Extracto
transductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3) se activa de forma constitutiva en muchos tipos de cáncer en la que promueve el crecimiento , inflamación, angiogénesis e inhibe la apoptosis. Hemos demostrado que STAT3 se activa constitutivamente en el cáncer gástrico humano, y que la actividad transcripcional STAT3 impulsada por IL-11 induce crónica tumourigenesis gástrico en el gp130 757FF modelo de ratón de desarrollo de cáncer gástrico. Aquí nos muestran que el tratamiento de células humanas de cáncer con AGS gástricas la Janus quinasa (JAK) inhibidor WP1066 de la dosis, e inhibe la fosforilación dependiente del tiempo STAT3, en conjunción con una reducción de la fosforilación de JAK2, la proliferación reducida y aumento de la apoptosis. Además, la aplicación de WP1066 intraperitoneal durante 2 semanas, redujo el volumen del tumor gástrico en un 50% en el gp130 757FF coincidente ratón con reducción de la activación de JAK2 y STAT3 en comparación con, controles de camada tratados con vehículo. Los tumores gástricos de ratones tratados WP1066- habían reducido la inflamación polimorfonuclear, coincidente con la inhibición de numerosas citoquinas proinflamatorias incluyendo IL-11, IL-6 y IL-1β, así como factores de crecimiento Reg1 y anfirregulina. Estos resultados muestran que WP1066 puede bloquear la proliferación, reducir la inflamación e inducir la apoptosis en las células tumorales gástricas mediante la inhibición de la fosforilación de STAT3, y que muchas citoquinas y factores de crecimiento que promueven el crecimiento del tumor gástrico están reguladas por mecanismos de STAT3-dependiente. WP1066 puede servir de base para futuras terapias contra el cáncer gástrico Visto:. Judd LM, Menheniott TR, Ling H, Jackson CB, Howlett M, Kalantzis A, et al. (2014) La inhibición de la JAK2 /STAT3 Camino reduce el crecimiento del cáncer gástrico in vitro Editor: Rupesh Chaturvedi, Escuela de Medicina de la Universidad de Vanderbilt, Estados Unidos de América Recibido: 21 Enero, 2014; Aceptado: April 1, 2014; Publicado: May 7, 2014 Derechos de Autor © 2014 Judd et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan Financiación:. Este proyecto fue apoyado por fondos de; NHMRC proyecto Australia (www.nhmrc.gov.au) de subvenciónǽ165 NIH /NCI EE.UU. (nih.gov; www.cancer.gov) el melanoma SPORE CA093459-06 P50, NIH /NCI EE.UU. (nih.gov; www.cancer. gov) SPORE cerebro 2 P50 CA127001-06. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito Conflicto de intereses:. Waldemar Priebe tener patentes y tiene un interés financiero en el desarrollo del compuesto de la siguiente WP1066; W.Priebe, N.Donato, M.Talpaz, S, Szymanski, I. Fokt, A. Compuestos Levitzki para el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares. Une la patente WO /2005/058829 12/01/2004. Tenga en cuenta también que los autores han proporcionado una declaración enmendada del Conflicto de intereses en relación con una patente sobre WP1066 realizada por W. Priebe. Los autores también declaran que "esto no altera nuestra adhesión a las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido". De los siete transductor de señales y activador de la transcripción miembros de la familia (STAT) , STAT3 se ha implicado más consistentemente en una gama de cánceres comunes en seres humanos, incluyendo; pulmón, de mama, de ovario, de próstata, de colon y [1], [2], [3], [4]. Esto también es cierto en el cáncer gástrico humano [5], [6], [7] en el que STAT3 activación por fosforilación crónica en tirosina (Y) residir 705 se ha relacionado con un aumento del crecimiento, la angiogénesis, la invasión y la metástasis del cáncer primario [ ,,,0],6], [7], [8]. Por lo tanto, la inhibición de la actividad transcripcional STAT3 en el cáncer gástrico humano puede proporcionar un medio posible de reducir la alta morbilidad y prolongar la vida entre los pacientes con cáncer gástrico en todo el mundo. En la ausencia de mutaciones funcionales en el gen STAT3, STAT3 actividad aberrante es inducida por la actividad persistente de tirosina quinasas aguas arriba, y /o por unscheduled- o sobre-expresión de los ligandos estimuladores [9], [10], [11]. Esto está claramente ejemplifica en la gp130 757F /F modelo de ratón de desarrollo de cáncer gástrico, en el que un Phe por Tyr sustitución en la posición 757 en el brazo intracelular de la IL-6 de la familia de señalización gp130 receptor impide simultáneamente SHP2 y SOCS3 de unión , lo que resulta en la inhibición de Ras /MAP quinasa de transducción de señales, y la hiperactivación de STAT3 por la fosforilación constitutiva [23], [24], [26]. Recientemente nosotros y otros han demostrado que en los tumores gástricos, aumentos significativos en la transcripción coinciden con el aumento de expresión del ligando gp130 IL-11 en modelos de cáncer y de ratón gástricos humanos de esta enfermedad [5], [12], [13]. En este último IL-6 es prescindible, pero IL-11 es absolutamente necesario para la génesis tumoral [12], [13]. Además, la IL-11 /STAT3 se ha demostrado ser un importante motor de la gastritis atrófica, la primera lesión precancerosa del estómago después de la infección crónica por la bacteria Helicobacter pylori hasta la fecha, numerosos quinasas se han reportado para inducir la actividad STAT3 después de la unión ligando /receptor, sin embargo, sólo JAK1 y cuenta JAK2 para la fosforilación de STAT3 en acoplamiento con IL-11 /receptor gp130 complejo [15] y de éstos IL-11 /gp130 se une preferentemente JAK2 [16]. Estas observaciones sugieren que JAK2 y STAT3 presentes objetivos prometedores para el diseño de antagonistas terapéuticos para suprimir la IL-11 /señalización en el cáncer gástrico humano STAT3. Recientemente, el ácido cafeico derivado WP1066, estructuralmente relacionada con el inhibidor de la baja potencia de la tirosina quinasa AG490 , se ha demostrado que es un inhibidor muy potente de la vía JAK2 /STAT3 en glioma transformado cerebro [17] y las líneas celulares de carcinoma renal [18], que conduce a la inhibición del crecimiento y la inducción de las vías de pro-apoptóticos clásicos. Además, es eficaz WP1066 in vivo Para probar la idea de bloqueo dual de JAK2 y la activación de STAT3 en el estómago y el posterior desarrollo de cáncer gástrico, hemos utilizado tanto in vitro Materiales y Métodos Preparación y almacenamiento de inhibidores de quinasa inhibidor WP1066 fue desarrollado y sintetizado por Waldemar Priebe y compañeros de trabajo en la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, y actual de las acciones fue suministrado por cortesía de Houston Pharmaceuticals Inc, Houston, Texas, EE.UU.. Las acciones se volvieron a suspender en Hybri-Max DMSO y se almacenaron a -20 ° C. La acción era un solo uso, y no volver a congelarse después de la descongelación. células AGS (ATCC, Manassas VA, EE.UU.) las células se mantuvieron en medio completo que contiene RPMI + Glutamax ( Gibco Invitrogen Life Sciences, OR, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10%, 50 UI de penicilina a 37 ° C en 5% de CO 2-95% de aire. Western Blot los extractos de proteína se prepararon ya sea con el reactivo Trizol (Life Technologies, Vic, Australia) según las instrucciones del fabricante y pellets de proteína se resuspendieron en 1% de dodecilsulfato de sodio que contiene 2 mmol /l Na 3Vo 4 o RIPA buffer. Alícuotas (30 mg) se sometieron a electroforesis en gel de sulfato /poliacrilamida con dodecilsulfato sódico. Las membranas se bloquearon y se incubaron a 4 ° C durante la noche en leche descremada con los siguientes anticuerpos; STAT3, Py (705) STAT3, ERK1 /2, Pt (202), Y (204) ERK1 /2, AKT, PS (473) AKT, JAK2, Py (1007), Y (1008) JAK2 (Señalización celular,Α2,Α4S,Α1,Ύ2Ƶ7,Ο2,ƕ8,ŷ2,ŷ1,ł9,Ź1), GAPDH (Abcamδ5). Las membranas se incubaron con anticuerpo secundario peróxido de conjugado (Dako, policlonal de conejo anti porcina, HRP conjugado, # P0399) y se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). Para el análisis de las bandas se cuantificaron utilizando el sistema de software Quantity One (Biorad) y las proteínas fosforiladas expresadas como una proporción de GAPDH de una membrana por duplicado. Al menos n = 8 muestras fueron evaluados por cualquiera de los tratamientos. Las células se sembraron a 5 x 10 4 células /ml en formato de 24 pocillos en medio completo y se dejaron crecer en reposo durante 24 horas. Las células fueron tratadas con la concentración apropiada de WP1066 o DMSO como control para 0-360 min. Después las células se desalojaron de tratamiento por tratamiento con tripsina-EDTA al 0,25% (Sigma), se tiñeron con azul de tripano al 0,4% (Sigma) a una dilución 1:01 durante 5 minutos a 4 ° C, y se contaron en un hemocitómetro. diacetato de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) tinción Para etiquetar células AGS con CFSE, las células se desalojaron por tratamiento con tripsina-EDTA al 0,25% (Sigma) y se resuspendieron en precalentada /0,1% BSA PBS a una densidad de 1 × 10 6 células /ml. 10 CFSE mM colorante (Invitrogen) se preparó según el protocolo del fabricante, a continuación, 5 l /ml se añadió y se mezcló completamente mediante una inversión para garantizar el etiquetado homogénea de células. Las muestras se incubaron a 37 ° C durante 10 minutos, se inactivó mediante la adición de 5 volúmenes de medios de enfriado con hielo y se incubaron durante 5 minutos en hielo. a continuación, las muestras se lavaron 5 veces en los medios y se sembraron a 2 x 10 5 células /pocillo (placas de 6 pocillos). Una muestra de células se tomó después de la siembra y se marcó con 100 g /ml de yoduro de propidio (PI) y se analizó por citometría de flujo para la uniformidad y la intensidad de etiquetado. Las células fueron cultivadas en medio completo durante 48 horas después de que fueron tratadas con o sin WP1066 apropiado (5 mM) a 37 ° C con 5% de CO 2 95% de aire durante 18 horas. Las células fueron tripsinizadas como anteriormente y se resuspendieron en medio completo, marcado con 100 mg /ml PI, y se analizaron por citometría de flujo en 488 ηM. Los datos se registraron utilizando la diva BD FACS (BD Biosiences) paquete de software y analizado por Modfit LT paquete de software (VSH). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el Código Australiano para el cuidado y uso de animales para fines científicos (7 ª edición), y después de la aprobación del Comité de Investigación infantil Murdoch Instituto de Ética Animal (aplicación # A583). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar las molestias en estos procedimientos mínimamente invasivos. in vivo Los experimentos gp130 ratones 757F /F se han descrito anteriormente [23]. Brevemente, los tumores antrales discretas desarrollan por 4 semanas de edad y crecen rápidamente hasta aproximadamente 12 semanas. Se recapitulan las características de desarrollo de tipo intestinal adenocarcinoma gástrico, incluyendo la invasión de la submucosa, pero no metastasise [24]. Los animales fueron alojados en una instalación SPF en el Instituto de Investigación Infantil Murdoch y confirmaron que estar libre de Helicobacter pylori Los estómagos fueron disecados rápidamente a lo largo de la curvatura menor, cubrió a cabo, fotografiado y fijado en el 4% de paraformaldehído tamponado antes de procesar. Secciones de parafina (4 m) se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & E). El análisis morfométrico se realizó utilizando el software ImageJ de código abierto (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). Para mediciones de área, las imágenes de la mucosa gástrica se esbozaron manualmente con la herramienta de dibujo de software y el programa de cuantificación utilizado para generar mediciones En vivo El análisis inmunohistoquímico se realizó con anticuerpos para Ki-67 (PharmingenȦ609) y se activa la caspasa 3 (Señalización Celular TecnologíaϤ1). La recuperación del antígeno se llevó a cabo por las secciones de ebullición durante 30 minutos en ácido cítrico 10 mM (pH 6,0). La tinción se completa con los anticuerpos apropiados especies específicas secundario biotinilado (Dako, Dinamarca), avidina y peroxidasa de rábano picante biotinilado macromolecular compleja (Vector Laboratories, Burlingame, CA), 3,3'-diaminobencidina (Sigma, St Louis, MI) y contratinción con hematoxilina. Para Ki-67 cuantificación, un observador ciego contado número de células teñidas por la glándula en múltiples secciones por animal usando ImageJ como antes. Los datos se expresaron como el número Ki-67 células positivas por glándula. Para caspasa 3 cuantificación, un observador ciego contó el número de células teñidas por área de mucosa en 4 áreas aleatorias de antro bien orientado por animal usando ImageJ como antes. Los datos se expresaron como el número caspasa 3 células positivas por unidad de superficie de la mucosa Análisis morfométrico semi-cuantitativa de la inflamación La inflamación se evaluó mediante microscopía de una manera ciega en H &. E-manchado secciones. tejidos tumorales antrales se analizaron y un mínimo de 3 tiras por animal (n = 7) recibieron una puntuación semicuantitativa de acuerdo con el grado de células inflamatorias desde el mínimo hasta el máximo = 0 = 3. linfoplasmocítico y polimorfonucleares infiltrado se evaluaron de forma independiente. Los valores medios se compararon para el análisis estadístico. El ARN se extrajo con el reactivo Trizol (Life Technologies, VIC, Australia) según las instrucciones del fabricante. El ARN total (3 g) se transcribió de forma inversa en ADNc usando Moloney virus de leucemia murina transcriptasa inversa (Promega, Madison, WI) cebado con 0,3 g de oligo (dT). cebadores Q-PCR fueron diseñados utilizando Primer Express (Applied Biosystems) (Tabla 1). SYBR química verde (Applied Biosystems) se utilizó con L32 como el normalizador. Las condiciones de PCR fueron 95 ° C durante 10 min, luego 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 15 s; las reacciones se llevaron a cabo en una máquina Applied Biosystems AB7500 RT PCR. Los resultados fueron analizados utilizando el software detector de secuencia, y se determinaron diferencias veces en relación con el método ΔΔCt como se describe por el fabricante. Los datos se expresaron como media ± error estándar de la media . Los valores obtenidos a partir del análisis cuantitativo de la expresión génica o el número de células teñidas se comparó entre las muestras por ANOVA, y donde se encontró una diferencia estadísticamente significativa grupos individuales se analizaron adicionalmente con el estadístico paramétrico o no paramétrico apropiado utilizando el paquete estadístico Sigmastat. La significación estadística se definió como p = 0.05. Resultados WP1066 Suprime rápidamente fosforilada Y (705) y STAT3 induce la fosforilación de ERK1 /2 en células AGS El JAK- STAT vía y la vía ERK1 /2 son los dos principales vías de transducción de señales aguas abajo de gp130. Estas dos vías tienen efectos reguladores recíprocos e inverso el uno del otro, mejor demostrado por la regulación negativa de pSTAT3 después de ERK1 /2 activación [47]. WP1066 experimentos de dosis-respuesta se llevaron a cabo mediante el tratamiento de células AGS con 0 , 1, 2 o 5 M WP1066 de 60 min y la fosforilación de medición de JAK2, STAT3, ERK1 /2 y SHP-2. Como era de esperar, pJAK2 fue fuertemente inhibida por WP1066 en todas las concentraciones ensayadas y por > 80% a 5 mM. 5 M WP1066 también dio la inhibición máxima de pSTAT3 y la activación recíproca de pERK1 /2 (Fig. 1A) con una reducción de STAT3 total al 5 micras o mayores concentraciones (datos no mostrados). Coincidente con el aumento de pERK, la activación pSHP2 fue dependiente de la dosis después de la administración mejorada WP1066 (Fig. 1A). Para los estudios de tiempo-por supuesto, las células AGS fueron tratados por 0-360 min con 5 M WP1066 y la fosforilación de JAK2, STAT3, ERK1 /2 y SHP-2 se analizaron por transferencia Western (Fig. 1B). WP1066 tratamiento dio lugar a una rápida inhibición de la pJAK2, con una caída del 75% en 30 min y un 90% de disminución máxima de 60 minutos. Después, las células se recuperaron y se devuelven a la fosforilación basal JAK2 por 360 min. El patrón de disminución de la activación de STAT3 reflejaba la de la fosforilación de JAK2. Por el contrario, ERK1 /2 fosforilación se incrementó marcadamente en respuesta al tratamiento WP1066, con un aumento del 250% en 15 min, y un máximo incremento de 460% en 60 min, antes de volver a los niveles basales de 360 min. activación SHP2 siguió muy de cerca los cambios en la expresión de ERK con la inducción máxima a 60 min. WP1066 Inhibe AGS Crecimiento a través de supresión de la proliferación e inducción de apoptosis STAT3 activado es un conductor establecida de células de cáncer gástrico humano crecimiento y la proliferación [5], y prolongada activación de ERK1 /2 induce la apoptosis de las células epiteliales gástricas [25]. Después de haber demostrado que regula WP1066 STAT3 y la señalización ERK1 /2 de una manera recíproca, si la prueba también puede perturbar el crecimiento celular e inducir la apoptosis de las células AGS. El tratamiento de células AGS con 5 M WP1066 (Fig. 2A ) resultó en una reducción sustancial en el número de células en relación al DMSO controles (DMSO; 100% ± 3,14 vs. WP1066; 36,02% ± 3,18, p < 0,05). Para determinar si esta reducción en el número de células era debido a la proliferación alterada de células o apoptosis, o una combinación de ambos, CFSE y Anexina V tinción se realizó en las células tratadas. células AGS tratados con WP1066 se marcaron más intensamente con CFSE que los tratados con DMSO, la evidencia de reducción del número de divisiones celulares y por lo tanto la proliferación (Fig. 2B). Además, una mayor proporción de células AGS tratados con WP1066 se marcaron con anexina V (Figura 2C) en comparación con las células tratadas con DMSO, lo que demuestra que la apoptosis también inducida WP1066 en células AGS (WP1066; 1,3 veces mayor, p = 0,049). WP1066 Bloques gástrico El crecimiento del tumor en gp130 757FF ratones por represión de la proliferación de células del tumor y el aumento de la apoptosis gp130 ratones desarrollan tumores de estómago 757FF distales que se caracterizan por la IL-11 gástrica elevada activación impulsada STAT3 [12], [13]. Desde pJAK2 y p-STAT3 son bloqueados por WP1066 in vitro Para determinar si la proliferación fue alterada en tumores gástricos, Ki-67 células positivas /glándula se cuantificaron en la cohorte tratada. tratamiento WP1066 redujo significativamente la proliferación de células epiteliales gástricas (DMSO 62 ± 7,7 vs. WP1066 41,6 ± 6,5 Ki-67 células teñidas /glándula, p < 0.05; Fig. 3E-G) que demuestra que WP1066 puede inhibir el crecimiento tumoral mediante la inhibición de la proliferación celular. Para evaluar los efectos de WP1066 sobre la apoptosis de las células tumorales, las secciones de la WP1066 o cohortes tratadas con DMSO se tiñeron con un anticuerpo contra la caspasa 3 escindida, un marcador de la muerte celular apoptótica (Fig. 3H, I). Había perfiles significativamente más apoptóticas en los tumores WP1066 tratados que en los controles, lo que demuestra un efecto pro-apoptótica clara de WP1066 (WP1066 25.25 ± 5.32 vs DMSO 2.65 ± 0.76 células teñidas /mm 2 mucosa, p < 0,05; Fig. 3J ). WP1066 se dirige específicamente a JAK2 y STAT3 fosforilación para suprimir la génesis tumoral gástrico en gp130 ratones 757FF Debido a gp130 ratones desarrollan tumores 757FF en respuesta a la activación constitutiva de gp130 [20] , hemos probado si WP1066 suprimió las vías de señalización corriente abajo in vivo. El análisis por inmunotransferencia de la activación de la señalización demostró una reducción significativa en pJAK2 (80,12% ± 5,70 de control de DMSO), pY705 STAT3 (26,84 % ± 7,2 de control de DMSO; la Fig. 4B) y /2 (control ± 5.23.of DMSO pERK1 72,66%; Fig. 4B). la fosforilación de AKT no fue cambiada por el tratamiento WP1066. reducción de la activación de JAK2 y STAT3 es consistente con el in vitro WP1066 suprimió la respuesta inflamatoria en la mucosa antral de gp130 757FF ratones Desde una respuesta inflamatoria crónica del estómago es crucial para el desarrollo del tumor [27], hemos probado si parte del modo de acción de WP1066 es suprimir la respuesta inflamatoria STAT3 mediada, que normalmente contribuye a la progresión del tumor. El análisis histológico reveló que la infiltración polimorfonuclear en el antro de ratones tratados WP1066 fue significativamente menor que en los ratones de control (Fig 5A;. DMSO 2,45 ± 0,24 vs WP1066 1,46 ± 0,22, p < 0,05), mientras que infiltrado linfoplasmocítico no fue diferente entre los dos grupos (Fig. 5B; DMSO 1,73 ± 0,16 vs WP1066 1,32 ± 0,20, p > 0,05). Dado que la inflamación gástrica típicamente se mediada por un pequeño número de citoquinas y enzimas pro-inflamatorias clave, que mide la expresión de un grupo selecto de éstos por Q-PCR en DMSO y estómagos WP1066 tratados. La expresión de todos los mediadores pro-inflamatorios con la excepción de IFN, TNF y iNOS se inhibió significativamente por el tratamiento WP1066 de la siguiente manera; IL-6 (Fig. 5C; 6,0 ± 2,6 veces), IL-11 (Fig 5D;. 8,7 ± 3,4 veces), IL-1α (Fig 5E;. 10,9 ± 4,3) veces), IL-1β (Fig 5F.; 3 ± 0,9 veces) y COX2 (Fig 5G;. 2,94 ± 1,05). Por lo tanto la inhibición de la actividad STAT3 WP1066 y la progresión del tumor fue debido en parte a la infiltración de polimorfonucleares reducida y reduce la transcripción STAT3 dependiente de IL-6 pro-inflamatoria,, IL-1a, IL-1ß y COX2 genes IL-11. WP1066 inhibió la expresión de anfirregulina en el antro Mucosa de gp130 Ratones 757FF el efecto del tratamiento WP1066 en la expresión de ligandos de factores de crecimiento conocidos por jugar un papel en el crecimiento y la diferenciación del estómago y en el desarrollo de la gp130 se evaluó también tumores 757FF. WP1066 inhibió la expresión de anfirregulina (1,85 ± 0,60 veces, p < 0,05), pero no HB-EGF (Fig. 6) en la mucosa antral de los ratones tratados. Además, el estómago proliferativa ligando y el gen STAT3 reguladas Reg1 mostró una tendencia inhibidora fuerte después del tratamiento WP1066 en comparación con el antro control de DMSO (Fig 6;. P = 0,069). en este estudio hemos demostrado que inhibe WP1066 dosis-dependiente de la vía de señalización JAK2 /STAT3 en células humanas de cáncer gástrico (AGS), con la consiguiente reducción del 60% en la proliferación celular, y un menor aumento de la apoptosis. El mecanismo para esto es probablemente debido a la inhibición dual de las formas fosforiladas de JAK2 y STAT3 reduciendo así STAT3 actividad transcripcional, como se ha demostrado para varias líneas celulares de cáncer, incluyendo glioma [17], [28], [29], la leucemia mieloide [ ,,,0],30], y melanoma [20]. Por otro lado, la aplicación WP1066 resultó en un aumento recíproco en ERK1 /2 coincidente con un aumento de la activación pSHP2, la fosfatasa responsable de la activación de la vía de señalización de la quinasa Ras /MAP. Una observación similar con respecto a la activación de ERK se ha hecho para otras líneas celulares de cáncer derivadas de carcinoma renal [18], y glioma [28]. Por lo tanto, cruz de regulación de STAT3 y ERK mediada por la señalización aguas abajo de las citocinas IL-6 de la familia parece ocurrir comúnmente en unas gamas de tejidos y líneas celulares [31]. WP1066 también fue eficaz cuando se administra Como era de esperar, los niveles de pJAK2 se redujeron también en presencia de WP1066 en el estómago. En contraste con el efecto de WP1066 in vitro, España ERK1 /2 de activación en estómagos de WP1066 ratones tratados se redujo ligeramente. La razón de esta disparidad puede ser de dos veces; En primer lugar, el in vivo Coincidente con la inhibición de la actividad STAT3, la aplicación de WP1066 por sólo 2 semanas in vivo Los efectos inhibidores de WP1066 de la gp130 757FF modelo de ratón de cáncer gástrico, recapitular y ampliar los resultados de STAT3 haploinsuficiencia generadas genéticamente en el mismo modelo de ratón [26], así como el uso de oligonucleótidos antisentido sistémica contra STAT3 [12], subrayando así la importancia de la señalización de STAT3 activada en la facilitación tumourigenesis gástrico. Dada la importancia de IL-11 en la promoción de la iniciación del tumor y el desarrollo [12], [13], y la IL-6 en la facilitación de la infiltración polimorfonuclear locales [34] en el gp130 757FF ratón, es significativo que WP1066 reduce efectivamente la niveles de expresión de ambas citoquinas coincidentes con reversión del crecimiento tumoral. Esto apoya la opinión de que STAT3 regula la transcripción de IL-11 e IL-6, posiblemente impulsado por bucles de retroalimentación autocrina, ya que ambas citoquinas preferentemente utilizan la transcripción STAT3 en el estómago [23]. Reg1 es un ampliamente miembro distribuida de la familia de genes reg y un conocido factor de crecimiento gástrico, que desempeña un papel destacado como un regulador proliferativa y anti-apoptótica en el estómago de tanto en ratones [26], [35] y los seres humanos [36]. Hemos demostrado anteriormente que Reg1 está fuertemente inducida en tumores antrales de gp130 ratones 757FF coincidente con IL-6 y IL-11 expresión, y que la haploinsuficiencia de los resultados de STAT3 en la reducción de expresión de Reg1, lo que sugiere que se trata de un STAT3-regulada gen [26]. Esto ha sido confirmado en líneas de células gástricas en donde IL-11 [37] y la IL-6 [36] estimularon la fosforilación de STAT3 que a su vez activa la transcripción Reg1.
y En Vivo
. PLoS ONE 9 (5): e95993. doi: 10.1371 /journal.pone.0095993
Introducción
[14].
contra melanomas malignos y leucemias altamente que son positivas para la mutación JAK2 V617F-+, que promueve la activación constitutiva JAK2 quinasa [19], [20], [21], [22 ]. Estudios no publicados indican que WP1066 no es un inhibidor competitivo de ATP, y puede bloquear la expresión de JAK2 y STAT3 fosforilado; Además, p-STAT3-Y705 puede inhibirse independientemente del estado de JAK2. Por lo tanto, WP1066 presenta una oportunidad única para inhibir tanto p-JAK y p-STAT3, y posteriormente de forma potente bloque JAK2 /STAT3 vía de señalización y la actividad transcripcional STAT3.
y in vivo
enfoques para evaluar si WP1066 puede ralentizar o bloquear el crecimiento del tumor gástrico mediante la inhibición de la actividad /STAT3 JAK2, y otras vías de señalización oncogénicas estrechamente relacionados. Aquí mostramos que WP1066 inhibe eficazmente la fosforilación de STAT3, e induce la apoptosis en una línea celular de cáncer gástrico, y que puede inhibir el crecimiento del tumor gástrico in vivo
mediante el bloqueo de la inducción de genes clave STAT3-regulado.
in vitro Cultura y
Recuento celular por Haemocytometry
Anexina V tinción
p>
Declaración de Ética
. Se evaluaron tres grupos de ratones para el desarrollo de tumores: 1) 8 semanas de edad gp130 ratones 757F /F que no recibieron tratamiento (n = 10); 2) gp130 ratones 757F /F que recibieron WP1066 de 8 a 10 semanas de edad (n = 10); y 3) gp130 ratones 757F /F que recibieron vehículo DMSO de 8 a 10 semanas de edad (n = 8). Antes de la experimentación todos los animales fueron evaluados para el bienestar, se pesaron y volúmenes de tratamiento calculado en consecuencia. Los animales control recibieron volúmenes equivalentes de vehículo DMSO a los animales tratados con WP1066. Los ratones recibieron 2 inyecciones intra-peritoneales iniciales de WP1066 a 10 mg /kg cada 48 horas para aclimatarse a los efectos del tratamiento, a continuación, recibió 5 inyecciones de WP1066 a 20 mg /kg cada 48 horas para completar el régimen de 2 semanas. sitios de inyección intra-peritoneal se alternaron a través de cuatro cuadrantes del abdomen de los ratones. Al final del experimento, los ratones fueron sacrificados y estómagos resecados para la fotografía y el tejido colección.
macroscópicos e histológicos de Evaluación
inmunohistoquímica &.; La cuantificación
Análisis en tiempo real (Q)-PCR
Análisis estadístico
, hemos probado si WP1066 también bloquearía el desarrollo del tumor gástrico in vivo
. El tratamiento de la gp130 ratones 757FF 3 veces por semana durante 2 semanas con /kg WP1066 reducido significativamente el crecimiento del tumor gástrico 10-20 mg por 47% a partir de 42,11 ± 3,21 mm 2 a 22.36 ± 3.64 mm 2 ( p <. 0,05) (Fig 3A-D). los tumores tratados con DMSO no eran diferentes a los tumores observados en ratones de 8 semanas, la edad en que comenzó el tratamiento WP1066, confirmando que el crecimiento del tumor gástrico es relativamente estable a partir de 8-10 semanas [27], y que el tratamiento WP1066 realmente causa la regresión del tumor en lugar de estasis (Fig. 3A-D).
tratamiento WP1066 durante 2 semanas resultó en una disminución del 25% en la cantidad relativa de STAT3 total en la mucosa antral en comparación con los grupos tratados con DMSO (Fig. 4A) . La cantidad de JAK2 totales, Akt y ERK1 /2 no fue cambiado por el tratamiento WP1066. Esto sugiere que el tratamiento crónico de gp130 ratones 757FF con WP1066 suprime la expresión de STAT3.
datos y acciones conocidas de la WP1066.
Discusión
in vivo, donde se bloqueó la activación de STAT3 (75%) en gp130 tumores antrales 757FF ratón, y también redujo la proteína total STAT3, lo que sugiere que puede disminuir la expresión de la Stat3
en el gen estómagos de los ratones tratados. Esto es apoyado por la existencia de sitios de consenso para STAT3 activada vinculante para el Stat3
promotor, con la activación de la Stat3
gen mutante como se demuestra utilizando Stat3
de promotor-indicador construcciones y EMSA [48] o chip-ss [49], y sugiere que WP1066 puede inhibir la activación autocrina de STAT3 después de la inhibición de la fosforilación de JAK2 /STAT3.
exposición a WP1066 fue crónica en comparación con la exposición aguda in vitro
; en segundo lugar, la exposición in vivo
es más compleja con múltiples posibles vías de señalización que utilizan moléculas de transducción de señales común. No obstante, la disminución de la activación de JAK2 y STAT3 está en consonancia con el papel establecido de éstos citoquina /factor de crecimiento de los componentes en la progresión del cáncer gástrico [5], [27] de señalización y demuestra que in vivo, España y cuando aislado de los efectos de H. pylori
infección, que es la activación de STAT3 predominantemente alterada, y no ERK1 /2, que es crucial para el desarrollo de tumores.
dado lugar a una disminución del 50% en el área del tumor acompañada de una reducción similar en la proliferación como se mide por Ki-67 de la tinción, y un aumento concomitante en la apoptosis de las células tumorales tal como se mide por la caspasa activado 3 inmunotinción. Esta inhibición del crecimiento del tumor fue acompañado de un > 40% de disminución en el número de células polimorfonucleares, y la sobre regulación de las citoquinas pro-inflamatorias asociadas, tales como IL-1α, IL-1ß así como COX2, todo lo cual promueve la génesis tumoral gástrico. Por otro lado WP1066 no tuvo ningún efecto sobre la expresión de IFN, TNF, y iNOS acorde con la falta de reducción de linfocitos y macrófagos (infiltración linfoplasmocítico) sobre el tiempo de curso de tratamiento. La inhibición de la IL-1β después de la inhibición pSTAT3 por WP1066 es especialmente significativa, ya que la IL-1β es un importante regulador de la secreción de ácido gástrico, un potente promotor del crecimiento del tumor en un modelo de ratón transgénico de cáncer gástrico [33], y una parte integral de la inflamasoma NLRP3 [32]. IL-11 es conocida por ser un estimulador endógeno de expresión de IL-1β antral a través de STAT3 [13], y hemos demostrado aquí que la IL-11 es inhibida por WP1066. Dado que la IL-11 parece ser aguas arriba de la IL-1β en el estómago, entonces esta es una vía plausible para la inhibición de éste después del bloqueo de la activación de STAT3
.
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