PLoS ONE: Twist1 Fremmer Gastric Cancer Cell Proliferation gjennom oppregulering av FoxM1

Abstract

Twist-relatert protein 1 (Twist1), også kjent som klasse A enkel helix-loop-helix protein 38 (bHLHa38), har vært innblandet i cellen avstamning besluttsomhet og differensiering. Tidligere studier viser at Twist1 uttrykk er oppregulert i magekreft med dårlige kliniske resultater. Dessuten er Twist1 foreslått å være involvert i utviklingen av human magekreft. Men dens biologiske funksjoner forblir stort sett uutforsket. I denne studien, viser vi at Twist en overekspresjon fører til en betydelig oppregulering av FoxM1, som spiller en sentral rolle i cellesyklusprogresjon i magekreftceller. I motsetning til dette, knockdown av Twist en reduserer FoxM1 ekspresjon, noe som tyder på at FoxM1 kan være et direkte mål transkripsjonen av Twist 1. På molekylært nivå, har vi videre viser at Twist 1 kan binde seg til promotor-regionen i FoxM1, og deretter rekruttere p300 for å indusere FoxM1 mRNA transkripsjon. Derfor våre resultater avdekke et tidligere ukjent Twist 1 /FoxM1 regulatorisk vei, noe som kan bidra til å forstå mekanismene for magekreft spredning

Citation. Qian J, Luo Y, Gu X, Zhan W, Wang X ( 2013) Twist1 Fremmer Gastric Cancer Cell Proliferation gjennom oppregulering av FoxM1. PLoS ONE 8 (10): e77625. doi: 10,1371 /journal.pone.0077625

Redaktør: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, USA

mottatt: 31. mai 2013; Akseptert: 3. september 2013, Publisert: 24 oktober 2013

Copyright: © 2013 Qian et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Epitelial-mesenchymale-overgang (EMT) er en prosess hvorved epitelceller miste polaritet og celle-til-celle-adhesjon, og gjennomgår dramatisk ombygging av cytoskjelettet [1,2]. Samtidig med tap av epiteliale celle adhesjon og cytoskeletal komponenter, celler gjennomgår EMT erverve uttrykk for mesenchymale komponenter og en trekkfugl fenotype [2,3].

Flere viktige indusere av EMT er transkripsjonsfaktorer, inkludert Twist 1, sneglen, og Slug, som undertrykker E-cadherin uttrykk [4,5]. Twist1 tilhører den grunnleggende helix-loop-helix transkripsjonsfaktor familie [6]. I utgangspunktet Twist1 ble foreslått for å være vesentlig i utviklingen av mesodermally avledet vev, inkludert muskel og osteogene celle-linjer [7,8]. Senere studier har vist at Twist en fremmer EMT og spiller en viktig rolle i metastaser i flere tumormodeller [9,10]. Expression of Twist 1 har også vært innblandet i markedsføringen av metastaser og invasive patologiske undergrupper i flere typer kreft [11]. Derfor Twist 1 har blitt foreslått å ha onkogene egenskaper. For eksempel overekspresjon av Twist i rhabdomyosarkom inhiberer Myc-indusert apoptose og griper med p53 tumor suppresjon [12]. Oppregulering av Twist er assosiert med malign transformasjon i T-celle lymfom [13]. Tvunget uttrykk for Twist utløser motstand av menneskelige kreftceller til legemidler som hemmer microtubule formasjon [14].

Men effekten og mekanismen av Twist genet på spredning av magekreft forblir gåtefull. Nyere studier har vist at Twist1 Er oppregulert i mage kreft-assosiert fibroblaster med dårlige kliniske utfall [15]. Dessuten, nedregulering av den Twist 1-genet trykkes spredning av magecancerceller ved negativ regulering av AP-1-aktivitet som resulterer i cyklin D1 uttrykket nedad [16]. I dette arbeidet ble to magekreftcellelinjer ansatt for å undersøke effekten og mekanismen for Twist 1 genet på celleproliferasjon.

Materialer og metoder

Cell Culture

Fire epiteliale cellelinjer (NCI-N87, AGS, HGC-27 og MGC80-3) avledet fra gastrisk karsinom ble oppnådd fra American Type Culture Collection (USA). Celler ble dyrket i DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt bovint serum (Gibco, Beijing). Kulturer ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 5% CO _2.

Liten interfering RNA, RNA ekstraksjon og Real-time analyse

Celler ble sådd på 6- vel platene deretter tilført med 50 nM siRNA oligos rettet mot menneskelig Twist 1 (Dharmacon, USA). SiRNA-molekyl som er spesifikt for grønt fluorescerende protein (GFP) ble anvendt som negativ kontroll. Totalt RNA ble ekstrahert fra celler ved TRIzol reagent, og omvendt transkripsjoner ble utført av Takara RNA PCR kit (Takara, Kina) etter produsentens protokoll. For å kvantifisere transkripsjoner av rente gener, real-time PCR ble utført ved hjelp av en SYBR Grønn Premiks Ex Taq (Takara, Japan) på Lyse Cycler 480 (Roche, Sveits).

Forbigående transfections og luciferase Analyser

Menneskelig FOXM1 promoter ble forsterket fra humant genomisk DNA mal og satt inn pGL4.15 enkel vektor (Promega). Mutant Twist1 bindingsmotivet ble generert ved hjelp av en PCR-mutagenese kit (Toyobo) med en primer (mutasjonssider understreket): 5'-CGCATTACGAATCAGGTTAAGCCAGTT-3 'og en revers primer komplement. Alle forbigående transfections ble utført av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Shanghai), i henhold til produsentens instruksjoner. For luciferase reporter-analyser, ble cellene sådd ut i 24-brønners plater og transfektert med de angitte plasmidene. 48 timer etter transfeksjon, ble luciferase-aktivitet målt ved hjelp av den doble luciferase reporter Assay System (Promega, USA).

Co-immunutfelling

Cellene ble høstet, resuspendert i lyseringsbuffer inneholdende 50 mM Tris- HCl (pH 7,3-7,5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Triton X-100) og protease-inhibitorer. Lysater ble inkubert med 2,5 ug av p300 eller IgG over natten ved 4 ° C. Protein A-kuler ble tilsatt i ytterligere 4 timer. Perler inneholdende immunkomplekser ble vasket med 1 ml iskald lyseringsbuffer for fire ganger. Bunnfallet ble denaturert i Laemmli (gel lasting) buffer ved 95 ° C i 10 min.

Western Blot

Cellene ble høstet ved trypsinering, lysert i Laemmli-buffer, denaturert i 10 minutter ved 80 ° C, og vedtok SDS /PAGE-geler. Etter immunoblotting ble membranene blokkert i PBS /0,1% Tween-20 med 7,5% fettfri tørrmelk, og primære antistoffer ble inkubert i PBS /0,1% Tween-20 med 0,1% -5% fettfri tørrmelk. Antistoffer rettet mot Twist 1, ble FoxM1 kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (USA). Anti-p300 og GAPDH antistoffer ble oppnådd fra Abcam Company (USA). Anti-p21, p27, Cyclin B1, Cyclin D1, Cyclin D2, Cyclin E og E-cadherin antistoffer var fra Cellsignaling (USA).

Chromatin Immunpresipitasjon (chip) assay

Kromatin immunoprecipitation ( chip) analysesett ble brukt (Upstate, USA). Kort fortalt Cellene ble fiksert med 1% formaldehyd og bearbeides videre ved hjelp av Upstate chip analysesett. Løselig kromatin ble immunopresipitert med anti-Twist 1 og IgG antistoffer. Etter rensing ble DNA-prøver kvantifisert ved kvantitativ real-time PCR ved hjelp av primere som omfatter proksimale region av menneskelig FoxM1 promoter.

Statistical Analysis

Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Statistiske forskjeller ble bestemt ved en to-halet t-test. Statistisk signifikans er vist som * (P < 0,05), ** (P < 0,01) eller *** (P < 0,001).

Resultater

Effekt av Twist1 på magekreft celleproliferasjon

Ved første, for å utforske den funksjonelle rollen Twist 1 i celleproliferasjon, vi omformet NCI-N87 eller AGS celler med adenovirus som inneholder Twist en eller tom vektor (figur 1A og 1B). I samsvar med tidligere studier, uttrykk for E-cadherin, en biomarkør for EMT prosessen [4,5], ble nedregulert av Twist en overekspresjon (Figur S1 A-1B). Dessuten, Twist en overekspresjon resulterte i en betydelig økning i celletall på alle celler som ble testet (figur 1C og 1D). Konsekvent, bromdeoksyuridin (BrdU) analyse bekreftet også at Twist en overekspresjon fremmet celleproliferasjon (figur 1E og 1F). Dessuten, Twist 1 overekspresjon-celler hadde en signifikant lavere prosentdel av celler i G1 /G0 fase og økte prosentandelen av celler i S-fasen, sammenlignet med tom vektor-transfekterte celler (figur 1G-1H).

Neste , NCI-N87 eller AGS-celler ble transfektert med liten interfererende RNA (siRNA) som målretter Twist 1. siRNA oligo viste effektiv Twist en knockdown i disse to cellene, sammenlignet med GFP siRNA-transduserte celler (figur 2A-2D). Som et resultat, nedregulering av Twist en førte til en markert reduksjon i celleantall og proliferasjon i disse cellene (figur 2E-2H). I tillegg stanse av Twist en økt betydelig prosentandelen av celler i G0 /G1 fase og reduserte prosentandelen av celler i S-fasen (Figur 2I-2J). Spesielt, sammenlignet vi proliferasjonsaktivitet av NCI-N87 og AGS-celler med eller uten transfeksjon av tom vektor eller GFP siRNA. Våre resultater tyder på at hverken tom vektor eller GFP siRNA påvirker celleproliferasjon aktivitet (figur S2A). Dessuten veksten evnen til celler som uttrykker høyere Twist 1 nivåer (NCI-N87 og AGS celler) er relativt høyere enn andre (HGC-27 og MGC80-3 celler) (Figur S2C). Til sammen våre resultater tyder på at Twist en kan være en viktig positiv regulering av magekreft celleproliferasjon.

Twist1 påvirker uttrykk for celle-syklus regulatorer

Som Twist en forfremmet celleproliferasjon, undersøkte vi sine funksjoner på uttrykket av gener som regulerer G1 /S overgang, inkludert CDK hemmere p21 ^{Cip1, p27 Kip1, CDK regulator Cyclin B1, Cyclin D1, Cyclin D2 og Cyclin E. Resultater fra real- time PCR og Western blotting-analyse i NCI-N87 celler antydet at uttrykket av p21 Cip1, p27 Kip1 ble nedregulert mens cyclin B1, Cyclin D1, Cyclin D2 og Cyclin E-nivåer ble oppregulert i Twist 1-transfekterte celler, sammenlignet med tom vektor-transfekterte celler (figur 3A-3B). Lignende resultater ble også observert i AGS celle (figur 3C-3D), noe som ytterligere bekrefter at Twist 1 kan påvirke proliferasjon av magekreftceller. Konsekvent, knockdown of Twist en økt p21 Cip1 og p27 Kip1 uttrykk mens redusert Cyclin B1, Cyclin D1, Cyclin D2 og Cyclin E uttrykk i NCI-N87 og AGS celler (figur 4A-4D).}

vri en er rettet direkte transkripsjonsfaktor FoxM1 i magekreftceller

Tidligere studier har vist at flere transkripsjonelle faktorer kan regulere en serie av gener som er relevante for cellesyklus, inkludert p21 ^{Cip1, p27 Kip1 og Cyclin B1. Således vi analyserte de potensielle transkripsjonsfaktorer som deltar i regulering av celleproliferasjon. Av fem testede transkripsjonsfaktorer, bare FoxM1 ble funnet å være signifikant økt i NCI-N87-celler som overuttrykker Twist 1 (figur 5A-5B). Induksjonen av FoxM1 ble også observert i AGS-celler (Figur 5C-5D). I tillegg ble FoxM1 uttrykk redusert i disse celle utarmet av Twist 1 (Figur 6A-6D), noe som tyder på at FoxM1 kan være et mål for Twist 1.}

Twist en oppregulerer FoxM1 uttrykk gjennom rekruttering av p300

Deretter fokuserte vi på den molekylære mekanismen for Twist en regulering av FoxM1 transkripsjon. Sekvensanalyse viste at den promoter-regionen av humant FoxM1 gen inneholdt en potensiell Twist ett bindingssete (mellom -357 og -352 bp) (figur 7A). Luciferase rapport analyse viste at den transkripsjonelle aktivitet av villtype-promotoren FoxM1 ble dramatisk oppregulert ved Twist 1, mens den transkripsjonelle aktiviteten ble opphevet i promoteren som bærer en mutasjon i en Twist-bindingsseter (figur 7B). Videre chip analyser viste at Twist en kunne unikt binde seg til FoxM1 promoter (figur 7C). For å avgjøre om induksjon av FoxM1 av Twist 1 er nødvendig for sin proliferativ effekt, gjennomførte vi forsøk med FoxM1 knockdown ved hjelp av siRNA oligos i NCI-N87 celler (Figur S3A-S3b). Som et resultat av den siRNA reddet celler fra den proliferative virkning av Twist en overekspresjon (figur S3C). Konsekvent, funksjoner Twist 1 på uttrykket nivåer av celle-syklus regulatorer ble også reversert av FoxM1 siRNA oligonukleotider (figur s3D), noe som tyder på at FoxM1 er nødvendig for rollene som Twist 1 i mage kreftceller.

Som en transkripsjonsfaktor, kan Twist en rekruttere coactivators i reguleringen av målet genuttrykk. Tidligere studier har vist at p300 kunne fungere som en coactivator for mange transkripsjonsfaktorer. Vi derfor undersøkt om p300 kan være en coactivator for Twist en regulering av FoxM1 uttrykk. Som vist i figur 7D, kunne vri en interagere med p300 ved coimmunoprecipitation. Den transkripsjonen aktivitet av FoxM1 promoter ble videre oppregulert ved co-transfeksjon av p300 og Twist 1 (figur 7E). Videre tilbyr vi ytterligere avskaffet p300 uttrykk ved hjelp av siRNA oligos i NCI-N87 celler (figur 7F). Som ventet ble Twist 1-indusert FoxM1 uttrykk betydelig avstumpet av stillhet av p300 (figur 7G-7H). De ovennevnte data viste at Twist en oppregulert FoxM1 uttrykk gjennom en rekruttering av transkripsjons coactivator komplekser, inkludert p300.

Diskusjoner

I denne studien, våre resultater antyder Twist en som en kritisk regulator av mage kreft progresjon. Dette er foreslått av flere linjer av bevis. For det første fremmer Twist en overekspresjon mens dens mangel hemmer celleproliferasjonen, som vist ved BrdU og cellesyklusanalyse. For det andre, Twist en påvirker genene ekspresjonen av cellesyklus modulatorer, inkludert CDK-inhibitorer p21Cip1, p27Kip1, CDK regulator cyklin B1, Cyclin D1, D2 og syklin syklin E. For det tredje, Twist en oppregulerer direkte FoxM1 ekspresjonen på transkripsjonsnivå, via rekruttering av P300. I tillegg knockdown av endogen FoxM1 uttrykk demper den proliferative effekten av Twist 1, noe som tyder på at FoxM1 er viktig for rollene som Twist 1 i mage kreftceller.

Hos voksne er Twist en hovedsakelig uttrykt i forloperceller inkludert osteoblastiske, myogenic, odontoblastic og myelomonocytisk linjene, opprettholde sin udifferensiert tilstand [17]. Dessuten er Twist1 også en viktig regulator av mange andre biologiske prosesser, herunder mesenchymale utvikling og brune fettstoffskiftet. For eksempel er Twist1 antas å inhibere osteoblast differensiering av negativt å regulere Runx2 [17]. Dessuten er Twist-en selektivt uttrykt i fettvev, samhandler med PGC-1α, å undertrykke mitokondrie metabolisme og frakobling. Som et resultat av transgene mus som overuttrykker Twist-1 i fettvevet er utsatt for høy-fett-diett-indusert fedme, mens dens heterozygote knockout-mus er resistente fedme [18]. Videre Twist en atom ekspresjon ble også observert i ikke-noncancerous epitel, hvilket antyder at Twist 1 kan ha en fysiologisk rolle i normale celler [19]. Senere studier viser at Twist 1 uttrykket er korrelert med potent invasivitet samt dårlig prognose i epithelial kreft. I magekreft, har en fersk rapport vist overekspresjon av Twist 1 genet er oftere funnet i diffuse-type karsinom vev med høy N-cadherin genekspresjon [20]. Det er imidlertid ikke klare resultater indikerte Twist fremmer spredning av magekreft. Våre funn foreslåtte Twist trolig fremmet magekreft celleproliferasjon, ved hjelp av BrdU innlemmelse analyser. I tillegg ble FoxM1 først identifisert som en ny transcriptional mål av Twist 1.

FoxM1 binder promotorområdene med en preferanse for et konsensus [TAAACA] gjenkjennelsessekvens, men med lavere affinitet enn andre gaffelhodeproteiner [21]. Dens uttrykk er begrenset til prolifererende celler, og ekskludert fra stillestående og terminalt differensierte celler. Den styrer uttrykket av gener som kreves for både G1 /S og G2 /M overgang og er avgjørende for mitotisk oppføring og progresjon, noe som sikrer opprettholdelse av kromosom stabilitet [22,23]. Amplifikasjoner av FoxM1 genet har blitt rapportert i en rekke tumorer så som pankreatisk karsinom, brystkreft og hepatocellulært karsinom [24-27]. I magekreft, er FoxM1 uttrykk også oppregulert og dens inhibering fører til cellulær senescens, som er i det minste delvis, avhengig av p27 kip1 [28,29]. I tillegg til den positive rolle på celleformering, og FoxM1 vist seg å spille roller i andre kreftrelaterte prosesser, for eksempel invasjon og metastase [30]. Dets ekspresjon nivåer korrelerer med dårlig prognose og metastase i forskjellige tumorer inkludert gastrisk karsinom [31], som tyder på muligheten for å bruke FoxM1 som en prognose og /eller diagnose markør. Til sammen er FoxM1 en lovende og attraktivt mål for kreftbehandling. Derfor er det viktig å forstå hvordan FoxM1 reguleres for å utforme bedre terapeutiske tilnærminger.

FoxM1 uttrykk er strengt regulert både på mRNA og protein nivå. Sin overflod øker ved oppføring av S-fase, topper i løpet av G2 og M, og er degradert under mitotisk exit. Tilsvarende er dets transkripsjonen aktivitet strengt regulert i løpet av cellesyklusen ved multisite fosforylering av forskjellige kinaser, og dens motvirkende fosfataser, og nådde sitt maksimum aktivitet i G2-fasen av cellesyklusen [32]. Nylig er det blitt rapportert at FoxM1 ekspresjon kan også bli modulert ved microRNAs. FoxM1 har blitt identifisert som et direkte mål for MIR-134, hvis nivåer inverst korrelert med invasiv potensial på noen NSCLC-celler [33]. Videre er FoxM1 også undertrykt av MIR-370 i magekreftceller [29], noe som tyder på at videre studier er nødvendig for å undersøke om Twist en kunne samarbeide disse regulatoriske veier.

I konklusjonen, vi her viser at Twist en overekspresjon fører til en betydelig oppregulering av FoxM1, som spiller en sentral rolle i cellesyklusprogresjon i magekreftceller. I kontrast, knockdown of Twist en reduserer FoxM1 uttrykk, noe som tyder på at FoxM1 kan være en direkte transcriptional mål av Twist 1. Vi viser videre at Twist en kunne binde seg til arrangøren regionen FoxM1, og deretter rekruttere p300 å indusere FoxM1 mRNA transkripsjon. Derfor våre resultater avdekke et tidligere ukjent Twist 1 /FoxM1 regulatorisk vei, noe som kan bidra til å forstå mekanismene for magekreft spredning.

Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
(AB) mRNA og proteinnivåene av E-cadherin i NCI-N87 (A) og AGS (B) celler transfektert med adenovirus som uttrykker tom vektor (EV) eller vri 1.
doi: 10,1371 /journal.pone .0077625.s001 product: (TIF)
Figur S2. product: (A-B) celle proliferative potensial (BrdU) ble bestemt i NCI-N87 (A) eller AGS (B) celler uten eller med transfeksjon av tom vektor (EV) eller GFP siRNA. (C) Endogene Twist 1 ble bestemt ved western blot i fire mage kreftceller (NCI-N87, AGS, HGC-27 og MGC80-3). Vekstkurven på fire cellelinjer ble målt
doi:. 10,1371 /journal.pone.0077625.s002 plakater (TIF)
Figur S3.

(A-B) mRNA (A) og protein (B) nivåer av FoxM1 i NCI-N87 celler transfektert med siRNA oligos mot NCI-N87 eller negativ kontroll (Ctrl). (C) Celleproliferasjon ble målt ved BrdU forsøk i NCI-N87-celler. Celler ble pre-transfektert med siRNA oligoer i 24 timer og deretter transfektert med tom vektor (EV) eller vri en i ytterligere 24 timer. Product: (D) mRNA-nivåene av p21, p27, cyklin B1, Cyclin D1, D2 og syklin Cyclin E ble bestemt ved real-time PCR i NCI-N87 celler. Celler ble pre-transfektert med siRNA oligonukleotider i 24 timer, og deretter transfektert med tom vektor (EV) eller Twist 1 i ytterligere 24 timer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0077625.s003 plakater (TIF)

• PLoS ONE: c-Met som en prognostisk markør i Gastric Cancer: en systematisk oversikt og meta-Analysis
• PLoS ONE: Dårlig prognose av fosfatase regenerere leveren tre Expression i Gastric Cancer: A Meta-Analysis