PLoS ONE: Twist1 Edistää mahasyövän Cell Proliferation kautta Up-asetus FoxM1

tiivistelmä

Twist liittyvä proteiini 1 (Twist1), joka tunnetaan myös A-luokan perus- helix-loop-helix proteiini 38 (bHLHa38) , on ollut mukana solulinjaan päättäväisyyttä ja erilaistumista. Aiemmat tutkimukset osoittavat, että Twist1 ilmentymistä säädellään ylöspäin mahasyövän huono kliinisiä tuloksia. Lisäksi Twist1 on ehdotettu olevan osallisena etenemistä ihmisen mahasyöpä. Kuitenkin sen biologiset toiminnot säilyvät paljolti hyödyntämättä. Tässä tutkimuksessa, osoitamme, että Twist 1 yli-ilmentyminen johtaa merkittävään säätely ylöspäin FOXM1, jolla on keskeinen rooli solusyklin etenemisen mahalaukun syöpäsoluja. Sen sijaan, pudotus Twist 1 vähentää FOXM1 ilmentymistä, mikä viittaa siihen, että FOXM1 voi olla suora transkription kohteena Twist 1. molekyylitasolla, olemme edelleen osoittavat, että Twist 1 voi sitoutua promoottorialueen FOXM1, ja sen jälkeen rekrytoida p300 indusoimaan FOXM1 mRNA transkriptio. Siksi tuloksemme paljastaa edellinen tuntematon Twist 1 /FOXM1 sääntelyyn reitin, joka voi auttaa ymmärtämään mekanismeja mahasyövän leviämisen.

Citation: Qian J, Luo Y, Gu X, Zhan W, Wang X ( 2013) Twist1 Edistää mahasyövän Cell Proliferation kautta Up-asetus FOXM1. PLoS ONE 8 (10): e77625. doi: 10,1371 /journal.pone.0077625

Editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 31, 2013; Hyväksytty: 03 syyskuu 2013; Julkaistu: 24 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Qian et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet mesenkyymisoluyhteisviljelmissä-siirtymä (EMT) on prosessi, jossa epiteelisolut menettää napaisuus ja solu-soluadheesion ja tehdään dramaattinen remodeling solun tukirangan [1,2]. Samanaikainen menettäminen epiteelisolujen tarttumisen ja solun tukirangan komponentteja, solut meneillään EMT hankkia ilmaus mesenkymaalisten komponenttien ja vaeltava fenotyyppi [2,3].

Useat keskeiset indusoijia EMT ovat transkriptiotekijöitä kuten Twist 1, Etana, ja Slug, joka tukahduttaa E-kadheriinin ilmentymisen [4,5]. Twist1 kuuluu perus helix-loop-helix transkriptiotekijä perhe [6]. Aluksi Twist1 ehdotettiin välttämättömäksi kehittämisessä mesodermistä peräisin kudoksia, mukaan lukien lihas ja osteogeenisen solulinjasta [7,8]. Myöhemmät tutkimukset ovat osoittaneet, että Twist 1 edistää EMT ja sillä on keskeinen merkitys etäpesäkkeiden useissa kasvainmuodoista [9,10]. Expression Twist 1 on myös liitetty edistämisessä etäpesäkkeiden ja invasiivisen patologinen alatyyppejä useita syöpä [11]. Siksi Twist 1 on ehdotettu olevan onkogeenisia ominaisuuksia. Esimerkiksi yliekspressio Twist in rhabdomyosarkooma estää Myc-aiheuttaman apoptoosin ja häiritsee p53 tuumorisuppressiogeeneksi [12]. Ylössäätöä Twist liittyy pahanlaatuisiin T-solulymfooma [13]. Pakko ilmentymisen Twist laukaisee resistenssin ihmisen syöpäsolujen lääkkeitä, jotka estävät mikrotubulusten muodostumista [14].

Kuitenkin vaikutus ja mekanismi Twist geenin leviämisen mahakarsinooman jäävät arvoitukseksi. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että Twist1 Is säädellään ylöspäin mahalaukun syöpään liittyvän fibroblastien huono kliinisiä tuloksia [15]. Sitä paitsi, alas-säätely Twist 1 geeni tukahdutti leviämisen mahalaukun syöpäsolujen negatiivisesti säätelemällä AP-1-aktiivisuuden, jolloin sykliini D1 ilmentyminen vähenee [16]. Tässä työssä, kaksi mahasyövän solulinjoja käytettiin vaikutuksen tutkimiseksi ja mekanismi Twist 1-geenin soluproliferaatioon.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

neljä epiteelin solulinjoja (NCI-N87, AGS, HGC-27 ja MGC80-3) johdettu mahakarsinoo- hankittiin American Type Culture Collection (USA). -Soluja viljeltiin DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco, Beijing). Viljelmiä pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO _2.

Sirna, RNA ja Reaaliaikainen analyysi

Solut ympättiin 6- kuoppalevyillä transfektoitiin sitten 50 nM siRNA oligoilla kohdistaminen ihmisen Twist 1 (Dharmacon, USA). SiRNA-molekyyli, joka on spesifinen vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) käytettiin negatiivisena kontrollina. Yhteensä RNA: t uutettiin soluista TRIzol reagenssilla, ja käänteinen transkriptiot suoritettiin Takara RNA PCR Kit (Takara, Kiina) seuraten valmistajan protokollaa. Jotta määrällisesti selostukset edun geeneistä, reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen SYBR Green Esiseos Ex Taq (Takara, Japani) on Light Cycler 480 (Roche, Sveitsi).

Transient Transfektiot ja Lusiferaasimäärityksiä

Ihmisen FOXM1-promoottori monistettiin ihmisen genomisesta DNA-templaatin ja insertoitiin pGL4.15 perusvektoriin (Promega). Mutant Twist1 sitova motiivi luotiin käyttäen PCR -mutageneesitarvikkeissa (Toyobo) pohjusteella (mutaatio sivustot alleviivattu): 5'-CGCATTACGAATCAGGTTAAGCCAGTT-3 'ja käänteinen komplementti pohjamaali. Kaikki ohimenevä transfektiot suoritettiin Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Shanghai), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sillä lusiferaasireportteri- määritykset, solut ympättiin 24-kuoppalevyille ja transfektoitiin ilmaistuilla plasmideilla. 48 tuntia transfektion jälkeen, lusiferaasin aktiivisuudet mitattiin käyttämällä Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA).

Co-immunosaostus

Solut kerättiin, suspensoitiin uudelleen lyysipuskuriin, joka sisälsi 50 mM Tris- HCl (pH 7,3-7,5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% TRITON X-100) ja proteaasi-inhibiittorit. Lysaatit inkuboitiin 2,5 ug p300 tai IgG yön yli 4 ° C: ssa. Proteiini-A-helmet lisättiin vielä 4 tunnin ajan. Helmet sisältävät immuunikompleksit pestiin 1 ml: lla jääkylmää lyysipuskuria neljä kertaa. Sakat denaturoitiin Laemmli (geelilatauspuskuria) puskurissa 95 ° C: ssa 10 min.

Western Blot

Solut kerättiin trypsiinikäsittelyllä, hajotettiin Laemmli-puskurissa, denaturoitiin kuumentamalla 10 minuuttia 80 ° C, ja päätti SDS /PAGE-geeleillä. Sen jälkeen immunoblottauksella, kalvot estettiin PBS /0,1% Tween-20 7,5% rasvatonta kuivamaitoa, ja primaaristen vasta-aineiden inkuboitiin PBS /0,1% Tween-20 ja 0,1% -5% rasvatonta kuivamaitoa. Vastaan ​​suunnattuja vasta Twist 1, FOXM1 ostettiin Santa Cruz Biotechnology (USA). Anti-p300 ja GAPDH-vasta-aineita saatiin Abcam Company (USA). Anti-p21, p27, sykliini B1, sykliini D1, sykliini D2, sykliini E ja E-kadheriinin vasta-aineet olivat peräisin Cellsignaling (USA).

Kromatiini immunosaostus (ChIP) määritys

Kromatiini immunosaostuksella ( chip) määritys sarjat käytettiin (Upstate, USA). Lyhyesti, solut kiinnitettiin 1% formaldehydiä ja jatkokäsitellään käyttämällä Upstate sirun määrityksessä Kits. Liukoinen kromatiinin immunosaostettiin anti- Twist 1 ja IgG. Puhdistuksen jälkeen DNA-näytteet kvantifioitiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä käyttämällä alukkeita, johon kuuluu proksimaalinen alue ihmisen FOXM1-promoottorin.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. Tilastolliset erot määritettiin kaksisuuntaista t-testiä. Tilastollinen merkitys näkyy * (P < 0,05), ** (P < 0,01) tai *** (P < 0,001).

Tulokset

vaikutus Twist1 on mahasyövän soluproliferaatioon

Ensimmäisessä, tutkia toiminnallista roolia Twist 1 soluproliferaatioon, me transdusoidut NCI-N87 tai AGS solut adenoviruksia, jotka sisältävät Twist 1 tai tyhjän vektorin (kuvio 1A ja 1 B). Yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten ilmaus E-kadheriinin, biomarkkereiden EMT prosessin [4,5], oli alas-säädellä Twist 1 yli-ilmentyminen (kuvio S1A-1B). Sitä paitsi, Twist 1 yli-ilmentyminen johti merkittävään kasvuun solujen määrä kaikkien solujen testattujen (kuvio 1 C ja 1 D). Johdonmukaisesti, bromideoksiuridiinia (BrdU) analyysi vahvisti myös, että Twist 1 yliekspressio edistää solujen lisääntymistä (kuvio 1E ja 1F). Lisäksi Twist 1 yli-ilmentävät solut oli huomattavasti alhaisempi soluja G1 /G0 vaiheen ja lisääntynyt prosenttiosuus solujen S-vaiheeseen verrattuna tyhjällä vektorilla transfektoiduissa soluissa (kuvio 1G-1 H).

Seuraava , NCI-N87 tai AGS-solut transfektoitiin pieniä häiritseviä RNA (siRNA) kohdistaminen Twist 1. siRNA oligo osoitti tehokasta Twist 1 pudotus näiden kahden soluissa, verrattuna GFP siRNA-transdusoidut solut (kuvio 2A-2D). Tämän seurauksena alas-säätely Twist 1 johti huomattavaan vähenemiseen solumäärän ja lisääntymistä näissä soluissa (kuvio 2E-2 H). Lisäksi, hiljentäminen Twist 1 lisäsi merkittävästi solujen prosenttiosuus G0 /G1 vaiheeseen ja vähensi solujen prosenttiosuus, että S-vaiheeseen (kuvio 2 I-2J). Erityisesti vertasimme leviämisen aktiivisuus NCI-N87 ja AGS solujen kanssa tai ilman transfektiota tyhjän vektorin tai GFP siRNA. Tuloksemme viittaavat siihen, että kumpikaan tyhjän vektorin tai GFP siRNA vaikuttaa soluproliferaatioon aktiivisuuden (kuvio S2A). Lisäksi kasvun kyky ilmentävien solujen korkeammat Twist 1 tasot (NCI-N87 ja AGS solut) on suhteellisesti suurempi kuin muut (HGC-27 ja MGC80-3 solut) (kuvio S2C). Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että kierre 1 saattaa olla tärkeä myönteinen sääntely mahasyövän solujen lisääntymisen.

Twist1 vaikuttaa ilmentymistä solun lukiertosäätelijöistä

Twist 1 edistetään solujen lisääntymistä, tutkimme sen toimintoja geenien, jotka säätelevät G1 /S siirtymä, mukaan lukien CDK-inhibiittorit p21 ^{CIP1, p27 Kip1, CDK säädin sykliini B1, sykliini D1, sykliini D2 ja sykliini E. Tulokset alkaen real- PCR ja western blotting-analyysi NCI-N87 solujen ehdotti, että ilmentyminen p21 CIP1, p27 Kip1 olivat vaimentua samalla kun sykliini B1, sykliini D1, sykliini D2 ja sykliini E tasot yläreguloituja Twist 1-transfektoiduissa soluissa, verrattuna tyhjän vektorin-transfektoiduissa soluissa (kuvio 3A-3B). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös AGS solussa (Kuva 3C-3D), joka edelleen varmistaa, että Twist 1 voivat vaikuttaa leviämisen mahalaukun syöpäsoluja. Tasaisen, knockdown Twist 1 lisääntynyt p21 CIP1 ja p27 Kip1 ilme samalla pienentää sykliini B1, sykliini D1, sykliini D2 ja sykliini E ilmaisun NCI-N87 ja AGS soluja (kuvio 4A-4D).}

Twist 1 suoraan kohdistaa transkriptiotekijä FOXM1 mahalaukun syöpäsoluissa

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että useat transkriptiotekijöitä voi säädellä useita geenejä, jotka liittyvät solusyklin, mukaan lukien p21 ^{CIP1, P27 Kip1 ja sykliini B1. Niinpä olemme analysoineet potentiaali transkriptiotekijöitä, jotka osallistuvat solujen jakautumisen. Viidestä testattu transkriptiotekijöitä, vain FOXM1 havaittiin merkittävästi lisääntynyt NCI-N87 solut yli-ilmentävät Twist 1 (kuva 5A-5B). Induktioon FOXM1 havaittiin myös AGS soluissa (kuvio 5C-5D). Lisäksi FOXM1 ilmentyminen väheni näissä solussa köyhdytettyä Twist 1 (kuvio 6A-6D), mikä viittaa siihen, että FOXM1 voisi olla kohde Twist 1.}

Twist 1 ylössäätelee FOXM1 ilmaisun rekrytointi p300

Seuraavaksi keskityttiin molekyylitason mekanismi Twist 1 sääntelyn FOXM1 transkription. Sekvenssin analyysi osoitti, että promoottorialueen ihmisen FOXM1 sisältyvän geenin mahdollisen Twist 1 sitoutumiskohdan (välillä -357 ja -352 bp) (kuvio 7A). Luciferase raportti testi osoitti, että transkriptionaalista aktiivisuutta villityypin FOXM1 promoottori dramaattisesti voimistuvan Twist 1, kun taas transkriptionaalista aktiivisuutta lakkautettiin promoottori joissa on mutaatio Twist 1-sitoutumiskohtia (kuvio 7B). Lisäksi ChIP määritykset osoittivat, että Twist 1 voisi yksilöllisesti sitoutua FOXM1 promoottorin (kuvio 7C). Sen määrittämiseksi, induktion FOXM1 by Twist 1 vaaditaan sen proliferatiivisen vaikutuksen, toteutimme kokeita FOXM1 Knockdown käyttämällä siRNA oligoja NCI-N87 soluissa (kuvio S3A-S3B). Tämän seurauksena, siRNA pelastettiin solujen proliferatiivisen vaikutuksen Twist 1 yli-ilmentymisen (kuvio S3C). Johdonmukaisesti, toiminnot Twist 1 ilmentymistasojen solusyklin säätävät myös päinvastaiseksi FOXM1 siRNA oligojen (kuvio S3D), viittaa siihen, että FOXM1 tarvitaan roolit Twist 1 mahalaukun syöpäsoluja.

Koska transkription tekijä, Twist 1 voi rekrytoida koaktivaattoreiden säätelyssä kohdegeenin ilmentymisen. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että p300 voisi toimia koaktivaattorikompleksien monille transkriptiotekijöitä. Meillä on siis tutkittava, onko p300 voisi olla koaktivaattorikompleksien Twist 1 säätelyyn FOXM1 ilmaisua. Kuten kuviossa 7D, Twist 1 voisi vuorovaikutuksessa p300 mukaan coimmunoprecipitation. Transkriptionaalista aktiivisuutta FOXM1 promoottorin edelleen voimistuvan kotransfektoimalla p300 ja Twist 1 (kuvio 7E). Lisäksi olemme edelleen lakkautetaan p300 ilmaisua käyttäen siRNA oligoja NCI-N87 soluissa (kuvio 7F). Kuten odotettua, Twist 1 aiheuttama FOXM1 ilmentyminen oli merkitsevästi tylppäpäiseksi hiljaisuus p300 (kuva 7G-7H). Yllä olevat tiedot osoittivat, että Twist 1 voimistunut FOXM1 niilmentymisen rekrytointi transkription koaktivaattorikompleksien komplekseja, kuten p300.

Keskustelu

Nykyisessä tutkimuksessa tuloksemme tarkoita Twist 1 kriittisenä säätelijänä mahalaukun syövän etenemisessä. Tämä on ehdottanut useita rivejä todisteita. Ensinnäkin Twist 1 yliekspressio edistää samalla sen puute estää soluproliferaatiota mikä näkyy BrdU ja solusyklin analyysi. Toinen, Twist 1 vaikuttaa geenien ilmentyminen solukierron modulaattorit, mukaan lukien CDK-inhibiittorit p21Cip1, p27Kip1, CDK-säädin sykliini B1, sykliini D1, sykliini D2 ja sykliini-E Kolmanneksi, Twist 1 suoraan ylössäätelee FOXM1 ilmentymisen transkriptionaalisella tasolla, kautta rekrytointi P300. Lisäksi, pudotus endogeenisen FOXM1 ilmentymisen vaimentaa proliferatiivista vaikutusta Twist 1, mikä viittaa siihen, että FOXM1 on välttämätöntä roolit Twist 1 mahalaukun syöpäsoluja.

Aikuisille Twist 1 ilmentyy pääasiassa esiastesolujen lukien osteoblastic, myogenic, odontoblastic ja myelomono- suvusta, säilyttäen eriytymättömiä tilassa [17]. Sitä paitsi, Twist1 on myös tärkeä säätelijä monien muiden biologisten prosessien, kuten mesenkymaalisten kehittäminen ja ruskea rasva-aineenvaihduntaa. Esimerkiksi Twist1 uskotaan estävän osteoblastien erilaistumista negatiivisesti säätelemällä Runx2 [17]. Sitä paitsi, Twist-1 ilmentyy selektiivisesti rasvakudoksessa, vuorovaikutuksessa PGC-1α, tukahduttaa mitokondrioiden aineenvaihduntaa ja irrotus. Tämän seurauksena, siirtogeenisiä hiiriä, jotka yli-ilmentävät Twist-1 rasvakudoksesta ovat alttiita runsasrasvaisen-ruokavalion aiheuttama lihavuus, kun taas sen heterotsygoottinen hiirten ovat lihavuus resistenttejä [18]. Lisäksi Twist 1 ydinvoiman ilmentyminen havaittiin myös muita kuin noncancerous epiteelin, mikä viittaa siihen, että Twist 1 voi olla fysiologinen rooli normaaleissa soluissa [19]. Myöhemmät tutkimukset osoittavat, että Twist 1 ilmentyminen korreloi voimakas invasiivisuus sekä huonon ennusteen epiteelin syöpää. Mahasyövän, tuoreessa raportissa on esitetty yliekspressio Twist 1-geeni on useammin löytyy diffuusi-tyypin karsinooma kudoksista korkealla N-kadheriinin geenin ilmentymistä [20]. Kuitenkaan mitään lopullisia tuloksia ovat osoittaneet Twist edistää leviämisen mahasyövän. Meidän päätelmissään Twist luultavasti edistänyt mahasyövässä solujen lisääntymistä, käyttämällä BrdU määrityksissä. Lisäksi FOXM1 oli ensiksi tunnistettiin uutena transkription kohteena Twist 1.

FOXM1 sitoutuu promoottori alueille suosivat konsensus [TAAACA] tunnistussekvenssiin, vaikkakin pienemmällä affiniteetilla kuin muut forkhead proteiinit [21]. Sen ilmentyminen rajoittuu lisääntyvien solujen, ja ulkopuolelle lepotilassa ja lopullisesti erilaistuneita soluja. Se säätelee geenien ilmentymistä tarvitaan sekä G1 /S ja G2 /M siirtyminen ja on välttämätöntä mitoosi tulon ja etenemisen, ylläpidosta kromosomi vakautta [22,23]. Amplifikaatioita FOXM1 geeni on raportoitu lukuisissa kasvaimissa, kuten haiman karsinoomat, rintasyöpä ja maksasyövän [24-27]. Mahasyövän, FOXM1 ilme on myös säädelty ja sen esto johtaa solun vanhenemista, joka on ainakin osittain riippuvainen p27 kip1 [28,29]. Sen lisäksi myönteistä roolia soluproliferaatioon, FOXM1 on osoitettu rooleja muissa syöpään liittyvissä prosesseissa, kuten invaasio ja etäpesäkkeiden [30]. Sen ilmentymistasot korreloivat huonon ennusteen ja etäpesäkkeiden eri kasvaimissa, mukaan lukien mahasyöpä [31], mikä viittaa siihen, mahdollisuus käyttää FOXM1 kuin ennusteen ja /tai diagnoosissa merkki. Yhdessä FOXM1 on lupaava ja houkutteleva kohde syövän hoidossa. Siksi on tärkeää ymmärtää, miten FOXM1 säädellään pystyäkseen suunnittelemaan paremmin hoitomenetelmät.

FOXM1 ilmentyminen on tarkoin säädeltyä sekä mRNA- ja proteiini tasoilla. Sen runsaus kasvaa tulo S-vaiheen huippuja G2-M ja hajoaa aikana mitoottisiin exit. Samoin sen transkriptionaalinen aktiivisuus on tarkoin säädeltyä koko solusyklin mukaan multisite fosforylaatiota eri kinaasien, ja sen torjumaan fosfataasit, saavuttaen suurin aktiivisuus G2 vaiheessa solusyklin [32]. Viime aikoina on raportoitu, että FOXM1 ilmentyminen voidaan myös moduloida MikroRNA. FOXM1 on tunnistettu välittömänä kohteena miR-134, jonka tasot ovat kääntäen korreloi invasiivisen käyttöönsä noin NSCLC-solujen [33]. Lisäksi FOXM1 myös tukahduttaa miR-370 mahalaukun syöpäsoluissa [29], mikä viittaa siihen, että tarvitaan lisätutkimuksia tutkia Twist 1 tehdä yhteistyötä näiden säätelyreittejä.

Yhteenvetona olemme täällä osoittaa, että Twist 1 yli-ilmentyminen johtaa merkittävään säätely ylöspäin FOXM1, jolla on keskeinen rooli solusyklin etenemisen mahalaukun syöpäsoluja. Sen sijaan, pudotus Twist 1 vähentää FOXM1 ilmentymistä, mikä viittaa siihen, että FOXM1 voi olla suora transkription kohteena Twist 1. Olemme lisäksi ilmi, että Twist 1 voi sitoutua promoottorialueen FOXM1, ja sen jälkeen rekrytoida p300 aiheuttaa FOXM1: mRNA: n transkription. Siksi tuloksemme paljastaa edellinen tuntematon Twist 1 /FOXM1 sääntelyyn reitin, joka voi auttaa ymmärtämään mekanismeja mahasyövän leviämisen.

tukeminen Information
Kuva S1.
(AB) mRNA: ta ja proteiinia tasoa E-kadheriinin NCI-N87 (A) ja AGS (B), jotka on transfektoitu adenovirukset ilmentävät tyhjän vektorin (EV), tai Twist 1.
doi: 10,1371 /journal.pone .0077625.s001
(TIF) B Kuva S2.
(A-B) Solujen proliferaatiopotentiaali (BrdU) määritettiin NCI-N87 (A) tai AGS soluissa (B) kanssa tai ilman transfektiota tyhjällä vektorilla (EV) tai GFP siRNA. (C) Endogeeninen Twist 1 ilmentyminen määritettiin western blot neljässä mahasyövässä soluja (NCI-N87, AGS, HGC-27 ja MGC80-3). Kasvukäyrän neljä solulinjojen mitattiin.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0077625.s002
(TIF)
Kuva S3.

(A-B) mRNA: n (A) ja proteiini (B) tasot FOXM1 NCI-N87-solut transfektoitiin siRNA oligojen vastaan ​​NCI-N87 tai negatiivinen kontrolli (Ctrl). (C) Solujen lisääntyminen aktiivisuus mitattiin BrdU määrityksissä NCI-N87-soluissa. Solut esi-transfektoitiin siRNA oligoilla 24 tunnin ajan ja sitten transfektoitiin tyhjällä vektorilla (EV) tai Twist 1 vielä 24 tuntia.
(D) mRNA-tasot p21, p27, sykliini B1, sykliini D1, sykliini-D2 ja sykliini E määritettiin reaaliaikaisella PCR NCI-N87 soluissa. Solut esi-transfektoitiin siRNA oligoilla 24 tuntia, ja sitten transfektoitiin tyhjällä vektorilla (EV) tai Twist 1 vielä 24 tuntia.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0077625.s003
(TIF)

• PLoS ONE: c-Met kuin Prognostiset Marker mahasyövän: järjestelmällinen katsaus ja meta-analyysi
• PLoS ONE: Huono prognoosi fosfataasin of Uudistava Maksan 3 Expression mahasyövän: Meta-analyysi