PLOS ONE: A inibição da JAK2 /STAT3 Pathway reduz o crescimento Câncer Gástrico In Vitro e In Vivo

Abstract

sinal do transdutor e ativador de transcrição-3 (STAT3) é constitutivamente ativada em vários tipos de câncer, onde promove o crescimento, inflamação, angiogênese e inibe a apoptose. Nós mostramos que STAT3 é constitutivamente ativada no câncer gástrico humano, e que a atividade transcricional STAT3 IL-11-driven crónica induz tumorigénese gástrico no gp130 ^{mouse modelo 757FF de desenvolvimento de câncer gástrico. Aqui, mostramos que o tratamento de células humanas gástricas cancerosas AGS com a Quinase Janus (JAK) WP1066 inibidor da dose e dependente do tempo inibe a fosforilação do STAT3, em conjunto com a fosforilação JAK2 reduzida, proliferação e aumento da apoptose reduzida. Além disso, a aplicação de WP1066 intraperitoneal durante 2 semanas, reduzir o volume do tumor gástrico em 50% na gp130 757FF coincidente rato com reduzida JAK2 e activação da STAT3 em comparação com controlos da mesma ninhada, tratados com veículo. tumores gástricos de ratinhos tratados WP1066- tinha reduzido inflamação polimorfonucleares, coincidente com a inibição de várias citocinas pró-inflamatórias, incluindo a IL-11, IL-6 e IL-1β, bem como factores de crescimento Reg1 e anfirregulina. Estes resultados mostram que WP1066 pode bloquear a proliferação, reduzir a inflamação e induzir a apoptose em células de tumor gástrico por inibição da fosforilação de STAT3, e que muitas citoquinas e factores de crescimento que promovem o crescimento do tumor gástrico são regulados por mecanismos dependentes de STAT3. WP1066 podem formar a base para futuras terapias contra o câncer gástrico}

Citation:. Judd LM, Menheniott TR, Ling H, Jackson CB, Howlett M, Kalantzis A, et al. (2014) A inibição da JAK2 /STAT3 Pathway reduz o crescimento Câncer Gástrico In Vitro
e In Vivo
. PLoS ONE 9 (5): e95993. doi: 10.1371 /journal.pone.0095993

editor: Rupesh Chaturvedi, da Escola de Medicina da Universidade de Vanderbilt, Estados Unidos da América

Recebido: 21 Janeiro, 2014; Aceito: 01 de abril de 2014; Publicado em: 07 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Judd et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi apoiado por fundos de; NHMRC Austrália projeto (www.nhmrc.gov.au) concederǽ165 NIH /NCI EUA (nih.gov; www.cancer.gov) melanoma SPORE P50 CA093459-06, NIH /NCI EUA (nih.gov; www.cancer. gov) SPORE cérebro 2 P50 CA127001-06. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Waldemar Priebe detêm patentes e tem um interesse financeiro no desenvolvimento do composto WP1066 como se segue; W.Priebe, N.Donato, M.Talpaz, S, Szymanski, I. Fokt, A. Levitzki compostos para o tratamento de doenças proliferativas celulares. Une States Patent WO /2005/058829 12/01/2004. Note também que os autores forneceram uma declaração alterada de interesses concorrentes em relação a uma patente sobre WP1066 realizada por W. Priebe. Os autores também declarar que "isso não altera a nossa adesão a PLOS ONE políticas em dados e materiais de partilha".

Introdução

Dos sete sinal do transdutor e ativador de transcrição (STAT) membros da família , STAT3 foi mais consistentemente implicadas numa variedade de cancros comuns no ser humano, incluindo; pulmão, da mama, do ovário, da próstata, do cólon e [1], [2], [3], [4]. Isto também é verdadeiro no cancro gástrico humano [5], [6], [7] em que a STAT3 activação por fosforilação crónica em tirosina (Y) residem 705 tem sido associada ao aumento do crescimento, angiogénese, invasão e metástase do cancro primário [ ,,,0],6], [7], [8]. Assim, a inibição da actividade de transcrição STAT3 no cancro gástrico humano pode fornecer um meio possível de reduzir a elevada morbidade e prolongar a vida entre os pacientes com câncer gástrico em todo o mundo.

Na ausência de mutações funcionais no gene STAT3, atividade STAT3 aberrante é induzido pela actividade persistente de tirosina-quinases a montante, e /ou por unscheduled- ou sobre-expressão de ligandos estimuladores [9], [10], [11]. Isto é claramente exemplificada na gp130 ^{757F /F modelo de murganho de desenvolvimento de cancro gástrico, em que uma Fen por substituição de Tyr na posição 757 no braço intracelular da gp130 do receptor de sinalização da família de IL-6 evita simultaneamente SHP2 e SOCS3 obrigatório , resultando na inibição da /MAP quinase transdução de sinal ras, e hiperactivação da STAT3 por fosforilação constitutiva [23], [24], [26]. Recentemente, e outros mostraram que, em tumores gástricos, aumentos significativos na transcrição coincidir com o aumento da expressão do ligando de gp130 IL-11 em modelos de cancro gástrico humano e de ratinho desta doença [5], [12], [13]. Neste último IL-6 é dispensável, mas a IL-11 é absolutamente necessária para a tumorigénese [12], [13]. Além disso, IL-11 /STAT3 demonstrou ser um importante motor de gastrite atrófica, a primeira lesão pré-cancerosa do estômago após a infecção crônica pela bactéria Helicobacter pylori
[14].}

até à data, numerosos cinases têm sido relatado para induzir a actividade da STAT3 a seguir à ligação ligando /receptor, no entanto, apenas JAK1 e conta JAK2 para STAT3 fosforilação mediante encaixe com IL-11 /receptor de gp130 complexo [15] e de estes de IL-11 /gp130 liga-se preferencialmente JAK2 [16]. Estas observações sugerem que os presentes alvos promissores JAK2 e STAT3 para a concepção de antagonistas terapêuticos para suprimir a IL-11 /STAT3 sinalização no cancro gástrico humano.

Recentemente, o ácido cafeico derivado WP1066, estruturalmente relacionados com o inibidor de tirosina quinase de baixa potência AG490 , foi mostrado como sendo um inibidor altamente potente da via JAK2 /STAT3 no glioma transformado cérebro [17] e do carcinoma renal [18] linhas celulares, conduzindo à inibição do crescimento e indução das vias pró-apoptóticos clássicos. Além disso, é eficaz WP1066 In vivo
contra melanomas malignos e leucemias altamente que são positivas para a mutação JAK2 V617F-+, que promove a activação constitutiva de JAK2 quinase [19], [20], [21], [22 ]. Estudos não publicados indicam que WP1066 não é um inibidor de ATP-competitivo, e pode bloquear a expressão de JAK2 e STAT3 fosforilado; Além disso, a p-STAT3-Y705 pode ser inibida independentemente do estatuto de JAK2. Assim, WP1066 apresenta uma oportunidade única para inibir tanto p-JAK e p-STAT3, e, posteriormente, potencialmente bloquear JAK2 /via de sinalização STAT3 e atividade transcricional STAT3.

Para testar a ideia de bloqueio duplo de JAK2 e ativação STAT3 no estômago e posterior desenvolvimento de câncer gástrico, temos usado tanto in vitro
e in vivo
abordagens para avaliar se WP1066 pode retardar ou bloquear o crescimento do tumor gástrico através da inibição da atividade /STAT3 JAK2, e outras vias de sinalização oncogênicas intimamente relacionados. Aqui mostramos que WP1066 inibe eficazmente a fosforilação de STAT3, e induz apoptose numa linha celular de cancro gástrico, e que pode inibir o crescimento do tumor gástrico In vivo
bloqueando a indução de genes chave regulados por STAT3.

Materiais e Métodos

Preparação e Armazenagem de Kinase Inibidores

Inhibitor WP1066 foi desenvolvido e sintetizado por Waldemar Priebe e colaboradores da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, e estoque atual foi fornecido cortesia de Houston Pharmaceuticals Inc, Houston, Texas, EUA. Os estoques foram ressuspensas em Hybri-Max DMSO e armazenado a -20 ° C. Stocks foram uso único, e não voltar a congelar após a descongelação.

In vitro Cultura

células AGS (ATCC, Manassas VA, EUA) células foram mantidas em meio completo contendo RPMI + Glutamax ( Gibco Invitrogen Life Sciences, OR, EUA) meio suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina 50 UI a 37 ° C em 5% de CO ar _2-95%.

Western Blotting

os extractos de proteína foram preparados com qualquer TRIzol reagente (Life Technologies, Vic, Austrália) de acordo com as instruções do fabricante e as peletes de proteína foram ressuspensas em sulfato de dodecilo e sódio a 1% contendo 2 mmol /l de na _{3VO 4 ou RIPA amortecedor. -Se alíquotas (30 ug) foram sujeitas a electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio /sulfato de poliacrilamida. As membranas foram bloqueadas e incubou-se a 4 ° C durante a noite em leite desnatado com os anticorpos seguintes; STAT3, Pi (705) STAT3, ERK1 /2, PT (202), Y (204) ERK1 /2, AKT, PS (473) AKT, JAK2, Pi (1007), Y (1008) JAK2 (sinalização celular,Α2, 9134S #,Α1,Ύ2,Ƶ7,Ο2,ƕ8,ŷ2,ŷ1,ł9,Ź1), GAPDH (Abcamδ5). As membranas foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com peróxido (Dako, policlonal suína anti-coelho, conjugado com HRP, # P0399) e visualizados por quimioluminescência aumentada (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). Para a análise de bandas foram quantificados usando o sistema software Quantity One (Biorad) e as proteínas fosforiladas expressos como uma percentagem de GAPDH a partir de uma membrana duplicada. Pelo menos n = 8 amostras foram avaliadas por um ou outro tratamento.}

Contagem celular por Haemocytometry

As células foram semeadas a 5 × 10 ^{4 células /ml em formato de 24 poços em meio completo e deixou-se crescer em repouso durante 24 horas. As células foram tratadas com a concentração apropriada de WP1066 ou DMSO como controlo para 0-360 min. Após tratamento as células foram desalojadas por tratamento com tripsina-EDTA a 0,25% (Sigma), coradas com azul de tripano-0,4% (Sigma) a uma diluição 1:01 durante 5 minutos a 4 ° C, e contadas num hemocitómetro.}

diacetato de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) coloração

Para marcar células AGS com CFSE, as células foram desalojadas por tratamento com tripsina-EDTA a 0,25% (Sigma) e novamente suspensas em PBS pré-aquecido /0,1% de BSA a uma densidade de 1 × 10 ^{6 células /ml. 10 mM de corante CFSE (Invitrogen) foi preparado de acordo com o protocolo do fabricante, em seguida, 5 ul /ml foi adicionado e muito bem misturados por inversão de assegurar a rotulagem homogénea de células. As amostras foram incubadas a 37 ° C durante 10 minutos, extinguiu-se por adição de 5 volumes de meio arrefecido com gelo e incubou-se durante 5 minutos em gelo. As amostras foram então lavadas 5 vezes em meio e colocadas em placas a 2 x 10 5 células /poço (placas de 6 poços). Uma amostra de células foi feita após o plaqueamento e marcadas com 100 ug /mL de iodeto de propídio (PI) e analisadas por citometria de fluxo para a uniformidade e intensidade de etiquetagem. As células foram então cultivadas em meio completo durante 48 horas após o que foram tratadas com ou sem WP1066 apropriado (5 uM) a 37 ° C com 5% de CO _{2 95% de ar durante 18 horas. As células foram então tripsinizadas como acima e ressuspensos em meio completo, marcado com 100 ug /ml de PI, e analisadas por citometria de fluxo a 488 nM. Os dados foram gravados utilizando a diva BD FACS (BD Biosiences) Pacote de software e analisados ​​pelo pacote de software Modfit LT (VSH).}}

células AGS anexina V coloração
foram cultivadas em meio completo a 2 × 10 ^{5 células /poço em placas de 6 poços com DMSO (controlo portadora), ou WP1066 (5 uM), ou etoposido (200 uM; de controlo positiva) a 37 ° C com 5% de CO _{2 95% ar em repouso por 24 horas. As células foram, então, tratadas como se segue; lavou-se em PBS arrefecido em gelo, tripsinizadas como acima, e a densidade celular determinada por haemocytometry antes de ressuspensão em tampão de ligação a Anexina para 1 × 10 6 células /ml. 100 ul desta preparação foi feita, e incubados com 5 ul de Componente A (Anexina Fluor 488 componente de anexina V, HEPES 25 mM, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, 0,1% de albumina de soro bovino) e 1 ug /ml de PI durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. As amostras foram depois misturadas com 400 ul de tampão de ligação de anexina e analisadas por citometria de fluxo. controles apropriados +/- componentes da reacção foram preparados para ajustar o viés em gating. Os dados foram gravados utilizando a diva BD FACS (BD Biosiences) pacote de software.}}

Ética Declaração

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o Código australiano para o cuidado e uso de animais para fins científicos (7 ^{th edição), e após aprovação do Comitê de Murdoch Childrens Research Institute animal Ética (aplicação # A583). Todos os esforços foram feitos para minimizar o desconforto nestes procedimentos minimamente invasivos.}

In vivo
Experimentos

gp130 ^{camundongos 757F /F foram previamente descritos [23]. Resumidamente, os tumores discretos antrais desenvolver por 4 semanas de idade e crescer rapidamente até cerca de 12 semanas. Eles recapitular as características de desenvolvimento de adenocarcinoma gástrico do tipo intestinal, incluindo invasão submucosa mas não metastizar [24]. Os animais foram alojados em uma instalação SPF do Instituto de Pesquisa Infantil de Murdoch e confirmado para ser livre de Helicobacter pylori
. Três grupos de ratinhos foram avaliadas para o desenvolvimento do tumor: 1) 8 semanas de idade gp130 ratinhos 757F /F que não receberam tratamento (n = 10); 2) gp130 camundongos 757F /F que receberam WP1066 de 8 a 10 semanas de idade (n = 10); e 3) a gp130 ratinhos 757F /F que receberam veículo de DMSO a partir de 8 a 10 semanas de idade (n = 8). Antes da experiência todos os animais foram avaliados para o bem-estar, pesados ​​e volumes de tratamento calculada em conformidade. Os animais de controlo receberam volumes equivalentes de veículo de DMSO para os animais tratados com WP1066. Os ratinhos receberam 2 injecções iniciais intra-peritoneal de WP1066 a 10 mg /kg a cada 48 horas para se aclimatar-los para os efeitos do tratamento, em seguida recebido 5 injecções de WP1066 a 20 mg /kg a cada 48 h para completar o regime de duas semanas. locais de injecção intra-peritoneal foram alternados por meio de quatro quadrantes do abdómen de ratinhos. Na conclusão do experimento, os ratos foram sacrificados, e estômagos ressecados para a fotografia e tecido coleção.}

macroscópicas e histológicas Avaliação

Os estômagos foram rapidamente dissecados ao longo da curvatura menor, preso para fora, fotografado e fixado em paraformaldeído a 4% tamponada antes de processar. As secções de parafina (4 um) foram marcadas com hematoxilina e eosina (H & E). A análise morfométrica foi realizada utilizando software ImageJ open-source (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). Para medições de área, imagens da mucosa gástrica foram delineadas manualmente com a ferramenta de desenho de software eo programa de quantificação utilizada para gerar medições

In vivo
Imunohistoquímica &.; Quantificação

A análise imunohistoquímica foi realizada com anticorpos para Ki-67 (PharmingenȦ609) e ativado caspase 3 (Cell Sinalização TecnologiaϤ1). A recuperação de antígenos foi realizada por secções em ebulição durante 30 minutos em ácido cítrico a 10 mM (pH 6,0). A coloração foi completado com anticorpos apropriados específicas de espécies, secundário biotinilado (Dako, Dinamarca), avidina e de peroxidase de rábano biotinilada complexo macromolecular (Vector Laboratories, Burlingame, CA), 3,3'-diaminobenzidina (Sigma, St Louis, MI) e contrastadas com hematoxilina. Para o Ki-67 de quantificação, um observador cego contado o número de células coradas por glândula em várias secções por animal usando ImageJ como antes. Os dados foram expressos como o número Ki-67 células positivas por glândula. Para activado quantificação da caspase 3, um observador cego contado o número de células coradas por área da mucosa em 4 áreas aleatórias de bem orientada antro por animal usando ImageJ como antes. Os dados foram expressos como o número activado caspase 3 células positivas por área de mucosa

Semi-quantitativa análises morfométricas de Inflamação

A inflamação foi avaliada por microscopia de forma cega em H &. E-manchado Seções. tecidos tumorais antrais foram analisados ​​e um mínimo de 3 tiras por animal (n = 7) receberam a pontuação semi-quantitativo de acordo com o grau de células inflamatórias do mínimo para máximo = 0 = 3. linfoplasmocitária e infiltrado polimorfonucleares foram avaliados independentemente. Os valores médios foram então comparados para análise estatística.

Real-Time Analysis (Q)-PCR

RNA foi extraído com TRIzol reagente (Life Technologies, Vic, Austrália) de acordo com as instruções do fabricante. O ARN total (3 ug) foi transcrito de modo reverso em cDNA usando reversa Moloney vírus da leucemia murina de transcriptase (Promega, Madison, WI) sensibilizados com 0,3 ug de oligo (dT). iniciadores de Q-PCR foram desenhados utilizando o iniciador EXPRESS (Applied Biosystems) (Tabela 1). SYBR química verde (Applied Biosystems) foi utilizado com L32 como normalizador. As condições de PCR foram 95 ° C durante 10 min, depois 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 15 seg; as reacções foram corridas num aparelho Applied Biosystems AB7500 RT PCR. Os resultados foram analisados ​​usando o software detector de sequência, e as diferenças de dobragem relativas foram determinadas utilizando o método ΔΔCt como descrito pelo fabricante.

Análise estatística

Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média . Os valores obtidos a partir da análise quantitativa da expressão do gene ou o número de células coradas foi comparado entre as amostras por análise de variância, e onde foi encontrada uma diferença estatisticamente significativa grupos individuais foram ainda analisados ​​com a estatística paramétrica ou não-paramétrica apropriada utilizando o pacote estatístico Sigmastat. A significância estatística foi definida como p ≤ 0,05.

Resultados

WP1066 Suprime rapidamente fosforilada Y (705) STAT3 e induz a fosforilação de ERK1 /2 em células AGS

O JAK- STAT via e a via de ERK1 /2 são os dois principais vias de transdução de sinal a jusante de gp130. Estes dois percursos têm efeitos reguladores recíprocas e inverso sobre o outro, melhor demonstrada pela regulação negativa da pSTAT3 depois ERK1 2 activação /[47].

WP1066 experiências de resposta à dose foram realizadas por tratamento das células com 0 AGS , 1, 2 ou 5 uM WP1066 durante 60 minutos e medir a fosforilação de JAK2, STAT3, ERK1 /2 e SHP-2. Como esperado, pJAK2 foi fortemente inibida por WP1066 em todas as concentrações testadas e em > 80% no 5 ^ M. 5 uM WP1066 também deu inibição máxima de pSTAT3 e activação recíproca de pErk1 /2 (Fig. 1A), com uma redução na STAT3 total a 5 uM, concentrações mais elevadas ou (dados não mostrados). Coincidente com o aumento em pERK, activação pSHP2 foi aumentada dependentemente da dose após a administração WP1066 (Fig. 1A).

Para estudos de tempo-curso, células AGS foram tratados durante 5 min com 0-360 uM WP1066 e fosforilação de JAK2, STAT3, ERK1 /2 e SHP-2 foram analisados ​​por Western blot (Fig. 1B). WP1066 tratamento resultou numa rápida inibição da pJAK2, com uma queda de 75% por 30 minutos e um máximo de queda de 90% em 60 min. Posteriormente, as células recuperado e devolvido à fosforilação basal JAK2 por 360 min. O padrão de diminuição da ativação STAT3 espelhou a de JAK2 fosforilação. Em contraste, a ERK1 /2 foi marcadamente aumentada a fosforilação em resposta ao tratamento WP1066, com um aumento de 250% por 15 min, e um aumento máximo de 460% em 60 min, antes de voltar para os níveis basais de 360 ​​min. activação SHP2 seguido de perto mudanças na expressão de ERK a indução máxima em 60 min.

WP1066 Inibe a AGS Crescimento através da supressão da proliferação e indução de apoptose

STAT3 ativado é um driver estabelecida de células de câncer gástrico humano crescimento e proliferação [5], e prolongada de activação de ERK1 /2 induz apoptose de células epiteliais gástricas [25]. Tendo demonstrado que WP1066 regula STAT3 e ERK1 sinalização /2 de forma recíproca, testamos se ele também pode perturbar o crescimento celular e induzir a apoptose de células AGS.

O tratamento de células AGS com 5 mM WP1066 (Fig. 2A ) resultou numa redução substancial no número de células em relação ao controlo DMSO (DMSO; 100% ± 3,14 vs WP1066; 36,02 ± 3,18%, p < 0,05). Para determinar se esta redução no número de células foi alterada devido à proliferação celular ou apoptose, ou uma combinação de ambos, CFSE e anexina V coloração foi realizada em células tratadas. células tratadas com AGS WP1066 foram mais intensamente marcadas com CFSE do que os tratados com DMSO, evidências de redução do número de divisões celulares e, portanto, a proliferação (Fig. 2B). Além disso, uma maior proporção de células AGS tratados com WP1066 foram marcadas com Anexina V (Figura 2C) em comparação com as células tratadas com DMSO, o que demonstra que o WP1066 também induziu apoptose em células de AGS (WP1066; 1,3 vezes de aumento, p = 0,049).

WP1066 Blocos gástrico crescimento do tumor em gp130 ^{757FF Mice pela supressão de tumor proliferação celular e Aperfeiçoamento da apoptose}

gp130 ^{camundongos 757FF desenvolver tumores de estômago distal caracterizadas por IL-11 gástrico elevada activação conduzido STAT3 [12], [13]. Desde pJAK2 e p-STAT3 estão bloqueadas por WP1066 in vitro
, nós testamos se WP1066 também iria bloquear o desenvolvimento do tumor gástrico in vivo
. Tratamento de gp130 757FF ratos 3 vezes por semana, durante 2 semanas com /kg WP1066 crescimento do tumor gástrico significativamente reduzida de 10-20 mg por 47% de 42,11 ± 3,21 milímetros 2 a 22,36 ± 3,64 milímetros 2 ( p. < 0,05) (Fig 3A-D). DMSO tumores tratados não eram diferentes de tumores observados em ratos com 8 semanas, a idade em que o tratamento WP1066 começou, confirmando que o crescimento do tumor gástrico é relativamente estável de 8-10 semanas [27], e que o tratamento WP1066 realmente provoca a regressão do tumor, em vez de estase (Fig. 3A-D).}

Para determinar se a proliferação foi alterada em tumores gástricos, Ki-67 de células positivas /glândula foram quantificados na coorte tratada. tratamento WP1066 reduziu significativamente a proliferação de células epiteliais gástricas (DMSO 62 ± 7.7 vs WP1066 41,6 ± 6,5 Ki-67 de células marcadas /glândula, p < 0,05; Fig. 3E-G) demonstrando que WP1066 pode inibir o crescimento do tumor por inibição da proliferação de células. Para avaliar os efeitos de WP1066 na apoptose de células de tumor, as secções do WP1066 ou coortes tratados com DMSO foram coradas com um anticorpo contra a caspase 3 clivada, um marcador da morte celular por apoptose (Fig. 3H, eu). Havia perfis significativamente mais apoptóticas em tumores tratados com WP1066 do que os controlos, o que demonstra um efeito pró-apoptótico clara de WP1066 (WP1066 25,25 ± 5,32 vs DMSO 2,65 ± 0,76 células coradas /mm ^{2 mucosa, p < 0,05; Fig. 3J ).}

WP1066 visa especificamente JAK2 e STAT3 fosforilação suprimir gástrica tumorigénese em gp130 ^{ratos 757FF}

Porque gp130 ^{camundongos 757FF desenvolver tumores em resposta à ativação gp130 constitutiva [20] , testámos se WP1066 suprimida vias de sinalização a jusante in vivo.
WP1066 tratamento durante 2 semanas, resultou numa diminuição de 25% na quantidade relativa de STAT3 total na mucosa antral em comparação com grupos tratados com DMSO (Fig. 4A) . A quantidade de total de JAK2, AKT e ERK1 /2 não foi alterada por tratamento WP1066. Isto sugere que o tratamento crônico da gp130 camundongos 757FF com WP1066 suprime a expressão de STAT3.}

A análise de imunotransferência de sinalizar a ativação demonstrou uma redução significativa na pJAK2 (80,12% ± 5,70 de controle de DMSO), pY705 STAT3 (26,84 % ± 7,2 do controlo de DMSO; A Fig. 4B) e pErk1 /2 (72,66% de controlo ± 5.23.of DMSO; A Fig. 4B). AKT fosforilação não foi alterada por tratamento WP1066. activação reduzida de JAK2 e STAT3 é consistente com o in vitro
dados e acções conhecidas da WP1066.

WP1066 suprimiu a resposta inflamatória no Antral Mucosa de gp130 ^{757FF Mice}

uma vez que uma resposta inflamatória crónica do estômago é crucial para o desenvolvimento do tumor [27], testámos se parte do modo de acção do WP1066 é para suprimir a resposta inflamatória mediada por STAT3, que, normalmente, contribui para a progressão tumoral. A análise histológica revelou que a infiltração de polimorfonucleares no antro de ratinhos tratados WP1066 foi significativamente menor do que nos ratinhos de controlo (Figura 5A;. DMSO 2,45 ± 0,24 vs WP1066 1,46 ± 0,22, p < 0,05), enquanto infiltrado linfoplasmocitária não foi diferente entre os dois grupos (Fig. 5B; DMSO 1,73 ± 0,16 vs WP1066 1,32 ± 0,20, P > 0,05).

uma vez que a inflamação gástrica é tipicamente mediado por um pequeno número de citocinas e enzimas pro-inflamatórias chave, medimos a expressão de um grupo seleto deles por Q-PCR em DMSO e estômagos-WP1066. A expressão de todos os mediadores pró-inflamatórios, com a excepção de IFNy, TNFa e iNOS foram significativamente inibido por tratamento WP1066 como se segue; IL-6 (Fig. 5C; 6,0 ± 2,6 vezes), IL-11 (Figura 5D;. 8,7 ± 3,4 vezes), IL-1α (Figura 5E;. 10,9 ± 4,3) vezes), IL-1β (Figura 5F.; 3 ± 0,9 vezes) e da COX2 (Figura 5G;. 2,94 ± 1,05). Por conseguinte, a inibição da actividade de STAT3 WP1066 e a progressão do tumor foi devida em parte à infiltração polymophonuclear reduzida e diminuição da transcrição dependente de STAT3 de IL-6 pró-inflamatória,, IL-1, IL-1 e COX2 genes de IL-11.

WP1066 inibiram a expressão da anfirregulina na mucosa antral gp130 ^{Ratos 757FF}

o efeito do tratamento WP1066 sobre a expressão de ligandos do factor de crescimento que se sabe desempenharem um papel no crescimento e diferenciação do estômago e no desenvolvimento de gp130 ^{757FF tumores foi também avaliada. WP1066 inibiram a expressão da anfirregulina (1,85 ± 0,60 vezes, p < 0,05), mas não de HB-EGF (Fig. 6) na mucosa antral de ratinhos tratados. Além disso, o estômago ligando proliferativa e o gene regulado por STAT3 Reg1 mostrou uma tendência inibitória forte após o tratamento comparado com o WP1066 antro controlo de DMSO (Figura 6;. P = 0,069).}

Discussão

neste estudo foi demonstrado que WP1066 dependente da dose, inibe a via de sinalização de JAK2 /STAT3 em células humanas do cancro gástrico (AGS), com uma consequente redução de 60% na proliferação celular, e um aumento menor na apoptose. O mecanismo para isto é provavelmente devido à dupla inibição de formas fosforiladas de JAK2 e STAT3, reduzindo assim a actividade de transcrição STAT3, como tem sido demonstrado por várias linhas celulares de cancro, incluindo glioma [17], [28], [29], leucemia mielóide [ ,,,0],30], e melanoma [20]. Por outro lado, a aplicação WP1066 resultou em um aumento bilateral de ERK1 /2 coincidente com o aumento da activação pSHP2, a fosfatase responsável pela activação da via de sinalização da cinase Ras /MAP. Uma observação semelhante no que diz respeito à activação de ERK foi feita para outras linhas celulares de cancro derivadas de carcinoma renal [18], e glioma [28]. Portanto, regulação cruzada da STAT3 e ERK mediada sinalização a jusante da família de citoquinas IL-6 parece ocorrer normalmente dentro de gamas de tecidos e linhas de células [31].

WP1066 também foi eficaz quando administrado in vivo
, onde ele bloqueou a activação STAT3 (75%) em gp130 ^{tumores antrais 757FF do mouse, e também reduziu proteína total STAT3, sugerindo que pode diminuir a expressão do gene Stat3
na estômagos dos ratos tratados. Esta opinião é corroborada pela existência de sítios de consenso para STAT3 activados vinculativa para o Stat3
promotor, com a activação do gene Stat3
como demonstrado utilizando mutante Stat3
promotor-repórter constructos e a EMSA [48] ou chip-SEQ [49], e sugere que WP1066 pode inibir a activação autócrina da STAT3 depois de inibição da fosforilação de JAK2 /STAT3.}

Como esperado, os níveis pJAK2 também foram reduzidos na presença de WP1066 no estômago. Em contraste com o efeito de WP1066 In vitro,
activação de ERK1 /2 em estômagos de ratos tratados WP1066 foi ligeiramente diminuída. A razão para esta disparidade pode ser duas vezes; Em primeiro lugar, o in vivo
exposição a WP1066 foi crônica em comparação com a exposição aguda in vitro
; em segundo lugar, a exposição in vivo
é mais complexo com múltiplas vias de sinalização potenciais utilizando moléculas de transdução de sinal comum. No entanto, a ativação diminuída de JAK2 e STAT3 está em consonância com o papel estabelecido destes fator de citocina /crescimento componentes na progressão do cancro gástrico [5], [27] sinalização e demonstra que in vivo,
e quando isolado do os efeitos de infecção por H. pylori
, que é predominantemente de activação alterado de STAT3, e não ERK1 /2 que é crucial para o desenvolvimento do tumor.

Coincidente com a inibição da actividade de STAT3, aplicação de WP1066 para apenas 2 semanas in vivo
resultou num decréscimo de 50% na área do tumor acompanhada por uma redução semelhante na proliferação medida por coloração Ki-67, e um aumento concomitante na apoptose de células tumorais como medido pela caspase 3 activada imunocoloração. Esta inibição do crescimento do tumor foi acompanhada por uma > diminuição de 40% no número de células polimorfonucleares, e a sobre-regulação de citocinas pró-inflamatórias associadas, incluindo a IL-1α, IL-1, bem como COX2, todos os quais promovem tumorigénese gástrico. Por outro lado WP1066 não teve nenhum efeito sobre a expressão de IFNy, TNFa, e iNOS comensurável com a falta de redução de linfócitos e macrófagos (infiltração linfoplasmocitária) ao longo do tratamento o tempo-curso. A inibição de IL-1β após a inibição pSTAT3 por WP1066 é particularmente significativa, porque a IL-1β é um importante regulador da secreção de ácido gástrico, um potente promotor do crescimento do tumor em um modelo de ratinho transgénico de cancro gástrico [33], e uma parte integrante do inflamassoma NLRP3 [32]. IL-11 é conhecido por ser um estimulador endógeno da expressão de IL-1β antral através STAT3 [13], e demonstrámos aqui que a IL-11 é inibida por WP1066. Uma vez que a IL-11 parece ser a montante de IL-1β no estômago, em seguida, esta é uma via plausível para a inibição deste último, após o bloqueio da activação da STAT3.

Os efeitos inibidores de WP1066 na gp130 ^{757FF modelo de ratinho de cancro gástrico, recapitular e estender os resultados da STAT3 haploinsu- gerados geneticamente no mesmo modelo de rato [26], bem como a utilização de oligonucleótidos anti-sentido sistémicos contra STAT3 [12], reforçando, assim, a importância da sinalização da STAT3 activado para facilitar tumorigénese gástrico. Dada a importância da IL-11 na promoção de iniciação e desenvolvimento [12] tumor, [13], e IL-6 no sentido de facilitar a infiltração polimorfonuclear locais [34] na gp130 rato 757FF, é significativo que WP1066 efetivamente reduziu o os níveis de expressão de ambas as citocinas coincidentes com a reversão do crescimento tumoral. Isto apoia a ideia de que a STAT3 regula a transcrição de ambos IL-11 e IL-6, possivelmente impulsionado pelo feedback loop autócrino, uma vez que ambas as citocinas utilizar preferencialmente a transcrição STAT3 no estômago [23].}

é um Reg1 amplamente distribuído membro da família do gene Reg e um factor de crescimento conhecido gástrico, que desempenha um papel proeminente como um regulador proliferativa e anti- apoptótica no estômago de ambos os ratinhos [26], [35] e seres humanos [36]. Nós mostramos anteriormente que Reg1 é fortemente induzido em tumores antrais de gp130 ^{ratinhos 757FF coincidente com a IL-6 e IL-11 de expressão, e que haploinsu- de STAT3 resulta em expressão reduzida de Reg1, sugerindo que é um STAT3-regulada gene [26]. Isto foi confirmado em linhas de células gástricas, onde a IL-11 [37] e IL-6 [36] estimularam a fosforilação da STAT3 que por sua vez activado Reg1 transcrição. Os nossos dados actuais são consistentes com estes resultados, em que WP1066 mostra uma forte tendência para inibir Reg1 em tumores gástricos da gp130 757FF rato, juntamente com a IL-6 e IL-11 inibição. H.}

• PLOS ONE: CD147 Expression in Human câncer gástrico está associado a recidiva tumoral e Prognóstico
• PLOS ONE: A MAP3K1 SNP prediz sobrevida de câncer gástrico em um chinês Population