PLoS ONE: Down reguliavimas Claudin-18 yra susijęs su proliferacijos ir invazinių potencialo skrandžio vėžio į Invazinių Front

Anotacija

Fonas

Claudins yra žinomas kaip stora sankryžos baltymų, ir jų raiška modelis skrandžio vėžio vis dar prieštaringai. Tarp ekspresijos modelių Glaudžioji jungtis baltymų ir naviko proliferacijos santykiai ankstyvą skrandžio vėžio vis dar toli gražu nėra aišku.

Tikslai

Jei ištirti raiškos modelius claudin-18 ir Ki-67 ir pradžioje skrandžio vėžys tuo invazinės priekyje ir aplinkinių normalus skrandžio gleivinės ir ištirti biologinę funkciją claudin-18 platinimo ir invazijos į vėžines ląsteles.

metodų

septyniasdešimt penki anksti skrandžio vėžiu buvo vertinami pašalinti per endoskopinės gleivinės rezekcija arba endoskopinės gleivine rezekcijos pažeidimai. Visi skrandžio vėžio pažeidimai buvo diagnozuotas diferencijuota adenokarcinoma naudojant japonų klasifikacijos Skrandžio karcinoma. Siekiant įvertinti epitelio proliferaciją, imunodažymu su Ki-67 buvo atliktas, o ženklinimas indeksas apskaičiuotas. Įvertinti epitelio Glaudžioji jungtis baltymų raišką, buvo atliktas imunofluorescencinių dažymo claudin-18. Iš claudin-18 reaktyvumas buvo rūšiuojami pagal tamsintas ląstelių skaičiaus. Koreliacinė analizė buvo atlikta Spearman koreliacijos koeficientas rangas. Transfekciją claudin-18 sirnr (siRNR) buvo atlikta MKN74 A claudin-18-teigiamas skrandžio vėžio ląstelių linija, ištirti claudin-18 poveikį platinimu ir invazijos į vėžines ląsteles.

Rezultatai

Claudin-18 buvo gerokai žemyn reguliuoja skrandžio vėžiu, palyginti su aplinkinių skrandžio normalų gleivinę ar žarnyno Metaplasia. Ki-67 ženklinimą indeksas skrandžio vėžio į invazinių priekyje buvo atvirkščiai koreliuoja su claudin-18 lygio, bet tuo gleivinės pažeidimo nebuvo susiję. Claudin-18 nokdaunas gerokai skatino MKN74 platinimu, lyginant su kontrolinės siRNA-perkeltų ląstelių. MKN74 invazija žymiai padidėjo su claudin-18 siRNA transfekciją palyginti su kontrolės siRNA transfekciją.

Išvados

Down reguliavimo claudin-18 yra susijęs su proliferacijos potencialo tuo invazinės skrandžio vėžio priekio tai rodo, kad jis turi svarbų vaidmenį skrandžio vėžio progresavimo

nurodomoji dalis:. Oshima T Šanis J Okugawa T Chen X choras K Tomita, T et al. (2013) žemyn-reguliavimas Claudin-18 yra susijęs su proliferacijos ir invazinių potencialo skrandžio vėžio tuo Invazinių fronto. PLoS ONE 8 (9): e74757. Doi: 10,1371 /journal.pone.0074757

redaktorius: DunFa Peng, Vanderbilt universiteto medicinos centras, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Gegužės 28, 2013; Priimtas rugpjūčio 6, 2013 m Paskelbta rugsėjo 20, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Oshima et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė švietimo, kultūros, sporto, mokslo ir technologijų Japonijos ministerijos per 2010-2012 (Nr 22590691) Subsidija-in-pagalbos moksliniams tyrimams (C). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra ketvirtas dažniausiai diagnozuota piktybinių navikų ir antra labiausiai paplitusi priežastis, dėl vėžio susijusio mirtingumo visame pasaulyje [1], [2]. Intramucosal GC galima gydomojo gydomi endoskopinės gydymą. Be to, endoskopinis Po gleivine skrodimo (ESD) technika išplėtė endoskopinių gydymo indikacijas ir leido lt bloko rezekcijos intramucosal didelis ir šiek tiek gleivine ankstyvojo invazinio GCS [3]. EN bloko rezekcija iki ESD leidžia tiksliai diagnozuoti vėžį gylis [4].

Tight sankryžos (TJS) yra specializuoti membraniniai domenai Pačiu viršūninio regione poliarizuota epitelio ir endotelio ląstelių [5]. Claudins yra pagrindiniai TJ baltymai; jie susideda iš ne mažiau kaip 27 narių baltymų ir yra išreikšti audinių-specifinis būdu [6], [7]. Jie reguliuoja paracellular pralaidumą ir nustatyti epitelio ląstelių poliškumą jų tvoros funkcija [6], [8]. Vis daugiau naujausių duomenų matyti, kad claudins yra pagrindiniai struktūriniai ir funkciniai komponentai Tj sruogų [6], [9], ir jie gali suvaidinti lemiamą vaidmenį Tumorigenesis ir uždegimas [10], [11].

skrandžio epitelio eksponatų pokyčių claudin išraiška nuo normalaus gleivinės žarnyno metaplazijos ir adenokarcinoma seriją. Nors GCS buvo neseniai klasifikuojami pagal muciną pagrindu išraiška [12], [13] A claudin pagrindu GC klasifikacija taip pat buvo pasiūlyta [14]. Mes taip pat pranešė, kad žemyn reguliavimas claudin-3 buvo susijęs su intramucosal GC [15] platinimu. Neseniai claudin-18 grandininį iš pelėms buvo įrodyta, kad skrandžio gleivinės atrofija ir paracellular H ^{+ jonų nuotėkio [16]. Claudin-18a2 buvo įrodyta, kad dažnai žemyn reguliuojama GC iš žarnyno fenotipą, o tai rodo, kad claudin-18a2 būtų gera žymeklis GC [17]. Tačiau biologinis funkcija claudin-18, kurie gali būti įtraukti į vėžio ląstelių elgesį, niekada nebuvo nagrinėjami. Be to, nėra aišku, kuri būdinga GC ląstelių tuo invazinės priekyje yra susijęs su spartaus augimo ar agresyvumo invazijos.}

Šioje studijoje, žodžiai lygis claudin-18 GC tuo invazinės priekio ir aplinkinių skrandžio gleivinės buvo tikrinama, ar pirmą kartą, ir tarp claudin-18 lygio ir Ki-67 ženklinimo indekso (LI) GC koreliacija buvo įvertintas. Iš claudin-18 poveikis platinimu ir invaziškumo pat buvo tiriama, in vitro
.

Medžiagos ir metodai

Pacientai

iš eilės serija 74 pacientų anksčiau laiko GC buvo tiriami (1 lentelė). buvo vertinami GC pažeidimai (n = 75), kad buvo atlikta gydomoji EMR ar ESD. GCS su gleivine invazijos (n = 31) buvo įtrauktos į šį tyrimą. Dvigubi vėžio buvo aptikta tik vienoje vyrų pacientui. Visi GC buvo klasifikuojami kaip diferencijuota adenokarcinoma naudojant japonų klasifikacijos Skrandžio karcinomos [18]. Paciento anonimiškumas buvo išsaugotas. Šis tyrimas buvo atliekamas laikantis Helsinkio deklaracijos ir patvirtino Etikos komitetas /Institucinės peržiūros valdybos Hyogo medicinos koledžo. Objektas davė parašyta informuoto sutikimo.

imunohistocheminis

Mėginiai buvo nustatytos su 10% formalino tirpalu ir įdėta į parafiną. Skyriai buvo sumažinti iki 3 pm storio ir buvo tamsintas hematoksilinu ir eozinu (HE). Siekiant įvertinti epitelio proliferaciją, mėginiai buvo inkubuojami su Ki-67 monokloninis antikūnas (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) po inkubacijos su biotinilinto arklio kovos su pelės antrinio antikūno (Vector Laboratories, Burlingame, CA, JAV). Streptavidino-biotinas kompleksas metodas (Vector Laboratories) buvo naudojamas vizualizuoti reaktyvumas. Branduoliai buvo counterstained hematoksilinu.

imunofluorescencinių Dažymo ir Junctional baltymų

Rabbit Anti-claudin-18 polikloniniu antikūnų (Invitrogen) ir Cy3 konjuguoto ožkos anti-triušio IgG (Jacksonas ImmunoResearch Laboratorijos, Vakarų Grove , Pensilvanija, JAV) antrinis antikūnas buvo naudojamas vizualizuoti reaktyvumas. Reakcijos specifiškumas buvo išbandytas inkubacijos su ne imuninė triušis serume (Dako, Glostrup, Danija).

Balai iš imunodažymu iš Claudin-18 ir Ki-67

reaktyvumas buvo įvertintas du nepriklausomi stebėtojai (T.Ok., XC), ir abu buvo aklas klinikos funkcijų ir klinikinių rezultatų, susijusių su kiekvieno mėginio. Ne neoplazminė skrandžio gleivinė be žarnyno metaplazijos (ne MP) ir žarnyno metaplazijos (MP) ir vėžio regionuose buvo įvertintas. Iš claudin-18 reaktyvumas buvo rūšiuojami pagal tokius kriterijus: 0 nebuvimas membranos nusidažo; 1+, mažiau nei 10% naviko ląstelių, turinčių visiškai membraninį dėmių; 2+, nuo 10% iki 50% naviko ląstelių, turinčių visiškai membranos raiškos; 3+, daugiau nei 50% iki 75% naviko ląstelių, turinčių visiškai, stipri membranos raiškos; ir 4+, daugiau nei 75% ląstelių, turinčių visiškai, labai stiprus membranos raiškos. Penki didelės galios laukai buvo analizuojami kiekvienu atvejų regione ir vidutinis rezultatas buvo apskaičiuotas. Visi skyriai pelnė du kartus patvirtinti rezultatų atkuriamumas. Ki-67 LI buvo apskaičiuojamas po skaičiuoti 1000 vėžines ląsteles.

sirnr (siRNR) triuškinantis eksperimentai

siRNA nuslopinami žmogaus claudin-18 ON TARGET plius SMARTpool ir ne specifinę valdymo siRNR buvo įsigytas iš Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, JAV). MKN74 ląstelių linija (japonų rinkimas Tyrimų Bioresources Mobilusis bankas, Osaka, Japonija), kuris yra CLDN18
-positive, buvo pasirinktas išstudijuoti claudin-18 triuškinantis poveikį platinimo ir invazija savybių GC ląstelių , Ląstelės buvo pernešta su 25 nM siRNA naudojant DharmaFECTTM3 (Dharmacon, Inc.). Valdymo ir kontrolės siRNA grupės buvo gydomi transfekcijos reagentų be siRNA ir transfekcijos reagentų nespecifinių valdymo siRNA, atitinkamai. Tyrimai buvo atlikti 3 dienas po to, kai MKN74 ląstelės buvo transfekuota.

ląstelių proliferacijos Analizės

ląstelių proliferacija buvo nustatomas pagal kolorimetrinės analizuojant ląstelių gyvybingumo remiantis į tetrazolio druskos skilimo BTS-1 pagal mitochondrijų dehidrogenazių (Takara "Bio Inc, Otsu, Japonija). Formazano dažų, absorbcija, susidaro, kuris koreliuoja su metaboliškai aktyvių ląstelių kultūros skaičius, buvo matuojamas 450 nm 1 h įpylus reagento.

invazija Analizės

MKN74 ląstelių invazija buvo tiriami per 24 duobučių Biocoat Matrigel invazija rūmų (8 mikrometrai; Becton Dickinson, Franklinas ežerų, NJ, JAV) pagal gamintojo protokolą. Apatinės kameros buvo pripildyti RPMI1640 su 10% FBS ir ląstelės (2 × 10 ^{5) buvo dedamas į įdėklą kontorą, kuri esančius RPMI1640 be FBS. Po 24-h inkubacijos neinvazinių ląstelės buvo pašalintos su medvilniniu tamponu. Ląstelės, kurios migravo per membraną ir priklijuotiems prie apatinio paviršiaus membranos buvo nustatyti su 10% formalinu ir nudažomi hematoksilinu. Kiekybiniam, ląstelės buvo skaičiuojami pagal mikroskopu penkių atsitiktinių didelės galios srityse. Tyrimai buvo pakartotas tris kartus. Invazija santykis kontroliuoti terpę buvo apskaičiuojamas.}

Statistinė analizė

Statistinis įvertinimas buvo atliktas naudojant SPSS13.0 (SPSS, Čikaga, IL, JAV). Koreliacinė analizė buvo atlikta Spearman rangas koreliacijos koeficientas (R). Keli palyginimai buvo atliekami naudojant Kruskal-Wallis testą po Scheffer testo. Pavieniai buvo lyginama atlieka Mann-Whitney testą. P
. ≪ 0,05 buvo laikomas reikšminga

Rezultatai

išraiška Claudin-18 skrandžio gleivinę ir vėžys

75 diferencijuotų GC atvejais iš viso buvo analizuojami šiame tyrime. Skyriai buvo tamsintas su claudin-18 ir dažymo lygis buvo rūšiuojami. Claudin-18 aptikta didelis kiekis skrandžio epitelio ląsteles viršūninio ir šoninių šoninių sienų ne MP bet ne IM arba diferencijuotų adenokarcinoma ląstelių (pav. 1A). Iš claudin-18 koncentracija buvo žymiai mažesnis vėžinių ląstelių nei ne-IM ir IM, taip pat žymiai mažesnis IV, palyginti su ne-MP (Fig. 1B).

aptikimas Claudin-18 GCS su gleivine invazija

atstovybės GC atvejai su gleivine invazijos parodė, kad stora claudin-18 dėmių buvo akivaizdu, ne invaziniam Po gleivine įsiveržė vėžio ląstelių priekio, ir Ki-67 LI buvo nedidelis pažeidimo (pav. 2A ). Tuo atveju, su mažu claudin-18 dažymo tuo invaziniam pogleivinės įsiveržė-vėžinių ląstelių priekyje, Ki-67 LI buvo aukštos tuo pažeidimui (2A pav.).

koreliacija Claudin-18 lygio ir Ki -67 LI

Ki-67 LI GC per gleivinę ir submucosa nulėmė Ki-67-teigiamų branduolių procentais. Nustatyti tarp Ki-67 LI ir claudin-18 lygio koreliaciją, koreliacija analizė buvo atlikta. Gleivinės išraiška lygis claudin-18 buvo reikšmingai koreliuoja su Ki-67 LI (RS = 0,07 p =
0,60). Kita vertus, po gleivine claudin-18 išraiška lygis buvo gerokai atvirkščiai koreliuoja su gleivine Ki-67 LI (RS = -0,550 P
= 0,0010) (pav. 2b).

poveikis claudin-18 siRNA ant platinimu ir invazija GC Cells

GC ląstelių linija, MKN74, constitutively išreiškė claudin-18, o iRNR lygis claudin-18 buvo žymiai sumažintas siRNA prieš claudin- (3A pav.) 18. Imunofluorescenciniam su claudin-18 taip pat sumažėjo po transfekciją (3b pav.). Be claudin-18 žemyn reguliuojama MKN74, ląstelių augimas buvo žymiai padidėjęs (4a pav.), O iš ląstelių invazija buvo žymiai padidėjęs (pav. 4B).

Diskusijos

Altered išraiška iš claudins po gleivine invazinės priekyje gali būti susijęs su GC progresavimą. Naujausi tyrimai rodo, kad net šiek tiek gleivine invazinių GC be limfinės ir kraujagyslių invazija, ESD gali būti įmanoma kaip gydomojo veikimo [19]. Tačiau ji vis dar nėra aišku, kokiais atvejais šiek tiek gleivine invazinių GC gali būti naudojama be tolesnio operacijos po ESD. Šiame tyrime, buvo nustatyta, kad buvo atvirkštinė koreliacija tarp claudin-18 lygio ir Ki-67 pozityvumo prie invaziniam gleivine invazinės GC priekio, ir kad claudin-18 reguliuojamos GC ląstelių invazija ir platinimu. Ki-67 imunohistocheminis buvo pakeitė mitozinio jų skaičių, siekiant įvertinti naviko ląstelių proliferaciją. Tyrimai parodė, kad Ki-67 koreliuoja su nediferencijuotose ir metastazavusiu ląstelių piktybinių navikų [20]. Šiame tyrime, tik EUROLOGISTIKA /ESD-rezekcijos GC, kurioje duomenys yra riboti, padarytų taikant skirtingas tipo GC buvo tiriamas. Todėl, šie duomenys rodo, kad Ki-67 lygis invazinė priešais buvo susijęs su metastazinių ląstelių piktybinių ligų mechanizmus, kad iš claudin-18 praradimas buvo vienas iš GC agresyvumo žymenų ir gali būti susijęs su metastazių plėtros, dėl kurios reikia Papildoma chirurgija po ESD gydymo

Claudins yra neįprastai reguliuojama nuo piktybinių navikų, tokių kaip GC, kepenų ląstelių karcinoma, tulžies takų karcinomos, krūties vėžio, inkstų ląstelių karcinoma ir mezoteliomą [15] įvairovė [21] -. [ ,,,0],25]. Į claudins pakeitimas sankryžose yra susijusi su nuostolių stora sukibimo ir poliariškumui epitelyje. Praradimas poliškumas yra susijęs su padidėjusia ląstelių proliferacija ir epitelio-į mezenchimos perėjimo, o sutrikimais Glaudžioji jungtis kompleksų pakeisti ląstelių-ląstelių sąveikas, kurios yra susijusios su invazija ir metastazių [23], [26], [27]. Be stebėjimo tyrimų, sumažėja claudin-3 ir -4 buvo pranešta apie GC ląstelių tuo invazinės priekyje ir buvo nustatyta, kad koreliuoja su vėžio progresavimo ir metastazių [14]. Žemyn-reguliavimas claudins taip pat buvo pranešimų, kad kai kitų epitelinių navikų, įskaitant praradimo claudin-1 krūties vėžio [28] ir storosios žarnos vėžio [29], taip pat kaip claudin-7 nuostolių krūties vėžio [30] ir galvos ir kaklo vėžys [31]. Dėl auglio ląstelių invaziją, sumažintas išraiška claudin-7 tuo invazinio priešais buvo nustatyta, kad turi būti susietas su invazijos ir limfinės dalyvavimo suragėjusių ląstelių karcinoma, stemplės [32] gylio. Nors claudin-3 ir claudin-7 išsireiškimai buvo mažesnis gleivine invazinės priekyje nei gleivinės pakitimų mūsų ankstesniame tyrime, claudin-3 ir claudin-7 lygiai tuo invazinės priekyje nebuvo susijęs su Ki-67 LI [15]. Kita vertus, claudin-18 ne invazinė priešais buvo atvirkščiai koreliuoja su Ki-67 LI šiame tyrime. Šie duomenys gali būti susiję su išvadomis, kad claudin-3 ir claudin-4 nebuvo susiję su limfmazgių metastazių [33]. Be to, šie stebėjimo tyrimai negali paaiškinti, ar šie pokyčiai tiesiogiai veikia naviko invazija ir metastazes.

Claudin-18 daugiausia išreikštas skrandžio ir plaučių epitelio ląstelių. Claudin-18a2 yra bambą forma, o izoformų yra šiek tiek kitoks. Ankstesnėje ataskaitoje, skrandžio tipas claudin-18 buvo prarasta GCS [17]. Tačiau per žarnyno metaplazijos pasakymas modelis claudins jau skiriasi nuo įprastų skrandžio epitelyje. buvo nustatyta, kad claudin-18 išnykimą, sietinus su žarnyno metaplazijos skrandžio [17]. Todėl claudin-18 išraiškos gydant išplitusį GC [17] praradimas gali ne tik įrodyti, kad vėžio charakterį. Net ir GC progresavimo procesą, raiškos lygis gali keistis. Tirti šių tikslinių molekulių funkciją, mes manome, kad tai buvo svarbu ištirti navikai tuo pačiu scenoje, ir mes įvertino claudin-18 lygį, kuris gali turėti įtakos invazija ir metastazes, šiek tiek gleivine invazinių GC pakitimus. Be to, skrandžio gleivinės claudin-18 gali neveikti tiesiog ne TJS, nes išreiškė lokalizacija ant ląstelės paviršiaus buvo ne tik TJS. Tolesni tyrimai reikalingi išnagrinėti fiziologinius ir patofiziologinių TJ baltymų išraiškas į šoninio membrana.

Jei išnagrinėti, ar claudin-18 lygių pakeitimus po gleivine invazinės priešais prisidėjo prie platinimo ir invazijos į vėžio ląsteles, siRNA požiūris buvo naudojamas triuškinantis baltymų į MKN74 GC ląstelių linija, kuri yra teigiamas claudin-18. Taigi, ši studija parodė, kad pirmą kartą į claudin-18 funkciją GC naudojant genetinį metodą, ir kad claudin-18 sumažėjimo, dalyvaujantis platinimu ir invazijos į GC ląsteles. Kartu su šiais duomenimis, nuostolis claudin-18 po gleivine invazinės priešais nurodė daugiau agresyvių savybių įgijimą ir gali leisti mobilųjį ląstelių disociacija invazijos metu. Tačiau šio tyrimo senatis buvo, kad tik MKN74 būtų galima nagrinėti, nes tai buvo vienintelis diferencijuotas skrandžio vėžio ląstelių linija, kuri išreiškė claudin-18 kiek mes išanalizavome. Todėl, panašus reiškiniai negali būti kopijuojami su kitais skrandžio vėžio ląstelių linijas.

Ir iki reguliavimą ir žemyn reguliavimo claudins buvo pranešta, kad dalyvauja vėžio procesą [34], [35]. Už iš claudins į vėžinių ląstelių funkcijos analizės, genetinių požiūris į claudins taip pat buvo pastebėta įvairių vėžinių ląstelių. Nokdaunas iš claudin-1 iki siRNA lėmė migracijos slopinimo storosios žarnos vėžinių ląstelių [36]. Iš claudin-6, claudin-7, ar claudin-9 raiška sustiprino invazinių skrandžio adenokarcinoma ląstelių linijos [37] potencialą. Toks claudin sukeltos neplatinimo ir invazija gali atrodyti paradoksalu, nes claudins yra žinoma, kad dalyvauti sandarinimo epitelio sankryžas. Šie prieštaringi duomenys rodo, kad claudins funkcijos yra tiek subtype- ir ląstelių tipo konkretus.

Kaip šio tyrimo apribojimų, ji vis dar nėra aišku, ar tai sumažėjo claudin-18 lygį po gleivine invazinės priekyje iš tikrųjų dalyvauja vėžio metastazių, nes sunku sekti gamtos istoriją pradžioje gCS. Tačiau šiame tyrime duomenys rodo, kad mažesnis claudin-18 lygis invazinė priešais buvo susijęs su didesniu proliferacinės tendencija. Būtina, kuri numato ištirti, ar šis sumažėjimas į claudin-18 lygiu gali būti naudojamas kaip metastazių ir prognostiniu biožymens po endoskopinio rezekcija pagal ateityje tyrimo.

Apibendrinant, tai buvo parodyta pirmą kartą, kad claudin-18 yra nevienodai išreikšti ne anksti GC po gleivine invazinės priekio, ir žemyn reguliavimo claudin-18 yra susijęs su proliferacijos ir invazinės potencialo GC. Šie rezultatai rodo, kad claudin-18 turi lemiamą vaidmenį GC progresavimo ir būti kandidatu biologinis ligos progresavimo. Claudin-18 nokdaunas eksperimentas patvirtino, kad junctional claudin-18 slopinimas skatino platinimu ir invazija GC ląsteles.

Padėka

Ačiū ponia Noriko Kamiya techninei pagalbai.

• PLoS ONE: Tetrandrine Skatina Mitochondrijos tarpininkaujant apoptozę žmogaus skrandžio vėžys BGC-823 Cells
• PLoS ONE: Helicobacter pylori infekcija synergizes su trimis uždegimui genetinių variantų į GWASs į riziką didinančių skrandžio vėžio į Kinijos gyventojų