MicroRNA-144 bremst den Metastasen vun gastric Kriibs duerch gezielt hunn Ausdrock

MicroRNA-144 bremst den Metastasen vun gastric Kriibs vun begéint Ausdrock VerfÜgung méiglech VerfÜgung Gastric Kriibs gezielt (GC) bleift eent vun den heefegen Zorte vun malignant Kriibs, an de molekulare Mechanismus hir Metastasen Basisdaten ass nach gréisstendeels onkloer. MicroRNAs hunn wéi wichteg Reglementatioun vun Metastasen well vun hire Géigner ze handelen op multiple sécher Weeër erweist. An eiser Etude, hunn mer dat Mir-144 bedeitend Souwuel héich metastatic GC Zell Linnen an Stoffer downregulated ass. Resultat vu béide gewannen-vun-Funktioun a Verloscht-vun-Funktioun Experimenter fräi Mir-144 Ausdrock vill GC Zell Migratioun reduzéiert hierkommen Mir-144 Ausdrock dramatesch verstäerkte GC Zell Migratioun ofgeholl. D'begéint proto-oncogene (hunn), déi dacks am mënschleche Cancers a Funktiounen als eng wichteg regulator vun Zell Wuesstem an entholl Invasioun Kick ass, gouf als direkten Zil vum Mir-144 identifizéiert. Desweideren, silencing vun begéint mat klenge interfering RNS (siRNA) recapitulated der anti-metastatic Funktioun vum Mir-144, hierkommen Staatsfinanzen hunn Ausdrock d'Funktioun vum Mir-144 am GC Zellen attenuated. Doriwwer eraus, hunn mer dat Mir-144, déi sech gezielt, phosphorylation vun Akt Hien. Endlech, observéiert mir en ëmgedréit, et gesäit Korrelatioun tëschent den Ausdrock vun Mir-144 a begéint mRNA am GC metastatic Stoffer. Am Resumé, Hien GC Werdegang Mir-144 vun direkt downregulating begéint Ausdrock, deen dono Aktivatioun vun de pro-oncogenic Akt Passerelle hält. Esouguer eventuell vum Mir-144 Ausdrock am GC Zellen eng attraktiv therapeutesch Approche Kaddoen der Metastasen vun gastric Kriibs ze blockéieren. VerfÜgung Schlësselwieder VerfÜgung microRNA Mir-144 begéint Gastric Kriibs Investitiounen Erschléisse VerfÜgung weltwäit, gastric Kriibs (GC) ass eng vun de meeschte verwandelt Zorte vun malignant Krankheet. An 2008, huet ongeféier 989.600 nei Fäll vu GC diagnostizéiert. Doriwwer eraus, war GC als Ursaach vun 738.000 Doudesfäll agebonne, GC Mëtt spazéieren an de véiert stäerkste gemeinsam malignancy an den Haaptfiguren Ursaach vum Kriibs Doud weltwäit [1]. Wéi de entholl Verlaf entwéckelt et der ëmmer ronderëm Stoffer ze violéieren a metastasize. D'hepatocyte Wuesstem Faktor receptor, kennegeléiert, ass gewosst der motility an invasiv Méiglechen stoussen vun entholl Zellen [2] ze förderen. Erfëllt ass e Member vun der Famill receptor tyrosine kinase a gouf vun villen erhéijen [3-5] upregulated gewise gin. Et gëtt ugeholl, datt sech Ausdrock Niveau vun entweder Gentherapie amplification oder hypoxia via HIF1α fräi ass. An Patienten mat metastatic GC, kennegeléiert amplification a staark FAQ Ausdrock sinn net zouverlässeg. Dës Evenementer schéngen ze vill mat encadréiere Medeziner Resultat verbonne ginn [6]. Ongeféier 10% vun de wäisse Patienten Hafe engem Gewënn vun fënnef oder méi Kopië vun begéint. Ausserdeem, ass dëse falschen an erfëllt Kopie Zuel däitlech mat encadréiere hätt verbonne [7]. Doriwwer eraus, hunn d'Mir-34a /c microRNAs gouf aus Aarbecht Kriibs, hepatocellular carcinoma an GC [8-10] ofgeleet dës Distanz bis erof begéint Ausdrock zu Zell Linnen well. VerfÜgung MicroRNAs (miRNAs) sinn Net-coding RNS Molekülle, ongeféier 21-23 nucleotides zu Längt, déi Gene Ausdrock um transcriptional oder post-transcriptional Niveau regléieren [11-13]. miRNA Ausdrock Analysë profiling hunn eng global downregulation vun alen miRNA Niveauen am mënschleche erhéijen famill ze normal Stoffer réischt [14]. Ausserdeem, kann miRNAs zu Funktioun entweder eng entholl suppressor oder oncogenic Roll, jee op d'Funktioun vun hirem Ziel. Zum Beispill, gouf Mir-133b bedeitend an GC Stoffer verwandelt-reglementéiert an seng Nofolleg Roll seng entholl suppressor am GC Zellen [15]. Ausdrock vun Mir-337-3p war zu lymph Node metastatic Stoffer vun GC Patienten, an Aféierungs- vum Mir-337-3p Ausdrock vill downregulated hutt gastric Kriibs Zell Invasioun Muecht [16] reduzéieren. Mir-25 ënnerstëtzt Werdegang GC vun TOB1 Ausdrock direkt downregulating; dofir, fräi Meenungsäusserung vum Mir-25 Kaddoen e Potential noninvasive uweist fir d'Iwwregens hätt vun GC Patienten [17]. Zousätzlech Mir-7 ass wiesentlech zu souwuel héich metastatic GC Zell Linnen an metastatic Stoffer downregulated. Overexpression vum Mir-7 bremst Ofstand GC Metastasen vun den Ausdrock vun der Insulin-wëll Wuesstem Faktor-1 receptor (IGF1R) oncogene gezielt [18]. An GC Zell Linnen, esouguer eventuell vum Mir-144 Ausdrock Resultater vun Repressioun vun ZFX, déi mëttelméisseg Kriibs Zell waat bis 5-fluorouracil Chimiotherapie zouhëlt. An 93 Fäll vun der Primärschoul GC, manner war Mir-144 Ausdrock mat aarmséileg hätt verbonne [19]. Dës Beispiller hunn d'Haaptroll vun miRNAs am GC malignance a Kriibs Werdegang beliicht. VerfÜgung An dëser Etude, zeechne mir d'Ziler an definéiert de Mechanismus vun Aktioun vum Mir-144 am GC. Vun Pinguin ectopic Ausdrock vu Mir-144, mir entdeckt begéint ass eng Verfilmung Zil vum Mir-144 Regulatioun. Dëst brengt war op béide mRNA an FAQ Niveauen bestätegt, an reporter Gentherapie luciferase assays direkt bindend vum Mir-144 zu der reglementaresche bindend Site vun der 3'UTR vun begéint ubelaangt. Doriwwer eraus, hunn mer dat erfëllt Ausdrock inversely deemolegt Weltbild nëmmen Mir-144 Niveauen an engem klengen awer gutt-dokumentéiert GC Kohort. Mir hypothesize dass Mir-144 GC Metastasen bremst, an datt e puer vun dëse inhibition vun gezielt hunn Ausdrock mediated ass. VerfÜgung spontan a Methoden VerfÜgung Mënscherechter Otemschwieregkeeten uplanzen an Zell Linnen VerfÜgung GC Echantillon vun Patienten gesammelt goufen deen Agrëff mécht um Fudan University Shanghai Cancer Center tëscht 2012 an 2013 war de Protokoll vun der Fuerschung IFLA- Comité vun Fudan Uni, an d'Fuerschung war duerchgefouert no de Bestëmmunge vun der Helsinki Deklaratioun vu 1975 sollt daueren All Echantillon waren mat der Awëllegung kritt guttgeheescht vun de Patienten. De Mënsch GC Zell Linn AGS (ATCC® loosen-1739 ™), SNU-1 (ATCC® loosen-5971 ™), SNU-5 (ATCC® loosen-5973 ™), SNU-16 (ATCC® CRL- 5974 ™) , NCI-N87 (ATCC® loosen-5822 ™), a Kato III (ATCC® HTB-103 ™) sech haten an DMEM 10% an et Bovine serum mat. All Zell Strecken zu Medien wouvun penicillin (100 IU /ml) an streptomycin (100 mg /ml) bei 37 ° C mat 5% CO2 haten. D'miRNA mimics an inhibitors sech aus Ambion (Austin, Suerge, USA) kaaft. VerfÜgung RNS erauszéien a real-Zäit Hinnen alleguer VerfÜgung Total RNS vun Zellen ofgebaut gouf benotzt TRIzol (Invitrogen, Karlsbad CA). Fir miRNA Analyse, puer dovun (A) Schwänz sech ze total RNS benotzt puer dovun (A) polymerase (Ambion, Karlsbad CA) virewech dobäi Transkriptiouns zu ëmgedréint. D'MiRcute miRNA qPCR erkennen Kit (TIANGEN, Peking, China) war benotzt dem Wëllen Niveau vun Mir-144 laut de gëtt Protokoll ze quantitate. Déi folgend Hinnen alleguer ware benotzt: 95 ° C fir 30 Spiller, gefollegt vun 40 Zykle vun 95 ° C fir 5 ass a 60 ° C fir 31 ass. De Montant vun der Zil- (begéint /Mir-144), normalized dem endogenous housekeeping Gentherapie GAPDH /U6snRNA a relativ zu engem Referenzmaterial Echantillonen, déi folgend Equatioun uginn ass: Betrag vun Zil- = 2- △△ CT VerfÜgung Microarray hybridization. VerfÜgung Kuerz, goufen RNS Echantillon benotzt double-gekëmmert ergänzen DNA (cDNA), an double-gekëmmert cDNA Label an zu der Microarray (Arraystar, Rockville, MD) hybridized war bis synthesize. No hybridization an wäschen, sech Filteren drënner mat den Axon GenePix 4000B microarray Scanner (cuisine Comments, Sunnyvale, CA) gescannt. P Wäert war mat der vläit T-Test berechent. D'loung Formatioun fir Bastelen a verwandelt-reegelen Genen war eng fantastesch änneren > 2.0 an engem p Wäert &Si besteet; 0,05. Hierarchie Käre war baséiert op differentially ausgedréckt Genen an miRNAs benotzt Koup Treeview Software vun Stanford University (gekësst Alto, CA) gesuergt. VerfÜgung MiRNA-Gentherapie Reseau VerfÜgung Mir Netz adjacency tëscht zwee Genen gebaut, i an j, definéiert als eng Kraaft vun der Pearson Korrelatioun tëscht der Gentherapie-Ausdrock Profiler, XI an xj entspriechend. D'adjacency Matrixentgasung, M (i, j), huet als Grafik visualized, an der topological Eegeschafte vun dëser Grafik iwwerpréift goufen. Fir eng visuell Duerstellung, nëmmen de bäschte kennenzeléieren (> 0,98) waren an dëse renderings zréckgräifen. An miRNA-Gentherapie Netzwierker, entsprécht all Gentherapie zu engem Node. Zwee Genen sinn duerch eng Grenz ugeschloss, eng staark Korrelatioun ugëtt. An der Reseau Analyse, ass eng Mooss déi einfach, wichtegst Moossname vun der centrality vun engem Gene bannent engem Netz a bestëmmt déi relativ wichteg. A Diplome ass definéiert als d'Zuel vun direkt mat Noperen VerfÜgung Cepheid vum Mir-144 bindend Site VerfÜgung Putative Mir-144 bindend Siten zu begéint mRNA 3 'untranslated Regioun vun der Target Scan Programm (http virausgesot huet:. //www.targetscan.org). Positioun 1430-1436 vun begéint 3 'UTR huet e conserved bindend Site fir Mir-144 gezielt. VerfÜgung Plasmid transfection VerfÜgung Den ORF Message vu sech aus Frankräich DNA vun der Linn SNU-5 Zell isoléiert Implikatioune waren an sech dann subcloned an der plenti Vecteure. D'plasmid war transfected an SNU-5 Zellen mat Lipofectamine 2000 (Invitrogen). No 24 h, goufen d'Zellen fir e Rettungsplang Experimenter benotzt. VerfÜgung Oligonucleotide transfection VerfÜgung Mir-144 mimics, Mir-144 inhibitor (anti-Mir-144), a begéint siRNA (siRNA-begéint) vun Genepharma Wierderbuch sech , Shanghai, China. Oligonucleotide transfection war mat Lipofectamine 2000 reagents (Invitrogen, Karlsbad CA, USA) gesuergt. D'Finale Konzentratioun vum Mir-144 mimics, anti-Mir-144 oder siRNA-kennegeléiert an der transfection System huet 100 nm. Transfection Effizienz vun der eenzeger an Co-transfected Studien war vun fluorescence microscope alles. VerfÜgung Immunoblotting VerfÜgung Domat Montanten vun Zell lysates vun 7% SDS /PAGE geléist huet an sech op polyvinylidene fluoride Schläimhait transferéiert. D'Membran war mat engem Kanéngchen polyclonal antibody anti-begéint incubated (1: 500, abcam, ab47431), enger Geess polyclonal anti-ADAM12 antibody (0.3 μg /ml, abcam, ab28747), an eng Kanéngchen polyclonal anti-Versican antibody (1 μg /ml, abcam, ab19345). IRdye-Label Secondaire antibodies sech fir quantitation vun der immunoblotting Signal ginn, an d'Signaler sech mat enger Odyssee Scanner (LI-Cor Biosciences, Lincoln, héich, USA) analyséiert. VerfÜgung RNS-Chip assay VerfÜgung RNS-FAQ Interaktioune gi mat formaldehyde fix, an chromatin Enzyklopedie ass mat DNase Behandlung kombinéiert zu RNS /FAQ investéiert nozeginn datt mat antibodies bis kennegeléiert Proteinen immunoprecipitated kënnen. Cross-Linken sinn dono réckgängeg gemaach; RNS ass emmer erem behandelt mat DNase d'Feele vun DNA ze garantéieren. RNS Preisen aus der immun komplex dann vun real-Zäit Hinnen alleguer analyséiert ginn. An dëser RNS-Chip assay, déi folgend Formel benotzt ginn:% vun Input (Erhuelung) = Ae (CT Input-CT Prouf) * FD * 100%. Hei, eng ass de amplification Effizienz (10 (-1 /Graph)) an FD ass eng dilution Faktor vun der Infor- RNS der Differenz vun de Quantitéiten vun RNS-Chip Echantillonen an Infor- RNS zu Gläichgewiicht benotzt fir real-Zäit Hinnen alleguer.
Luciferase assay VerfÜgung D'voll erfëllt 3'UTR war vun Hinnen alleguer mat SNU-5 cDNA esou Schablounen an gekloonten an pGL3 Kontroll Vecteure Kick. Mir benotzt Quick Uertschaft mutagenesis der Mir-144 putative bindend Site (Stratagene, Santa Clara, CA, USA) zu mutate. SNU-5 Zellen an AGS Zellen sech mat Mir-144 mimics /inhibitors transfected an pGL3 luciferase reporter gesond der kennegeléiert 3'UTR ausser. No 24 h, goufen d'Aktivitéite vun Liichtkäfer luciferase an renilla luciferase an der Zell lysates mat der Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, allem, USA) gemooss. VerfÜgung Migratioun assays VerfÜgung Fir d'transwell Migratioun assays, 1 × waren an der Top Chambre plated 105 Zellen engem Net-Beschichtete Membran mat. D'Zellen sech am serum-gratis mëttelfristeg plated, a mëttelgrouss mat 10% (v /v) serum war als chemoattractant am ënneschten Chambre benotzt ergänzt. D'Zellen sech op 37 ° C an enger Otemschwieregkeeten Kultur incubator mat 5% (v /v) CO2 incubated. No 16 h, goufen d'Net-migrated Zellen aus der ieweschter Säiten vun der transwell Membran filter Text erausgeholl. D'migrated Zellen op der ënneschter Säit vun der Text mat coomassie schéi blo huet geschriwwen, an den Zellen goufen gezielt. VerfÜgung Zell Prolifératioun assay VerfÜgung der transfected Zellen op enger Dicht vun 1 × 104 Zellen am 96-gutt Placke géint sech /gutt. Eng Zell Prolifératioun assay war mat der Zell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) standing laut den Hiersteller d'Uweisungen. Virun der Aféierung vun CCK-8, huet sech den Zellen mat waarme Kultur Medien Katakombe vun der Plack um 500 Ziichter Anlag fir 3 m an duerno de supernatant discarding VerfÜgung Primers VerfÜgung Déi folgend primers fir real-Zäit Hinnen alleguer benotzt goufen.: Mir-144: 5-TACAG TATAG ATGAT GTACT-3; U6snRNA: 5-CGCAA GGAUG ACACG CAAAU UCGUG AAGCG UUCCA UAUUU UU-3; SKIL vir primer: 5-GTTAA GCGAA CCTGT ACTTC TGT-3, ëmgedréint primer: 5- GTAGG CGACA TGCTT TCTTG G-3; Erfëllt vir primer: 5-GTCGG AGTAG AGCGT CGAGA-3, ëmgedréint primer: 5-CAGCG CGATC AGGTA GAGC-3; TOP2A vir primer: 5-ACCAT TGCAG CCTGT AAATG E-3, ëmgedréint primer: 5-GGGCG GAGCA AAATA TGTTC C-3; ADAM12 vir primer: 5-TCAAC CTGGA TACCC GATTC C-3, ëmgedréint primer: 5-GCTCT GTCTG CCGAT GGAG-3; VCAN vir primer: 5-GTAAC CCATG CGCTA CATAA Agt-3, primer ëmgedréint: 5-GGCAA AGTAG GCATC GTTGA AA-3. Erfëllt 3'UTR vir primer:: Déi folgend primers sech fir voll erfëllt 3UTR Applikatioun benotzt 5-TCACT GCCTG ACCTT TA-3, kennegeléiert 3'UTR ëmgedréint primer: 5-ATCAC TTACT CCCAC AAT-3. D'siRNA Nukleotid fir sech benotzt huet wéi follegt: siRNA-getraff vir: 5-GUGCC ACUAA CUACA UUUAU U-3, siRNA-begéint ëmgedréint:. 5-UAAAU GUAGU UAGUG GCACU U-3 VerfÜgung statistique Analys zu de Resultater ginn als Mëttel ± Sem, an huet d'Date mat Student d't Test analyséiert. A Wäert vun p &Si besteet; 0,05 war statistesch relevant considéréiert. VerfÜgung Resultater VerfÜgung MicroRNA Ausdrock Profil am Verglach zur VerfÜgung gastric Kriibs vun peritoneal metastatic Stoffer mat vläit Primärschoul Foci Echantillon vun GC Hierarchie Käre Analyse réischt systematesch Variant vun der Expressioun vun miRNAs an Genen benotzt (Dorënner 1A an B). Eis Daten drop hindeit, datt eng Rei vu miRNAs an Genen dacks aberrantly an der peritoneal metastatic Stoffer vun GC ausgedréckt gëtt. Zousätzlech, hunn mir och, datt e puer virdrun och bewisen Molekülle, wéi Mir-7 [18], Mir-25 [17], TOB1 an IGF1R, sech net op eis microarrays identifizéiert ginn. Mir hu gemengt dësen Ënnerscheed ka vun der Diversitéit vun de Medeziner Echantillon aus verschiddene Beräicher entschlof ginn. Figur 1 Haaptentwéckler miRNA-Gentherapie Netz, dorënner 8 Schlëssel miRNAs an hiren Ziler. Hierarchie Käre Analyse vun 27 miRNAs (A) an 32 Genen (B), datt differentially tëscht metastatic Stoffer an der peritoneal a vläit Primärschoul Echantillon vun GC ausgedréckt huet (méi wéi 2.0-fantastesch; p &Si besteet; 0,05). Ausdrock Wäerter sinn an Faarftéin vun rout a gréng vertrueden, déi besot Ausdrock iwwer an ënner der Steiren Ausdrock Wäert ganze all Echantillon. (C) D'miRNA-Gentherapie Reseau weist d'Relatiounen tëscht 8 Schlëssel miRNAs an entholl-verbonne Genen si virausgesot ginn ze regléieren. D'Faarwen unzeginn forcéiert Ausdrock Niveau vun der miRNAs an Genen. VerfÜgung der miRNA-Gentherapie-Reseau mat de Schoss vum Erkenntnesser de Schlëssel miRNAs zesummekomm war, datt entholl-verbonne Gentherapie Ausdrock während de Werdegang vun entholl Metastasen regléieren. Well coexpression Moduler wahrscheinlech biologescht Weeër entspriechen, do hu mer op coexpression Moduler datt mat enger héijer Zuel vu FAQ-coding Genen verbonne sinn. Doriwwer eraus, Detailer NCBI RefSeq d'Funktiounen vun villen Genen, déi eis Identifikatioun vun GC-verbonne Genen En huet. Mat Hëllef vun dëser Method, zeechne mir d'Roll vum Mir-144 zu der peritoneal metastatic Foci vun GC. An de Kriibs coexpression Netz, ass Mir-144 bis 6 FAQ-coding Genen verbonne datt zu entholl Wuesstem an Metastasen (Dorënner 1c). VerfÜgung Regulatioune Roll vum Mir-144 zu gastric Kriibs Metastasen VerfÜgung implizéieren miR- ze ermëttelen 144 Funktioun, mir iwwerpréift éischt mir-144 Niveau vun engem Rot vu 6 Mënsch GC Zell Linnen. Als zu Dorënner 2A gewisen, ausgewielt mir AGS, mat upregulated Mir-144 charakteriséiert, an SNU-5, mat downregulated Mir-144 charakteriséiert, fir weider studéieren. D'AGS Zell Linn war vun gastric entholl Fragmenter ofgeleet, datt aus engem Patient resected waren déi keen Welpen Therapie dobäi hat, iwwerdeems SNU-5 aus ascites vun engem Patient mat wéineg ënnerscheet carcinoma vun de Mo. ofgeleet gouf. Figur 2 Mir-144 Hien der Wanderung vun GC Zellen. (A) Expression Niveau vun Mir-144 huet an engem Rot vu 6 Mënsch GC Zell Linnen mat real-Zäit Hinnen alleguer Method iwwerpréift. (B) Migratioun vun SNU-5 mat Mir-144 mimics behandelt Zellen war keen-matrigel transwell Chamber behandelt vergewësseren benotzt. (C) Migratioun vun AGS behandelt Zellen mat engem Mir-144 inhibitor war keen-matrigel transwell Chamber behandelt vergewësseren benotzt. (*** P &Si besteet; 0.001). VerfÜgung An eiser Etude, observéiert mir eng enk Associatioun tëscht Mir-144 Verloscht an Investitiounen an GC (Dorënner 1A an C). Weltwäit, hun virdrun Studien Mir-144-baséiert inhibition vun entholl Zell Wanderung an Invasioun an epithelial squamous Zell carcinoma dokumentéiert. Mir Hypothes, datt esouguer eventuell vum Mir-144 Ausdrock géif Kriibs Zell Migratioun oofgesinn. Gëeegente, Aféierung vum Mir-144 Ausdrock inhibited Zell Migratioun zu SNU-5 (Dorënner 2B). Am Verglach zu SNU-5, hunn AGS Zellen e relativ héije Niveau vun endogenous Mir-144 Ausdrock. Kardashian, inhibition vun Mir-144 fräi AGS Zell Migratioun (Dorënner 2C). An Tatsaach, standing mir och der Invasioun assay matrigel-behandelt transwell benotzt, an et gëtt keen Ënnerscheed fir invasiv Fähegkeet vun SNU-5 /AGS Zellen der Behandlung mat Mir-144 /anti-Mir-144 (Data net gewisen). Dës Resultater illustréiert dass Mir-144 eng wichteg Roll an Migratioun spillt awer net zu enger Invasioun vu GC Zellen. VerfÜgung Mir-144 schellt Ausdrock begéint VerfÜgung Duerch d'ectopic Ausdrock vu Mir-144 zu SNU-5 Zellen, mir alles ADAM12 VCAN a begéint, sinn putative mir-144 Ziler. Als zu Dorënner 3A gewisen, betraff Mir-144 Ausdrock Trainer d'mRNA Niveau vun ADAM12, VCAN a begéint. ADAM12, VCAN a begéint FAQ Ausdrock Niveauen sech och duerch westlech blot an Kriibs Zellen transfected mat Mir-144 mimics fonnt. Als zu Dorënner 3B gewisen, kennegeléiert nëmmen FAQ Niveau vum Mir-144 downregulated goufen. Dëst bedeit datt Mir-144 Ausdrock um transcriptional Niveau begéint schellt, vläicht duerch Rëss oder Déstabiliséierung vum mRNA Struktur. Mä mir hunn och d'ADAM12 an VCAN FAQ Niveau sinn net vun exogenous Aféierung vum Mir-144 erofgaangen. Mir hu gemengt, datt mRNA an FAQ Niveaue ka net direkt wéinst verschidden Halschent-Liewen soll ginn. Mir geduecht och weisen se dass d'Präsenz vun Mir-144 wéinst kënnen déi kontinuéierlech Iwwersetzung an ee Fall war repressing awer net déi aner. D'begéint: Mir-144 Interaktioun war och am liewege Zellen vun RNS-wëssen assay bewisen. An Tatsaach, war endogenous Mir-144 zu Anti-begéint verbonne mat endogenous begéint fonnt mä net anti-IgG immunoprecipitates vun Zellen (Dorënner 3C). Figur 3 Expression vun erfëllt gouf duerch Mir-144 gereegelt. (A) mRNA Niveau vun putative Mir-144 Ziler waren déi real-Zäit Hinnen alleguer zu SNU-5 Zellen transfected mat Mir-144 mimics oder Mir-NC iwwerpréift. (B) Protein Niveau vun putative Mir-144 Ziler waren déi westlech blotting zu SNU-5 Zellen transfected mat Mir-144 mimics oder Mir-NC iwwerpréift. (C) D'% Input selbstverständlech vun den RNS-Chip Reaktioune illustréiert de Räichtum vun begéint antibody. RNS-Chip assay fir Mir-144 standing op Anti-begéint antibody aus lysates vun Zellen. RNS-Chip mat engem nonrelated IgG als kontrolléiert. (D) Eng Sënn Bild vun der virausgesot Mir-144 bindend Site vun der 3'UTR vun begéint. (E) SNU-5 Zellen sech transiently Co-transfected mat LUC-begéint 3'UTR an Mir-144 rescht. (F) AGS Zellen sech transiently Co-transfected mat LUC-begéint 3'UTR an enger Mir-144 inhibitor. (G) Mutating vun der Raumstatioun-144 bindend Site vun begéint 3'UTR ofgeschaf der Mir-144-entschlof luciferase Aktivitéit Ennerdréckung. Luciferase Aktivitéit war no 24 h an normalized un der Co-transfected Renilla gemooss. (* P &Si besteet; 0,05; ** p &Si besteet; 0,01; *** p &Si besteet; 0.001). VerfÜgung Ausschöpfung bioinformatic-Analys, identifizéiert mir eng eenzeg miRNA bindend Site fir Mir-144 an der 3. 'UTR vun begéint mRNA (Dorënner 3D). Fir Test wann Mir-144 direkt d'3'-UTR vun begéint mRNA Photo'en, standing mir luciferase reporter assays zu SNU-5 Zellen. Hinnen alleguer-ofgeleet Fragmenter vum begéint 3'UTR waren an der pGL3 Kontroll Vecteure um Xba1 Site (LUC-begéint 3'UTR) gesaat. Co-transfection vun LUC-begéint 3'UTR an Mir-144 mimics zu SNU-5 Zellen e schéinen ofgeholl luciferase Signal (am Verglach zu Mir-NC) confirméiert, datt de 3'UTR vun kennegeléiert vun Mir-144 bindend ass eng direkt inhibitory Effet (Dorënner 3). De Géigendeel Experimenter, dichteg vun endogenous Mir-144 Produktioun mat engem Mir-144 inhibitor zu AGS Zellen erauszesichen, schéinen fräi luciferase Signal (Dorënner 3F). A mutated luciferase reporter um Bord-144 bindend Site war och (Dorënner 3D) gebaut. Stattfannen vum Site miRNA bindend ofgeschaf Mir-144-mediated inhibition vun luciferase Aktivitéit (Dorënner 3G). Dës Donnéeë hindeit, datt d'1430-1436 Positioun vun der kennegeléiert 3'UTR kritesch ass fir Mir-144-mediated Gentherapie Regulatioun. VerfÜgung begéint mediates der Mir-144-entschlof Resistenz zu Migratioun VerfÜgung Ausschöpfung real-Zäit Hinnen alleguer, begéint Ausdrock Niveauen sech fir sechs Mënsch GC Zell Linnen alles. Well dës Distanz, Zell Linnen mat "downregulated" hunn Mir-144 Niveauen héich Zommen vun begéint wéi mat "upregulated" Mir-144 Niveauen (Dorënner 4A) zu Zell Linnen Verglach. Benotzt nonparametric Tester, alles mer e wesentleche ëmgedréit, et gesäit Korrelatioun tëscht begéint mRNA an Mir-144 Ausdrock vun der GC metastatic Echantillon (Dorënner 4B). Figur 4 begéint modulation Konte fir d'antimetastatic Effet vum Mir-144. (A) Western blot weist sech däitlech an engem Set vu mënschlechen GC Zell Linnen. (B) Eng bedeitend ëmgedréit, et gesäit Korrelatioun tëschend der Mir-144 a begéint Ausdrock Niveauen an der GC Stoffer (n = 52) observéiert. (C) D'kennegeléiert an phosphorylated Akt sech duerch de Batti Ausdrock vu Mir-144 oder siRNA-begéint inhibited. (D, E) D'Auswierkunge vun Mir-144 oder siRNA-kennegeléiert op der Migratioun an Prolifératioun sech zu SNU-5 Zellen sech. (F) D'kennegeléiert an phosphorylated Akt sech duerch d'overexpression vun kennegeléiert an Mir-144 mimics-behandelt SNU-5 Zellen restauréiert. (G, H) D'Auswierkunge vun Mir-144 kombinéiert mat begéint-ORF op der Migratioun an Prolifératioun vu SNU-5 Zellen. (I) D'kennegeléiert an phosphorylated Akt sech weider-reegelen vum Mir-144 zu AGS Zellen erauszesichen. (J, K) D'Auswierkungen vun der Anti-Mir-144 op der Migratioun an Prolifératioun vu AGS Zellen. VerfÜgung D'begéint FAQ Funktiounen als receptor tyrosine kinase a spillt eng dréien Roll an der Promotioun vun bewosst Wuesstem a Wanderung duerch extracellular transducing stimuli zu intracellular sécher Kreesleef dran. Eng groussaarteg Komponent vun der intracellular sécher Maschinnen ass d'PI3K (phosphoinositide 3-kinase) Passerelle [20,21]. Well Mir-144 bremst Ausdrock begéint, Hypothes mir dat Mir-144 schlussendlech Akt phosphorylation an Aktivéierung duerch ofgeholl begéint sécher geloss hätt. Anere Wierder, mir Akt phosphorylation Niveauen no Mir-144 overexpression an observéiert engem groussen Verloscht vun Akt phosphorylation (Dorënner 4C) iwwerpréift. VerfÜgung Mir decidéiert ermëttelen ob Mir-144-entschlof begéint downregulation en Effekt op entholl Zell Wanderung an Prolifératioun haten. Mir transfected Mir-144 an siRNA fir sech (siRNA-begéint) zu SNU-5 Zellen. Zell Wanderung war 16 h der transfection vun transwell assay évaluéiert, iwwerdeems Zell Prolifératioun duerch CCK-8 sech war. Wéi am Sauerdall 4D a E, transfection mat Mir-144 inhibited Zell Wanderung an Prolifératioun gewise wéi zu Kontroll Verglach. Den Zerfall, kennegeléiert FAQ Ausdrock falender och entholl Zell Wanderung an Prolifératioun benotzt siRNA ofgeholl. VerfÜgung Fir erauszefannen, ob sech de kriteschen Vermëttler vum Mir-144 d'Wierkung op bewosst Wanderung an Prolifératioun ass, gebaut mir zwee begéint Ausdrock Vecteure. Ee vun deenen ass just oppen liesen Frame Haaptrei vun begéint Gentherapie (begéint-ORF), an anere Vecteure enthält den voll Längt Nukleotid vun begéint Gentherapie dorënner 3'UTR Haaptrei (begéint-voll laang). Mir standing da westlech blot Analyse 48 h der transfection vun begéint-ORF /begéint-voll laang an Mir-144 mimics-behandelt SNU-5 Zellen (Dorënner 4F). Am Verglach zu den negativen Kontroll Grupp (Eidel Vecteure), ectopic Ausdrock vun begéint-ORF geklomme ganzen Ausdrock vun kennegeléiert an phosphorylated Akt. Ausserdeem, Ausdrock vun der kennegeléiert-ORF gefördert Wanderung an Prolifératioun vu GC Zellen (Dorënner 4G an H). Overexpression vun begéint ofgeschaf Mir-144-entschlof inhibition vun Zell Wanderung an Prolifératioun. Am Géigesaz, fräi d'FAQ Niveau vun kennegeléiert an phosphorylated-AKT zu AGS mat anti-Mir-144 (Dorënner 4I) behandelt Zellen, an sinnn Mir-144 gefördert och d'Wanderung an Prolifératioun vu AGS Zellen (Dorënner 4J an K). Dës Resultater weisen, datt sech eng kritesch Zil fir d'Anti-Wanderung Effet vum Mir-144 zu Mënsch GC Zellen. VerfÜgung Diskussioun VerfÜgung An dëser Etude, hu mir festgestallt Net-phpNuke Ënnerschreften vun enger klenger Zuel vu miRNAs an Genen datt si aberrantly zu peritoneal metastatic Stoffer vun GC ausgedréckt, wéi bis vläit Primärschoul Stoffer Verglach. Analyse vun miRNA an der Gentherapie Ausdrock Profiler vun der miRNA-Gentherapie-Reseau identifizéiert Mir-144 als regulator vun gréisser oncogenic Weeër, wéi Prolifératioun a Migratioun. GC Patienten mat peritoneal Investitiounen déi ënnescht Mir-144 Ausdrock Niveau wéi Patienten ouni Investitiounen. Dëst brengt implicates Mir-144 als potentiell entholl suppressor am GC. Ausserdeem, ass Mir-144 mat de Mechanisme vun Metastasen assoziéiert. Eis Resultater sëlwecht mat de Resultater vun virdrun Studien iwwert d'Roll vum Mir-144 zu Kriibs Prolifératioun, Migratioun, an Invasioun [22,23]. Mir-144 bremst Zell Metastasen Kriibs vun der A disintegrin gezielt an metalloproteinase (ADAM) FAQ Familljemember ADAMTS5. MicroRNA dysregulation ass mat fräi entholl invasiveness an Metastasen assoziéiert, souwéi reduzéiert Patient hätt zu bestëmmte epithelial Cancers [24]. Mir propagéieren weider d'Roll vum Mir-144 Dereguléierung an GC. Mir studéiert den Effet vum Mir-144 Ausdrock vun der SNU-5 Zell Linn, wéi et vun niddereg Ausdrock vu Mir-144 charakteriséiert ass. Ectopic Ausdrock vu Mir-144 zu SNU-5 Zellen Resultater am schwéierste phenotypic Ännerungen, wéi Migratioun ofgeholl. De Géigendeel Experimenter, Mir-144 Ausdrock erauszesichen, war am AGS Zell Linn gehaal, deen eng relativ héich endogenous Niveau vum Mir-144 Ausdrock huet. Inhibition vum Mir-144 Ausdrock schéinen fräi AGS Zell Migratioun. VerfÜgung de Mechanismus hannert Mir-144-ofhängeg ofgeholl ze ermëttelen Migratioun vun GC, mir der putative Ziler fir Mir-144 als vun miRNA-Gentherapie-Reseau virausgesot. Mir-144 overexpression kann um begéint Ausdrock reduzéieren souwuel mRNA an FAQ Niveauen, a weltwäit, luciferase reporter assays Teamchef Mir-144 mat der kennegeléiert 3'UTR direkt so kann. Mir évaluéiert dann erfëllt Ausdrock Niveauen an enger Kohort vun 52 GC Patienten a fonnt, datt Mir-144 Niveauen inversely bis kennegeléiert Ausdrock soll sinn. Fir datt Grond, Hypothes mir dat Mir-144 bremst GC tumorigenesis vun gezielt hunn Ausdrock. Kennegeléiert huet och als Mir-34a /c Zilscheif vun anere bewosst Modeller beschriwwe ginn an ass bekannt motility an der invasiv Méiglechen stoussen vun entholl Zellen ze förderen. Overexpression vun begéint ass enk mat entholl Invasioun an Patient hätt am GC [6] soll. An GC, erfëllt overexpression eng onofhängeg prognostic Faktor a Potential Drogenofhängeger viséieren. Ausserdeem, kann erfëllt overexpression virauszesoen déi Patienten profitéiere kënnen aus geziilte Therapie mat begéint inhibitors [25]. An eiser Etude, huet sech Ausdrock vill mat GC dat, TNM an Metastasen [26] assoziéiert. Mir sech déi Ännerungen an Zell Prolifératioun a Wanderung duerch Mir-144 duerch d'Regulatioun vun begéint Ausdrock Nofolleg ginn hätt. Mir-144 Repressioun féiert zu méi Niveaue vun begéint, déi d'Metastasen phenotype vum Mir-144-do ass Zellen erkläre kann. Spannen, beaflosst Mir-144 hepatocyte Wuesstem Faktor (HGF) sécher. HGF, wéi d'ligand vun begéint, kann den Aktivéierungscode vu kennegeléiert an epithelial Zellen induce. Iwwerdeems begéint overexpression net komplett GC tumorigenic Qualitéiten restauréiert konnt, huet GC Zell Wanderung an Prolifératioun der kennegeléiert overexpression deelweis restauréiert. Dofir, vläicht Mir-144 aner Genen am GC Zellen regléieren. Virdrun Etuden hu gewisen, datt sech kann GC tumorigenesis duerch d'Aktivatioun vun der PI3K Passerelle induce. An dëser Etude, hunn mer dat Mir-144 bedeitend Akt phosphorylation attenuated, an datt Akt phosphorylation war komplett mat overexpression vun begéint restauréiert. Eis Conclusiounen hindeit datt Mir-144 Akt phosphorylation duerch begéint Regulatioun vun GC reguléieren. VerfÜgung An Conclusioun, eiser Etude identifizéiert Basis fir d'Verréngerung Niveau vum Mir-144 gesinn am GC metastatic Stoffer. Mir-144 gouf als potentiell entholl suppressor am GC identifizéiert an huet mat de Mechanisme vum GC Metastasen assoziéiert gouf. Ausserdeem, bremst Mir-144 GC tumorigenesis vun begéint gezielt, an duerno, de PI3K /Akt Passerelle. Fir eis Wëssen, ass dat déi éischt Kéier Mir-144 gewise gouf sech zu GC Zellen ze viséieren. Dofir, weider Studien der anticancer Roll vum Mir-144 lassleeën fir GC zu der Entwécklung vun neie therapeutesch Strategien bäidroen kënnen. VerfÜgung Notes VerfÜgung Jun Liu an Hui Xue matgehollef gläich un dëser Aarbecht. VerfÜgung Deklaratioune VerfÜgung Arbeschterlidder VerfÜgung Dës Etude gouf vun der National Natural Science Foundation of China (Grant Nr 81201897) ënnerstëtzt. D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren. Wettsträit Interessen
d'Auteuren erklären, datt se keng Competitioun Interessen hunn. VerfÜgung Auteuren 'Contributiounen
JL duerchgefouert de molekulare Biologie Etuden aus. HX COSL d'mëttelalterlech Handschrëft. JZ duerchgefouert der bioinformatic Analyse eraus. All Auteuren liesen an guttgeheescht der Finale mëttelalterlech Handschrëft. VerfÜgung

• Association vun Präsenz /Unterrecht an op /ugefaangen Musteren vun Helicobacter pylori oipA Gentherapie mat peptic oppent Krankheet an gastric Kriibs Risiken: eng meta-analysis
• Relatioun tëscht GUT liicht an Zocker homeostasis der bariatric surgery