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MicroRNA-144 inibisce la metastasi del tumore gastrico di mira espressione MET

MicroRNA-144 inibisce la metastasi del tumore gastrico di mira espressione MET
Abstract
cancro gastrico (GC) rimane uno dei più comuni tipi di tumore maligno, e il meccanismo molecolare alla base della sua metastasi è ancora in gran parte poco chiara. I microRNA sono emersi come importanti regolatori di metastasi a causa della loro capacità di agire su più vie di segnalazione. Nel nostro studio, abbiamo scoperto che miR-144 è significativamente downregulated in entrambe le linee e nei tessuti cellulari GC altamente metastatiche. I risultati di entrambi guadagno-di-funzione e gli esperimenti di perdita di funzione dimostrano che l'aumento del miR-144 espressione significativamente ridotto la migrazione delle cellule GC, mentre è diminuita miR-144 espressione drammaticamente migliorata la migrazione delle cellule GC. Il proto-oncogene incontrato (TEM), che è spesso amplificato in tumori e le funzioni umane come un importante regolatore della crescita delle cellule tumorali e l'invasione, è stato identificato come un bersaglio diretto di miR-144. Inoltre, silenziamento di MET usando piccoli RNA interferenti (siRNA) ricapitolato la funzione anti-metastatico del miR-144, mentre il ripristino di espressione MET attenuato la funzione di miR-144 in cellule GC. Inoltre, abbiamo scoperto che miR-144, prendendo di mira MET, sopprime la fosforilazione di Akt. Infine, abbiamo osservato una correlazione inversa tra l'espressione di miR-144 e MET mRNA nei tessuti metastatici GC. In sintesi, miR-144 sopprime la progressione GC da downregulating direttamente espressione MET, che impedisce in seguito attivazione della via Akt pro-oncogeno. Reintroduzione di miR-144 espressione in cellule di GC presenta un approccio terapeutico interessante per bloccare le metastasi del cancro gastrico.
Parole
microRNA miR-144 MET cancro gastrico metastasi Introduzione
A livello globale, il cancro gastrico (GC) è una dei tipi più prevalenti di malattia maligna. Nel 2008, sono stati diagnosticati circa 989.600 nuovi casi di GC. Inoltre, GC è stato implicato come causa di 738.000 morti, rendendo GC la quarta neoplasia più comune e la principale causa di morte per cancro in tutto il mondo [1]. Come il tumore progredisce, si sviluppa la capacità di invadere i tessuti circostanti e metastasi. Il recettore del fattore di crescita degli epatociti, TEM, è noto per promuovere la motilità e la capacità invasiva delle cellule tumorali [2]. MET è un membro della famiglia dei recettori tirosin-chinasi e ha dimostrato di essere upregulated in molti tumori [3-5]. Si suggerisce che il livello di espressione TEM è aumentata da una amplificazione genica o ipossia via HIF1α. Nei pazienti con GC metastatico, l'amplificazione e l'espressione della proteina MET forte non sono infrequenti. Questi eventi sembrano essere significativamente associato con l'esito clinico sfavorevole [6]. Circa il 10% dei pazienti bianchi porto un guadagno di cinque o più copie del MET. Inoltre, questo guadagno di MET numero di copie è significativamente associato con la prognosi sfavorevole [7]. Inoltre, i microRNA miR-34a /C hanno dimostrato di modulare l'espressione negativa MET in linee cellulari derivate da cancro alla prostata, carcinoma epatocellulare e GC [8-10].
I microRNA (miRNA) sono molecole di RNA non codificanti, circa 21-23 nucleotidi di lunghezza, che regolano l'espressione genica a livello trascrizionale o post-trascrizionale [11-13]. miRNA profili di analisi hanno rivelato una down-regulation globale dei livelli di miRNA maturi nei tumori umani relativi ai tessuti normali [14]. Inoltre, miRNA può funzionare sia in un soppressore del tumore o un ruolo oncogenico, a seconda della funzione della loro destinazione. Ad esempio, miR-133b è risultata significativamente down-regolato nei tessuti GC e esercitava il suo ruolo soppressore del tumore nelle cellule GC [15]. L'espressione di miR-337-3p era significativamente downregulated in linfatici tessuti nodo metastatici di pazienti GC, e l'induzione di espressione di miR-337-3p ha fatto ridurre la capacità di invasione delle cellule cancro gastrico [16]. miR-25 promuove la progressione GC da downregulating direttamente espressione TOB1; di conseguenza, una maggiore espressione di miR-25 presenta un potenziale biomarcatore non invasivo per la prognosi dei pazienti CG [17]. Inoltre, miR-7 è significativamente downregulated in entrambe le linee cellulari GC altamente metastatiche e tessuti metastatici. Sovraespressione di miR-7 inibisce marcatamente GC metastasi di mira l'espressione del oncogene insulin-like growth factor-1 receptor (IGF1R) [18]. In linee cellulari GC, reintroduzione del miR-144 risultati espressione nella repressione di ZFX, che aumenta moderatamente la sensibilità delle cellule tumorali alla chemioterapia 5-fluorouracile. In 93 casi di GC primaria, diminuita espressione di miR-144 è stato associato ad una prognosi sfavorevole [19]. Questi esempi hanno messo in evidenza il ruolo chiave dei miRNA in GC malignance e progressione del cancro.
In questo studio, abbiamo caratterizzato gli obiettivi e definito il meccanismo d'azione di miR-144 in GC. Inducendo l'espressione ectopica di miR-144, abbiamo scoperto MET è un nuovo bersaglio della regolazione miR-144. Questo risultato è stato confermato da entrambi i livelli di mRNA e di proteine, e saggi di gene reporter luciferasi verificato legame diretto di miR-144 al sito di legame normativo nel 3'UTR di MET. Inoltre, abbiamo scoperto che l'espressione TEM correla inversamente al miR-144 livelli in un piccolo ma ben documentato coorte GC. Noi ipotizziamo che miR-144 inibisce le metastasi GC, e che alcune di questa inibizione è mediato da mira espressione MET.
Materiali e metodi
campioni di tessuto umani e linee cellulari
campioni GC sono stati raccolti da pazienti sottoposti a chirurgia presso la Fudan University di Shanghai Cancer center tra il 2012 e il 2013. il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico Clinical Research di Fudan University, e la ricerca è stata effettuata secondo le disposizioni della Dichiarazione di Helsinki del 1975. Tutti i campioni sono stati ottenuti con il consenso informato dei pazienti. La linea cellulare umana GC AGS (ATCC® CRL-1739 ™), SNU-1 (ATCC® CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC® CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC® CRL-5974 ™) , NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™), e Kato III (ATCC® HTB-103 ™) sono state mantenute in DMEM contenente 10% di siero fetale bovino. Tutte le linee cellulari sono state mantenute in mezzi contenenti penicillina (100 UI /ml) e streptomicina (100 mg /ml) a 37 ° C con 5% CO2. Le imita miRNA e inibitori sono stati acquistati da Ambion (Austin, TX, USA).
Estrazione di RNA e real-time PCR
RNA totale è stato estratto dalle cellule utilizzando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Per l'analisi miRNA, poli code (A) sono stati aggiunti a RNA totale utilizzando poli (A) polimerasi (Ambion, Carlsbad, CA) prima trascrizione inversa. Il kit di rilevamento MiRcute miRNA qPCR (TIANGEN, Pechino, Cina) è stato utilizzato per quantificare i livelli di espressione di miR-144 secondo il protocollo previsto. Le seguenti condizioni di PCR sono stati usati: 95 ° C per 30 s, seguita da 40 cicli di 95 ° C per 5 s e 60 ° C per 31 s. La quantità di bersaglio (MET /miR-144), normalizzata al gene housekeeping GAPDH endogena /U6snRNA e relativa ad un riferimento campione, è dato dalla seguente equazione: quantità di target = 2- △△ CT
Microarray ibridazione.
In breve, campioni di RNA sono stati usati per sintetizzare il DNA complementare a doppio filamento (cDNA), e doppio filamento cDNA è stato etichettato e ibridato al microarray (Arraystar, Rockville, MD). Dopo l'ibridazione e il lavaggio, i vetrini trattati sono stati scansionati con microarray scanner Axon GenePix 4000B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). valore di P è stato calcolato utilizzando il t-test accoppiato. La soglia fissata per monte ea down-regolato geni è stato un cambiamento piega & gt; 2.0 e un valore di p & lt; 0.05. clustering gerarchico è stata effettuata sulla base di geni espressi in modo differenziale e miRNA utilizzando il software Cluster Treeview presso la Stanford University (Palo Alto, CA).
rete Mirna-gene
Abbiamo costruito la adiacenze di rete tra due geni, i e j, definito come una potenza di correlazione di Pearson tra i corrispondenti profili di espressione genica, xi e xj. La matrice di adiacenza, M (i, j), è visualizzato come un grafico, e le proprietà topologiche di questo grafico sono stati esaminati. Per fare una rappresentazione visiva, solo le correlazioni più forti (& gt; 0,98) sono stati compilati in queste interpretazioni. Nelle reti miRNA gene, ogni gene corrisponde a un nodo. Due geni sono collegati da un bordo, che indica una forte correlazione. All'interno della analisi di rete, un grado è il più semplice, più importante misura della centralità di un gene all'interno di una rete e determina l'importanza relativa. Una laurea è definito come il numero di vicini direttamente connessi
Pronostico miR-144 sito di legame
putativo miR-144 siti di legame nella regione non tradotta MET mRNA 3 'sono stati previsti dal programma Scan Target (http: //. www.targetscan.org). Posizione 1430-1436 di MET 3 'UTR ha un sito di legame conservato per miR-144 mira
. Trasfezione plasmidi
Le sequenze ORF di MET sono stati amplificati dal DNA genomico isolato dalla linea cellulare SNU-5 e sono stati poi subclonati nel vettore Plenti. Il plasmide è stato trasfettato in SNU-5 celle usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Dopo 24 ore, le cellule sono state utilizzate per un esperimento di salvataggio
. Oligonucleotidi trasfezione
miR-144 imita, miR-144 inibitore (anti-miR-144), e MET siRNA (siRNA-MET) sono stati sintetizzati da Genepharma , Shanghai, Cina. Oligonucleotide trasfezione è stata eseguita con Lipofectamine 2000 reagenti (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). La concentrazione finale di miR-144 imita, anti-miR-144 o siRNA-MET nel sistema trasfezione era di 100 nM. efficienza di trasfezione per gli studi singoli e co-trasfettate è stata determinata mediante microscopio a fluorescenza.
immunoblotting
quantità equivalenti di lisati cellulari sono stati risolti del 7% SDS /PAGE e sono stati trasferiti su membrane polivinilidene fluoruro. La membrana è stata incubata con un anticorpo policlonale di coniglio anti-MET anticorpi (1: 500, Abcam, ab47431), una capra policlonale anti-Adam-12 anticorpi (0,3 ug /ml, Abcam, ab28747), ed un anticorpo policlonale di coniglio anticorpo anti-versican (1 ug /ml, Abcam, ab19345). IRdye-etichettati anticorpi secondari sono stati utilizzati per la quantificazione del segnale immunoblotting, ei segnali sono stati analizzati utilizzando uno scanner Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).
Saggio RNA-chip
interazioni RNA-proteina sono fissati con formaldeide e cromatina taglio è combinata con un trattamento DNasi per produrre complessi di RNA /proteine ​​che possono essere immunoprecipitati con anticorpi contro le proteine ​​MET. Legami incrociati sono successivamente ripristinate; RNA viene recuperato e di nuovo trattati con DNasi per garantire l'assenza di DNA. RNA precipitato dal complesso immunitario poi essere analizzati mediante real-time PCR. In questo saggio RNA-chip, utilizzare la seguente formula:% di input (recupero) = AE (Ct input-Ct campione) * Fd * 100%. Qui, AE è l'efficienza di amplificazione (10 (-1 /pendenza)) e Fd è un fattore di diluizione del RNA input per bilanciare la differenza nella quantità di RNA-ChIP campione e ingresso RNA utilizzati per PCR in tempo reale.
luciferasi saggio
La piena TEM 3'UTR è stato amplificato mediante PCR utilizzando SNU-5 cDNA come modello e clonato in controllo pGL3 vettoriale. Abbiamo usato Quick Change mutagenesi di mutare il putativo sito di legame miR-144 (Stratagene, Santa Clara, CA, USA). SNU-5 e cellule AGS sono state trasfettate con miR-144 imita /inibitori e pGL3 giornalista luciferasi costruisce ospitare il MET 3'UTR. Dopo 24 ore, le attività di luciferasi di lucciola e renilla luciferasi nei lisati cellulari sono stati misurati con il Dual-luciferasi Assay System (Promega, Madison, WI, USA).
Saggi di migrazione
Per i saggi di migrazione transwell, 1 × 105 cellule sono state piastrate in camera superiore contiene una membrana non rivestita. Le cellule sono state piastrate in mezzo privo di siero, e medio integrato con 10% (v /v) di siero è stato usato come fattore chemiotattico nella camera inferiore. Le cellule sono state incubate a 37 ° C in un incubatore coltura tissutale con 5% (v /v) CO2. Dopo 16 h, le cellule non migrate sono stati rimossi dai lati superiori delle cartucce filtranti a membrana transwell. Le cellule migrate sui lati inferiori degli inserti sono state colorate con blu brillante Coomassie, e le cellule sono state contate. Assay
proliferazione cellulare
Le cellule trasfettate sono state seminate in piastre da 96 pozzetti ad una densità di 1 × 104 cellule /bene. Un saggio di proliferazione cellulare è stata effettuata utilizzando il cellulare Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Giappone) secondo le istruzioni del produttore. Prima l'aggiunta di CCK-8, le cellule sono state lavate con terreni di coltura caldo facendo girare la piastra a 500 rpm per 3 metri e poi scartando il surnatante
Primers
i seguenti primer sono stati usati per PCR in tempo reale.: miR-144: 5 TACAG TATAG ATGAT GTACT-3; U6snRNA: 5 CGCAA GGAUG ACACG CAAAU UCGUG AAGCG UUCCA UAUUU UU-3; SKIL primer forward: 5 GTTAA GCGAA CCTGT ACTTC TGT-3, inversione di fondo: 5- GTAGG CGACA TGCTT TCTTG G-3; MET primer forward: 5 GTCGG AGTAG AGCGT CGAGA-3, invertire Primer: 5 CAGCG CGATC AGGTA GAGC-3; TOP2A primer forward: 5 ACCAT TGCAG CCTGT AAATG A-3, primer reverse: 5 GGGCG GAGCA AAATA TGTTC C-3; Adam-12 primer forward: 5 TCAAC CTGGA TACCC GATTC C-3, primer reverse: 5 GCTCT GTCTG CCGAT GGAG-3; VCAN primer forward: 5 GTAAC CCATG CGCTA Cataa AGT-3, primer reverse: 5 GGCAA AGTAG GCATC GTTGA AA-3. I seguenti primer sono stati utilizzati per la piena applicazione del TEM 3UTR: MET 3'UTR primer forward: 5 TCACT GCCTG ACCTT TA-3, MET 3'UTR primer reverse: 5 ATCAC TTACT CCCAC AAT-3. Il nucleotide siRNA per il TEM è stato utilizzato come segue: siRNA-MET forward: 5 GUGCC ACUAA CUACA UUUAU U-3, siRNA-MET inverso:. 5-UAAAU GUAGU UAGUG GCACU U-3 Analisi statistica

I risultati sono presentati come media ± SEM, ed i dati sono stati analizzati con il test t di Student. Un valore di p & lt; 0.05 è stato considerato statisticamente significativo.
Risultati
profilo di espressione microRNA nel tumore gastrico
Confronto dei tessuti metastatici peritoneali con appaiati campioni focolai primari di GC utilizzando l'analisi gerarchica di clustering rivelato variazione sistematica nell'espressione di miRNA e geni (Figura 1A e B). I nostri dati suggeriscono che una serie di miRNA e dei geni è spesso aberrante espresso nei tessuti metastatici peritoneali di GC. Inoltre, abbiamo anche scoperto che alcune molecole precedentemente ben dimostrato, come miR-7 [18], miR-25 [17], e TOB1 IGF1R, non sono state identificate nei nostri microarray. Abbiamo pensato questi differenza può essere indotta da diversità dei campioni clinici proveniva da zone diverse. Figura rete miRNA gene-1 core, tra cui 8 miRNA principali e ai loro obiettivi. analisi gerarchica raggruppamento di 27 miRNA (A) e 32 geni (B) che erano differenzialmente espressi tra tessuti metastatici nei campioni elementari peritoneali e accoppiati di GC (superiore a 2,0 volte; p & lt; 0,05). I valori di espressione sono rappresentati nei toni del rosso e verde, che indica l'espressione sopra e al di sotto del valore di espressione mediana in tutti i campioni. (C) La rete miRNA gene mostra le relazioni tra 8 miRNA chiave e geni associati al tumore che si prevede di regolare. I colori indicano i livelli di espressione dei miRNA annotati e geni.
Il miRNA-gene-rete è stata assemblata con l'obiettivo di individuare le miRNA chiave che regolano l'espressione genica associata al tumore durante la progressione delle metastasi del tumore. Poiché i moduli coexpression probabilmente corrispondono a percorsi biologici, ci siamo concentrati su moduli di coespressione che sono associati con un elevato numero di geni codificanti proteine. Inoltre, NCBI RefSeq dettagli le funzioni di molti geni, che aiutato la nostra identificazione di geni GC-associata. Utilizzando questo metodo, abbiamo caratterizzato il ruolo di miR-144 nel foci metastatici peritoneale del GC. Nella rete coexpression cancro, miR-144 è collegato a 6 geni codificanti proteine ​​che sono coinvolte nella crescita tumorale e le metastasi (Figura 1C).
Ruolo regolatore del miR-144 nel cancro gastrico metastasi
Per studiare retrovisori 144 funzione, in primo luogo abbiamo esaminato i livelli di miR-144 in un gruppo di 6 linee cellulari umane GC. Come mostrato nella Figura 2A, abbiamo selezionato AGS, caratterizzato con upregulated miR-144, e SNU-5, caratterizzato con downregulated miR-144, per ulteriori studi. La linea cellulare AGS deriva da frammenti di tumore gastrici che sono state asportate da un paziente che aveva ricevuto alcuna precedente terapia, mentre SNU-5 è stato derivato da asciti di un paziente con mal di carcinoma differenziato dello stomaco. Figura 2 mir-144 sopprime la migrazione delle cellule GC. livelli (A) di espressione di miR-144 sono stati controllati in un gruppo di 6 linee di cellule umane usando GC real-time PCR. (B) La migrazione di SNU-5 cellule trattate con miR-144 imita è stato controllato con no-Matrigel trattati transwell camera. (C) La migrazione delle cellule AGS trattati con miR-144 inibitore è stato controllato con no-Matrigel trattati transwell camera. (*** P & lt; 0,001).
Nel nostro studio, abbiamo osservato una stretta associazione tra miR-144 e la perdita di metastasi a GC (Figura 1A e C). Di conseguenza, studi precedenti hanno documentato l'inibizione del miR-144 a base di migrazione delle cellule tumorali e l'invasione nel carcinoma a cellule squamose epiteliali. Abbiamo ipotizzato che la reintroduzione di espressione di miR-144 sarebbe sopprimere la migrazione delle cellule del cancro. Opportunamente, l'introduzione di espressione miR-144 ha inibito la migrazione delle cellule in SNU-5 (Figura 2B). Rispetto al SNU-5, le cellule AGS hanno un livello relativamente elevato di endogena espressione di miR-144. Non sorprende che l'inibizione di miR-144 aumenta la migrazione delle cellule AGS (Figura 2C). In effetti, abbiamo anche effettuato il test di invasione usando transwell Matrigel-trattati, e non c'è alcuna differenza per la capacità invasiva delle SNU-5 /AGS cellule dopo trattamento con miR-144 /anti-miR-144 (dati non riportati). Questi risultati illustrati che miR-144 gioca un ruolo importante nella migrazione, ma non in invasione delle cellule di GC.
MiR-144 influisce espressione MET
attraverso l'espressione ectopica di miR-144 in SNU-5 celle, abbiamo determinato Adam-12 , VCAN e MET sono putativi miR-144 bersagli. Come mostrato in figura 3A, espressione di miR-144 notevolmente influenzato i livelli di mRNA di Adam-12, VCAN e MET. Adam-12, VCAN e MET livelli di espressione della proteina sono stati rilevati anche attraverso Western Blot nelle cellule tumorali trasfettate con miR-144 imita. Come mostrato nella Figura 3B, ha incontrato solo i livelli di proteina sono stati inibiti da miR-144. Ciò indica che miR-144 colpisce MET espressione a livello trascrizionale, magari attraverso la scissione o la destabilizzazione della struttura mRNA. Tuttavia, abbiamo anche trovato i livelli di proteine ​​Adam-12 e VCAN non sono diminuite di introduzione esogena di miR-144. Abbiamo pensato che mRNA e di proteina non possono essere direttamente correlati a causa della differente emivita. Abbiamo anche pensato hanno mostrato che può essere dovuto alla presenza di miR-144 che è stato continuamente reprime traduzione in un caso, ma non l'altro. Il MET: interazione miR-144 è stata dimostrata anche in cellule viventi mediante saggio di RNA-chip. In realtà, endogeni miR-144 è stata trovata associata a endogena MET anti-MET, ma non immunoprecipitati anti-IgG dalle cellule (Figura 3C). Figura 3 L'espressione di TEM è stato regolato da miR-144. livelli (A) mRNA di putativi miR-144 obiettivi sono stati esaminati da real-time PCR in SNU-5 cellule trasfettate con miR-144 imita o miR-NC. livelli (B) Proteine ​​di putativi miR-144 obiettivi sono stati esaminati da western blotting in SNU-5 cellule trasfettate con miR-144 imita o miR-NC. (C) I recuperi di ingresso% delle reazioni RNA-chip illustra l'arricchimento mediante anticorpi MET. test RNA-chip per miR-144 effettuato su anticorpo anti-MET da lisati di cellule. RNA-chip con un IgG non legato servito come controlli. (D) Un immagine schematica del miR-144 sito predetto vincolante nel 3'UTR di MET. (E) SNU-5 cellule sono state transitoriamente co-trasfettate con LUC-MET 3'UTR e miR-144 mimica. (F), le cellule AGS erano transitoriamente co-trasfettate con LUC-MET 3'UTR e un inibitore di miR-144. (G) Mutating del miR-144 sito di legame in MET 3'UTR abolito la soppressione dell'attività della luciferasi miR-144-indotta. attività della luciferasi è stata misurata dopo 24 ore e normalizzati per il co-trasfettato Renilla. (* P & lt; 0,05; ** p & lt; 0,01; *** p & lt; 0,001).
Utilizzando l'analisi bioinformatica-based, abbiamo identificato un singolo sito di legame miRNA per miR-144 nel 3 'UTR di MET mRNA (Figura 3D). Per verificare se miR-144 si lega direttamente al 3'-UTR di MET mRNA, abbiamo eseguito test luciferasi in SNU-5 celle. frammenti PCR-derivati ​​dal MET 3'UTR sono stati inseriti nel vettore di controllo pGL3 al sito Xba1 (LUC-MET 3'UTR). Co-trasfezione di Luc-MET 3'UTR e miR-144 imita in SNU-5 celle provocato un segnale luciferasi diminuzione (rispetto al miR-NC), a conferma che il legame di miR-144 al 3'UTR di MET ha una effetto inibitorio diretto (Figura 3E). L'esperimento inverso, realizzata bloccando endogena produzione miR-144 con un inibitore di miR-144 in cellule AGS, ha determinato un aumento del segnale luciferasi (Figura 3F). Un reporter luciferasi mutato presso il sito di legame miR-144 è stato costruito anche (Figura 3D). La mutazione del sito di legame miRNA abolito l'inibizione miR-144-mediata di attività luciferasi (Figura 3G). Questi dati suggeriscono che il 1430-1436 posizione del MET 3'UTR è fondamentale per la regolazione genica miR-144-mediata.
MET media la resistenza di miR-144-indotta alla migrazione
formato Real-time PCR, MET livelli di espressione sono stati determinati per sei linee di cellule umane GC. Come si vede, linee cellulari con "diminuito l'" miR-144 livelli hanno una maggiore quantità di MET rispetto alle linee cellulari con miR-144 livelli "upregulated" (figura 4a). Utilizzando test non parametrici, abbiamo determinato una significativa correlazione inversa tra il MET mRNA e l'espressione di miR-144 nei campioni GC metastatiche (Figura 4B). Conti Figura 4 MET modulazione per l'effetto antimetastatico di miR-144. (A) Western Blot mostrando espressione MET in un insieme di linee cellulari umane GC. (B) una correlazione inversa significativa è osservata tra i livelli di espressione miR-144 e ha incontrato nei tessuti GC (n = 52). (C) Il MET e fosforilata Akt sono stati inibiti dalla espressione forzata del miR-144 o siRNA-MET. (D, E) Gli effetti di miR-144 o siRNA-MET sulla migrazione e la proliferazione sono stati determinati in SNU-5 celle. (F) Il MET e fosforilata Akt sono stati restaurati dalla sovraespressione di MET in miR-144 imita-trattati SNU-5 celle. (G, H) Gli effetti di miR-144 in combinazione con MET-ORF sulla migrazione e la proliferazione di SNU-5 celle. (I) Il MET e fosforilata Akt sono up-regolati da blocco di miR-144 in cellule AGS. (J, K) Gli effetti di anti-miR-144 sulla migrazione e proliferazione delle cellule AGS.
Le funzioni della proteina MET come un recettore tirosina chinasi e svolge un ruolo fondamentale nella promozione della crescita cellulare e la migrazione da trasduzione extracellulare stimoli ai circuiti di segnalazione intracellulare. Un elemento molto importante della macchina segnalazione intracellulare è il PI3K (phosphoinositide 3-chinasi) pathway [20,21]. Perché miR-144 inibisce MET espressione, abbiamo ipotizzato che miR-144 potrebbe in ultima analisi diminuire la fosforilazione di Akt e l'attivazione attraverso una diminuzione di segnalazione MET. Di conseguenza, abbiamo esaminato i livelli di fosforilazione di Akt dopo miR-144 sovraespressione e osservato una significativa riduzione di fosforilazione di Akt (Figura 4C).
Abbiamo deciso di verificare se miR-144-indotta downregulation MET ha avuto un effetto sulla migrazione delle cellule tumorali e la proliferazione. Abbiamo trasfettato miR-144 e siRNA per MET (siRNA-MET) in SNU-5 celle. la migrazione delle cellule è stata valutata 16 ore dopo la trasfezione da transwell saggio, mentre la proliferazione delle cellule è stato determinato attraverso CCK-8. Come mostrato nelle figure 4D ed E, trasfezione con miR-144 migrazione cellulare e la proliferazione inibita rispetto al controllo. Allo stesso modo, diminuendo l'espressione della proteina MET utilizzando siRNA anche diminuito la migrazione delle cellule tumorali e la proliferazione.
Per determinare se MET è il mediatore critica di effetto di miR-144 in materia di migrazione e la proliferazione cellulare, abbiamo costruito due si sono incontrati vettore di espressione. Uno dei quali contiene un'unica lettura sequenza di frame aperta del MET gene (MET-ORF), e un altro vettore contiene la lunghezza nucleotide pieno di MET gene tra cui sequenza 3'UTR (MET-pieno lungo). Abbiamo quindi effettuato l'analisi Western Blot 48 ore dopo la trasfezione di MET-ORF /MET-pieno lungo in miR-144 imita-trattati SNU-5 celle (Figura 4F). Rispetto al gruppo di controllo negativo (Vuoto vettore), espressione ectopica di MET-ORF aumentato in modo significativo l'espressione totale di MET e fosforilata Akt. Inoltre, l'espressione del MET-ORF promosso la migrazione e la proliferazione delle cellule di GC (Figura 4G e H). Sovraespressione di MET ha abolito l'inibizione del miR-144-indotta della migrazione e la proliferazione cellulare. Al contrario, il livello della proteina di MET e fosforilata-AKT aumentato in cellule AGS trattati con anti-miR-144 (Figura 4i), e il blocco di miR-144 ha inoltre promosso la migrazione e la proliferazione delle cellule AGS (figura 4J e K). Questi risultati indicano che il TEM è un obiettivo fondamentale per l'effetto anti-migrazione di miR-144 in cellule umane GC.
Discussione
In questo studio, abbiamo individuato le firme di un piccolo numero di miRNA e dei geni che non si sovrappongono che sono espressi in modo aberrante peritoneali tessuti metastatici di GC, rispetto ai tessuti primari associati. Analisi di miRNA e profili di espressione genica nel gene-rete miRNA identificati miR-144 come regolatore di importanti vie oncogeniche, come la proliferazione e la migrazione. i pazienti con metastasi peritoneali GC avevano più bassi livelli di espressione di miR-144 rispetto ai pazienti senza metastasi. Questa scoperta implica miR-144 come un potenziale soppressore del tumore in GC. Inoltre, miR-144 è associato con i meccanismi di metastasi. I nostri risultati corrispondono con i risultati di precedenti studi sul ruolo di miR-144 nella proliferazione del cancro, la migrazione e l'invasione [22,23]. miR-144 inibisce le metastasi delle cellule tumorali di mira A disintegrina e membro ADAMTS5 metalloproteinasi (ADAM) famiglia di proteine. MicroRNA disregolazione è associata ad un aumento invasività del tumore e metastasi, così come ridotto la prognosi dei pazienti in alcuni tumori epiteliali [24]. Abbiamo indagato ulteriormente il ruolo di miR-144 deregulation in GC. Abbiamo studiato l'effetto dell'espressione miR-144 nella linea cellulare SNU-5, come è caratterizzato da una bassa espressione di miR-144. espressione ectopica di miR-144 in SNU-5 celle si traduce in cambiamenti fenotipici profondi, come la diminuzione della migrazione. L'esperimento inverso, bloccando miR-144 espressione, è stato condotto nella linea cellulare AGS, che ha un livello relativamente elevato endogena di espressione miR-144. L'inibizione di espressione di miR-144 ha provocato un aumento della migrazione delle cellule AGS.
Per studiare il meccanismo che sta dietro miR-144-dipendente è diminuita la migrazione di GC, abbiamo identificato gli obiettivi putativi per miR-144, come previsto da miRNA-gene-rete. miR-144 sovraespressione in grado di ridurre l'espressione TEM, sia a livello di mRNA che di proteine, e di conseguenza, saggi di luciferasi rivelato che miR-144 può interagire direttamente con il TEM 3'UTR. Abbiamo poi valutato i livelli di espressione MET in una coorte di 52 pazienti GC e abbiamo scoperto che miR-144 livelli sono inversamente correlati alla espressione MET. Per questo motivo, abbiamo ipotizzato che miR-144 inibisce GC tumorigenesi di mira espressione MET. MET è stato anche descritto come target miR-34a /c in altri modelli cellulari ed è noto per promuovere la motilità e la capacità invasiva delle cellule tumorali. Sovraespressione di MET è strettamente correlata con l'invasione del tumore e la prognosi dei pazienti in [6] GC. In GC, MET sovraespressione è un fattore prognostico indipendente e potenziale bersaglio di droga. Inoltre, MET sovraespressione in grado di prevedere quali pazienti potrebbero beneficiare di una terapia mirata con inibitori MET [25]. Nel nostro studio, espressione TEM era significativamente associato con la differenziazione GC, TNM e metastasi [26]. Abbiamo determinato che i cambiamenti nella proliferazione cellulare e la migrazione attraverso miR-144 potrebbero essere esercitate attraverso la regolazione dell'espressione MET. miR-144 repressione porta ad aumento dei livelli di MET, che possono spiegare il fenotipo metastasi delle cellule miR-144-impoverito. È interessante notare che, miR-144 influenzato il fattore di crescita degli epatociti (HGF) di segnalazione. HGF, come il ligando del TEM, può indurre l'attivazione di MET in cellule epiteliali. Mentre MET sovraespressione non poteva ripristinare completamente GC qualità cancerogeni, la migrazione delle cellule GC e la proliferazione sono stati parzialmente ripristinati dopo MET sovraespressione. Pertanto, miR-144 può disciplinare altri geni nelle cellule GC. Precedenti studi hanno dimostrato che il TEM può indurre GC tumorigenesi attraverso l'attivazione del pathway PI3K. In questo studio, abbiamo scoperto che miR-144 attenuato in modo significativo la fosforilazione di Akt, e che fosforilazione di Akt è stata completamente restaurata con sovraespressione di MET. I nostri risultati suggeriscono che miR-144 regola la fosforilazione di Akt attraverso la regolamentazione MET in GC.
In conclusione, il nostro studio ha individuato una base per la diminuzione del livello di miR-144 visto nei tessuti metastatici GC. miR-144 è stato identificato come potenziale soppressore del tumore in GC ed è stata associata con i meccanismi di GC metastasi. Inoltre, miR-144 inibisce GC tumorigenesi di mira MET, e, successivamente, la PI3K /Akt. A nostra conoscenza, questa è la prima volta che miR-144 ha dimostrato di indirizzare MET in cellule GC. Pertanto, ulteriori studi che esplorano il ruolo antitumorale del miR-144 può contribuire allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per GC.
Note
giugno Liu Hui e Xue contribuito in maniera uguale a questo lavoro.
Dichiarazioni
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dal National Science Foundation naturale della Cina (Grant No. 81.201.897). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.
Interessi concorrenti
Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.
Contributi degli autori
JL effettuato gli studi di biologia molecolare. HX ha redatto il manoscritto. JZ ha effettuato l'analisi bioinformatica. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.