что M.hy
желудка способствует миграции раковых клеток и инвазии (рис S5). Так как <ЕМ> M.hy
была продемонстрирована для инфицирования клеток рака желудка ([41], рис S4), то, таким образом, возможно, что M.hy
может индуцировать инфламмасома активацию в раковых клетках непосредственно. Тем не менее, нет активации инфламмасома не был обнаружен в раковых клетках желудка (рис S6).
<Р> Далее мы определили влияние человеческого рекомбинантного IL-1 (RIL-1) на желудочную раковых клеток канцерогенеза в анализе формирования колонии, показало, что RIL-1β не оказывает влияния на пролиферацию клеток рака желудка линии MGC-803 (рис S7). Так как IL-1β было сообщено способствовать метастазирование опухолей других [18], мы проверили эффекты RIL-1 по миграции и инвазии клеток MGC-803. Наши результаты показали, что миграция и вторжение МГЦ-803 были расширены с RIL-1 β обработки (рис 7А и 7С), в то время как лечение с помощью RIL-18 не показали никакого эффекта (фиг.7В и 7D). Далее, мы рассматривали эти желудочные раковые клетки с супернатантов культуры от M.hy
вызов ТНР-1, полученные макрофаги или макрофаги с молчанием NLRP3, ASC и каспазы-1 для миграции и инвазии анализа. Наши результаты показали, что культуральные супернатанты от M.hy
вызов клеток макрофага скремблирования активно подкрепляет миграцию и инвазии клеток рака желудка, в то время как супернатанты культуры от NLRP3, ASC или каспазы-1 нокдаун макрофагов не делали, вероятно, из-за уменьшенного IL-1 секреции (рис 8A и 8C). Эта повышенная миграция и вторжение клеток MGC-803 была отменена путем обработки клеток с анти-IL-1 β монАТ (фиг.8В и 8D). Взятые вместе, наши результаты показали, что M.hy
индуцированной миграции и инвазии клеток рака желудка линии MGC-803, продвигая IL-1 секрецию из моноцитов. Кроме того, наши данные свидетельствуют о том, что M.hy
индуцированной активации инфламмасома может способствовать M.hy
репликации (Рисунок S8), который может создать положительный результат воздействия и, наконец, приводит к хроническому течению болезни.

Обсуждение
<р> Микоплазмы отличить себя от других бактерий малыми размерами, минутным генома и отсутствие клеточной стенки. Многие микоплазмы установить колонизацию и инфекцию с помощью соблюдения тканей хозяина. Поскольку их динамическая архитектура поверхность антигенно и функционально универсален, микоплазмы способны уклоняться от иммунной атаки хозяина и адаптации к среде обитания многих и вызывают хронические заболевания [32]. Поскольку идентификация M.hy
от свиней в 1962 году, небольшое исследование было проведено на патогена, пока это не было установлено, что связано с несколькими злокачественных опухолей человека [5], [41], [42], [ ,,,0],43]. Совсем недавно ученые обнаружили, что M.hy
белок p37 был ответственен за продвижение раковых клеток инвазивность и метастазирование [30], [44]. Помимо этого прямого механизма, этот микроорганизм может также вызывать образование опухолей или метастазов косвенно через локальную хронического воспалительного процесса. Хорошо известно, что IL-1β является важным провоспалительных цитокинов, что способствует росту раковых клеток толстой кишки и усиливает инвазивность и метастазирование клеток меланомы В16 [19], [45]. был найден Сверхэкспрессия IL-1, чтобы вызвать воспаление желудка и рак у мышей [19]. В данном исследовании мы исследовали ли инфламмасома NLRP3, который управляет IL-1 β созреванию, активировали M.hy
, и может ли эта активация способствует M.hy
ассоциированных желудка метастазирование , Наши результаты показали, что M.hy
активировал инфламмасома NLRP3 в пробирке
и В естественных условиях
, а также содействие желудочной миграции раковых клеток и вторжения M .hy
зависит от активации инфламмасома NLRP3. К тому же NLRP3, мы обнаружили, что M.hy
ДНК также активирована инфламмасома AIM2, но активация MLAMP из NLRP3 был доминирующим компонентом для IL-1 индукции M.hy.

<р> недавно сообщалось, что ацилированный липопептидный из убитых нагреванием микоплазмы Acholeplasma laidlawii
(HKAL) индуцированное IL-1β производства через nlrp7 инфламмасома в клетках человека, в то время как общая HKAL индуцированное IL-1β секреции частично NLRP3 зависимой [46], что указывает на несколько инфламмасома может быть активирован с помощью определенной микоплазмы. Наши данные не исключают возможности участия в nlrp7 M.hy
индуцированное IL-1β производства, но M.hy
основном активировал инфламмасома NLRP3, поскольку секреция IL-1β был почти полностью упразднен в NLRP3 притихли клеток (рис 3Н и 3I).
<р> Ранние исследования предположил, что ROS активировал инфламмасома NLRP3 путем активации каспазы-1 [47]. Однако недавние исследования показали, что ингибиторы ROS мешали транскрипции IL-1 и NLRP3, но не влияет на активацию каспазы-1 в клетках мыши [40]. В нашем исследовании, хотя ROS торможение с низкой дозой DPI (10 мкМ) значительно снизило производство IL-1 при M.hy
вызов, он не ингибирует активность каспазы-1 расщепление, маркер инфламмасома активации. Однако, когда была применена высокая доза DPI (100 мкМ), каспазы-1 расщепление явно тормозится (рис 5E), предполагая, что высокая доза DPI может подавить сборку инфламмасома комплекса, хотя мы не можем исключить возможность того, что этот эффект может были результатом мРНК NLRP3 отменяя от базовой линии (рис 5D). Вполне вероятно, что ингибитор ROS может мешать как про-IL-1 синтеза и активации каспазы-1.
<Р> Как M.hy
способствует выработке активных форм кислорода в макрофагах остается неуловимым. Отсутствие клеточной стенки из M.hy
допускает непосредственный контакт Mycoplasma мембраны и клетки-хозяина мембраны, и этот контакт может привести к слиянию микоплазмой с эукариотической клеткой-хозяином. Этот синтез может привести не только к микоплазмами компонентов, доставляющих в клетку-хозяина, но также можно было вставить микоплазма компонентов мембраны в мембрану эукариотической клетки-хозяина. В последнее время, были обнаружены M.hy
мембраны обладают фосфолипаза A (PLA), которые могут быть вовлечены в процесс разрушения плазмалеммы, что происходит при вторжении клеток-хозяев [48], [49]. Во время этого процесса, клетки-хозяева могут производить ROS. Было бы стоит исследовать, требуется ли PLA для M.hy
индуцированное ROS производство и IL-1 секреции.
<Р> Как свидетельствуют наши данные, лизосомальная разрыв, K ^{+ отток, Ca 2 + приток и ROS все были вовлечены в M.hy
индуцированной активации NLRP3. Как сообщалось ранее, K + отлив и разрыв phagolysosomal может вызвать Са 2 + приток, в то время как Са 2 + приток может привести к дисфункции митохондрий, что приводит к выделению окисляется митохондриальной ДНК (мтДНК) в цитозоль, где он связывается с и активировать инфламмасома NLRP3 [9], [12]. Митохондрии, кажется, действует в качестве центрального узла для интеграции различных сигналов, измеренных NLRP3, но относительный вклад ROS и мтДНК для активации инфламмасома NLRP3 до сих пор не ясно, до настоящего времени [9].
<Р> Несмотря на то, M .hy
не сильно вирулентным, он может установить хроническую инфекцию. Постепенным и прогрессирующей взаимодействия с клетками-хозяевами, он индуцирует хромосомной нестабильности и злокачественной трансформации, способствуя тем самым росту опухоли, миграции или инвазии [50], [51]. M.hy
p37 белка способствует клетку рака желудка, рака предстательной железы и меланомы клеточных линий инвазивности [30], [31]. Кроме того, провоспалительные микросреда, таких как производство IL-1 β также может внести свой вклад в этот процесс [19]. Наше исследование показало, что M.hy
индуцированное IL-1β способствует миграции и инвазии желудочных раковых клеток, в то время как M.hy
индуцированное IL-18 не способствует миграции и инвазии клетки рака желудка, который отличается от других докладов [26], [27]. Возможное объяснение состоит в том, что IL-18, возможно, способствовало клеток рака желудка миграцию и инвазию с помощью регуляции CD70, CD44 и экспрессии VEGF в иммунных клетках, который заслуживает нашего дальнейшего исследования [26]. Другим объяснением может быть то, что доза RIL-18 они использовали (150 нг /мл) намного выше, чем то, что мы использовали [27]. Кроме того, ИЛ-1β способствовала миграции и инвазии желудочных раковых клеток может быть опосредован матричных металлопротеиназ-9 (ММП-9), как и другие искатели сообщили [52]. Однако, чтобы получить прямой и более убедительные доказательства и соответствующие механизмы о связи между активацией NLRP3 инфламмасома вызванной M.hy,
желудка и метастазирование рака, соответствующие модели животных, таких, как В естественных условиях <бр> инвазия опухоли анализа [53], и пациент исследования необходимы для дальнейшего изучения в будущем.}

Материалы и методы

культура клеток

ТНР-1 клетки, PMA-индуцированное макрофаги и клетку рака желудка MGC-803 поддерживали в среде RPMI 1640 с эфирными добавками. Человеческие моноциты выделяли путем Percol ТМ плотности центрифугирования в градиенте (GE Healthcare, бионаук, Швеция) от человека мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК), полученный из Шанхая Центр крови (Шанхай, Китай).

M.hy
Процедить и обнаружения PCR

M.hy
используемый штамм в нашем исследовании была получена из зараженной культуры клеток. обнаружение микоплазма проводили через два раунда ПЦР с клеточной культуральной среды [54]: Во-первых, запустить ПЦР с четырьмя праймеров 5'-ACACCATGGGAGYTGGTAAT-3 ', 5'-CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT-3', 5'-AAAGTGGGCAATACCCAC GC-3 ', 5'-TCACGCTTAGATGCTTTCAGCG-3 'с клеточной культуральной среды в качестве матрицы. Во-вторых, принимать по 1 мкл Указанный выше продукт ПЦР в качестве матрицы и запустить ПЦР с использованием праймеров, три 5'-GTGSGGMTGGATCACCTCCT-3 ', 5'-GCATCCACCAWAWACY CTTT-3', 5'-CCACTGTGTGCCCTTTGTTCCT-3 '. Первый и второй ПЦР работает в тех же условиях цикла. Затем мы исследовали последовательность ПЦР-продукта и получены следующие последовательности: ACTCTTACTTAATTTAAAAGTTAATACAACTTTAATATT GCCTATTATTGCTAAAGATAAATATCTTAAGGTATTTTAATATTGGTAATCTATTTTAGAAATTTAATTTAAAAATTAAACTCGGTTATAAAAAAGATCGTTGAAATAATAAATATGAAGTTAATCATATTGTTATTTGCTATTCAGTTTTCAAAGAACTATAATTGAGAACTTAAAGCTCTCAAAACTAGACACGAATCGATTATGTAATAAGTCAATTAAGACTAACGGAAAGCGGAAAAAGAAGGTGATCCGTCCCCACG. По BLAST в базе данных NCBI, мы получили информацию о том, что микоплазма M.hy
. Это может быть SK76, ГДЛ-1 или штамм MCLD.

M.hy
Культура, ДНК Добыча и MLAMP Подготовка

M.hy
WAS культивируют в модифицированной SP-4 среде, содержащей 20% сыворотки новорожденных крупного рогатого скота, 10% дрожжевой экстракт, 1% глюкозы, 0,00024% phenolsulfonphthalein и 1000 МЕ /мл пенициллина. Выделение ДНК из M.hy
была проведена в соответствии с инструкциями с реагентами, предоставляемых Shanghai Lifefeng биотехнологии Лтд M.hy
количественно в качестве единиц изменения цвета (CCU) в миллилитр, как описано [55]. Экстракция MLAMP проводили, как описано ранее [34].

ПЦР в реальном времени
<р> экспрессия мРНК NLRP3 и IL-1β определяли с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Относительное количественное определение генов были нормализованы против эндогенного контроля бета-актина с помощью формулы [2 -ΔCt (ген-мишень-β-актин)]. Праймеры были использованы: гомо сапиенс (HS) IL-1β, 5'-CACGATGCACCTGTACGATCA- (вперед) 3 ', 5'-GTTGCTCCATATCC TGTCCCT- (обратный) 3'; b-актин, 5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG- (вперед) 3 ', 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC- (обратный) 3'; NLRP3, 5'-AAGGGCCATGGACTATTTCC- (вперед) 3 ', 5'-GACTCCACCCGATGACAGTT- (обратный) 3'. M.hy
копии ДНК dertermined путем количественного ПЦР в реальном времени с методологией стандартной кривой для абсолютных чисел копий. Конкретные праймеры для M.hy
были:. 5'- CGATTCGTGTCTAGTTTTGAG - (вперед) 3 ', 5'- ATTGCCTATTATTGCTAAAG - (обратный) 3'

ELISA
<р> анализировали Супернатанты из культивируемых клеток, сыворотки мыши и мыши перитонеального лаважа для цитокинов IL-1, IL-18, IL-6 или секрецию IL-8 с помощью ELISA (BD Biosciences) в соответствии с инструкциями изготовителя.

Генерация ТНР-1 клеток, экспрессирующих shRNAs Таргетинг интерес генов
<р> shRNA векторы против человеческого NLRP3, каспазы-1 и ASC, и их скремблирования векторов подарки от доктора Юрга Чопп [56]. О генерации клеток ТНР-1, экспрессирующих shRNAs, кратко, нт GATGCGGAAGCTCTTCAGTTTCA последовательности ASC кодирующей человеческий, нт CAGGTTTGACTATCTGTTCT человеческого NLRP3 кодирующей последовательности, нт GTGAAGAGATCCTTCTGTA из 3'-UTR человеческой каспазы-1, были вставлены в pSUPER. ПОЛ III промотор shRNA кассеты из этих векторов и из ламин А /С конкретной конструкцией управления pSUPER были вставлены в лентивирусов вектора pAB286.1, производное нск, который содержит SV40-пуромицин ацетил-трансферазы кассету для выбора антибиотика.

• PLoS ONE: Отрицательный Node Count Улучшение прогностический Прогнозирование седьмое издание TNM классификации при же…
• PLoS ONE: Естественная история злокачественного заболевания костей у рака желудка: Окончательные результаты опр…