PLOS ONE: Hämning av JAK2 /STAT3 Pathway Minskar Gastric cancertillväxt in vitro och in Vivo

Abstrakt

signalomvandlare och aktivator av transkription-3 (STAT3) är konstitutivt aktiverad i många cancerformer där det främjar tillväxt , inhiberar inflammation, angiogenes och apoptos. Vi har visat att STAT3 är konstitutivt aktiverade i human gastric cancer, och att kronisk IL-11-driven STAT3 transkriptionell aktivitet inducerar gastrisk tumörbildning i gp 130 ^{757FF musmodell av gastrisk cancerutveckling. Här visar vi att behandling av humana AGS gastric cancerceller med Janus Kinase (JAK) -hämmare WP1066 dos- och tidsberoende hämmar STAT3 fosforylering, i samband med reducerad JAK2 fosforylering, minskad proliferation och ökad apoptos. Dessutom tillämpning av intraperitoneal WP1066 för 2 veckor, minskade gastric tumörvolymen med 50% i gp130 757FF mus sammanfaller med reducerad JAK2 och STAT3-aktivering jämfört med vehikelbehandlade, kontroller kull. Gastriska tumörer från WP1066- behandlade möss hade minskad polymorfonukleära inflammation, sammanfallande med hämning av talrika proinflammatoriska cytokiner inklusive IL-11, IL-6 och IL-1β, såväl som tillväxtfaktorerna REG1 och amfiregulin. Dessa resultat visar att WP1066 kan blockera spridning, minska inflammation och inducera apoptos i gastriska tumörceller genom att hämma STAT3 fosforylering, och att många cytokiner och tillväxtfaktorer som främjar gastriskt tumörtillväxt regleras av STAT3-beroende mekanismer. WP1066 kan ligga till grund för framtida läkemedel mot magcancer}

Citation. Judd LM, Menheniott TR, Ling H, Jackson CB, Howlett M, Kalantzis A, et al. (2014) Hämning av JAK2 /STAT3 Pathway Minskar Gastric cancertillväxt In Vitro Mössor och In Vivo
. PLoS ONE 9 (5): e95993. doi: 10.1371 /journal.pone.0095993

Redaktör: Rupesh Chaturvedi, Vanderbilt University School of Medicine, USA

emottagen: 21 januari 2014; Accepteras: 1 april 2014. Publicerad: 7 maj 2014

Copyright: © 2014 Judd et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta projekt stöddes av medel från; NHMRC Australien (www.nhmrc.gov.au) projektbidragǽ.165 NIH /NCI USA (nih.gov, www.cancer.gov) melanom SPORE P50 CA093459-06, NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer. gov) hjärna SPORE 2 P50 CA127001-06. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

konkurrerande intressen. Waldemar Priebe hålla patent och har ett ekonomiskt intresse i utvecklingen av föreningen WP1066 enligt följande; W.Priebe, N.Donato, M.Talpaz, S, Szymanski, I. Fokt, A. Levitzki Föreningar för behandling av cellproliferativa sjukdomar. Förenar States Patent WO /2005/058829 2004/12/01. Notera också att författarna har gett ett ändrat redovisning av konkurrerande intressen om ett patent på WP1066 innehas av W. Priebe. Författarna förklarar också att "detta inte förändrar vår anslutning till PLoS One politik på delning av data och material".

Introduktion

Av de sju signalomvandlare och aktivator av transkription (STAT) familjemedlemmar , STAT3 har mest konsekvent inblandad i en rad vanliga cancerformer hos människor, inklusive; lung-, bröst-, äggstocks-, prostata- och kolon [1], [2], [3], [4]. Detta är också sant i human magcancer [5], [6], [7], i vilken STAT3-aktivering av kronisk fosforylering på tyrosin (Y) uppe 705 har kopplats till ökad tillväxt, angiogenes, invasion och metastas av den primära cancern [ ,,,0],6], [7], [8]. Således kan inhibering av STAT3 transkriptionsaktivitet i human magcancer ge en möjlig åtgärd för att minska den höga sjukligheten och förlänga livet bland gastric patienter över hela världen cancerpatienter.

I avsaknad av funktionella mutationer i STAT3 genen, avvikande STAT3 aktivitet induceras av ihållande aktivitet från uppströms tyrosinkinaser, och /eller genom unscheduled- eller överuttryck av stimulerande ligander [9], [10], [11]. Detta är tydligt exemplifieras i gp130 ^{757F /F musmodell av magcancer utveckling, där en Phe för Tyr substitution vid 757 position på den intracellulära arm av IL-6 familjen signalerar receptor gp130 förhindrar samtidigt SHP2 och SOCS3 bindning , vilket resulterar i hämning av ras /MAP kinas signalöverföring, och hyper av STAT3 genom konstitutiv fosforylering [23], [24], [26]. Vi och andra har nyligen visat att i gastriska tumörer, signifikanta ökningar av transkription sammanfaller med ökad uttryck av gp130 ligand IL-11 i humana magcancer och musmodeller av denna sjukdom [5], [12], [13]. I det senare IL-6 är umbärlig, men IL-11 är absolut krävs för tumörbildning [12], [13]. Dessutom har IL-11 /STAT3 visat sig vara en viktig drivkraft för atrofisk gastrit, den första precancerösa lesionen i magen efter kronisk infektion av bakterien Helicobacter pylori
[14].}

hittills har många kinaser rapporterats inducera STAT3 aktivitet efter ligand /receptorbindning, dock endast JAK1 och JAK2 konto för STAT3 fosforylering vid dockning med IL-11 /gp130 receptorkomplexet [15] och av dessa IL-11 /gp130 företrädesvis binder JAK2 [16]. Dessa observationer antyder att JAK2 och STAT3 närvarande lovande mål för att utforma terapeutiska antagonister för att undertrycka IL-11 /STAT3 signalering i human gastric cancer.

Nyligen kaffeinsyra derivatet WP1066, strukturellt besläktad med den låga potens tyrosinkinasinhibitor AG490 , har visat sig vara en mycket potent inhibitor av JAK2 /STAT3-vägen i transformerad hjärnan gliom [17] och njurkarcinom [18] cellinjer, vilket leder till tillväxthämning och induktion av klassiska pro-apoptotiska reaktionsvägar. Dessutom är WP1066 effektiv In vivo
mot starkt maligna melanom och leukemi som är positiv för JAK2-V617F + mutation, som främjar konstitutiv JAK2-kinasaktivering [19], [20], [21], [22 ]. Opublicerade studier tyder på att WP1066 är inte en ATP-kompetitiv inhibitor, och kan blockera uttryck av fosforylerad JAK2 och STAT3; dessutom kan p-STAT3-Y705 inhiberas oberoende av JAK2 status. Således presenterar WP1066 en unik möjlighet att hämma både p-JAK och p-STAT3 och därefter kraftigt blockera JAK2 /STAT3 signalväg och STAT3 transkriptionsaktivitet.

För att testa idén om dubbla blockad av JAK2 och STAT3-aktivering i magen och efterföljande magcancer utveckling, har vi använt både in vitro Mössor och in vivo
metoder för att bedöma huruvida WP1066 kan bromsa eller blockera gastric tumörtillväxt genom hämning av JAK2 /STAT3 aktivitet, och andra närbesläktade onkogena signalvägar. Här visar vi att WP1066 hämmar effektivt STAT3 fosforylering, och inducerar apoptos i en magcancer cellinje, och att det kan hämma gastrisk tumörtillväxt In vivo
genom att blockera induktion av viktiga STAT3 reglerade gener.

Material och metoder

beredning och lagring av kinas-hämmare

Inhibitor WP1066 har utvecklats och syntetiseras av Waldemar Priebe och medarbetare vid University of Texas MD Anderson Cancer Center, och nuvarande lager fördes artighet av Houston Pharmaceuticals Inc, Houston, Texas, USA. Lagren återsuspenderades i Hybri-Max DMSO och lagrades vid -20 ° C. Lagren var endast för engångsbruk, och inte frysas om efter upptining.

In vitro kultur

AGS-celler (ATCC, Manassas VA, USA) celler upprätthölls i komplett medium innehållande RPMI + Glutamax ( Gibco Life Sciences, Invitrogen OR, USA) media kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 50 lU penicillin vid 37 ° C i 5% CO _{2-95% luft.}

Western Blotting

protein~~POS=TRUNC extrakt~~POS=HEADCOMP framställdes med antingen TRIzol reagens (Life Technologies, Vic, Australien) enligt tillverkarens anvisningar och proteinpellets återsuspenderades i 1% natriumdodecylsulfat innehållande 2 mmol /l Na _{3VO 4 eller RIPA buffert. Alikvoter (30 | j, g) utsattes för natriumdodecylsulfat /polyakrylamidgelelektrofores. Membranen blockerades och inkuberades vid 4 ° C över natten i skummjölk med följande antikroppar; STAT3, py (705) STAT3, ERK1 /2, Pt (202), Y (204) ERK1 /2, AKT, PS (473) AKT, JAK2, py (1007), Y (1008) JAK2 (cellsignalering,Α2,Α4S,Α1,Ύ2Ƶ7,Ο2,ƕ8,ŷ2,ŷ1,ł9,Ź1), GAPDH (Abcamδ5). Membran inkuberades med peroxid-konjugerad sekundär antikropp (Dako, polyklonal svin anti-kanin, HRP-konjugerad, # P0399) och visualiserades genom förstärkt kemiluminescens (Amersham, Buckinghamshire, UK). För analys band kvantifierades med användning av Quantity One programvarusystemet (Biorad) och fosforylerade proteiner som uttrycks som en andel av GAPDH från ett duplikat membran. Minst n = bedömdes 8 prover antingen behandling.}

cellräkning av Haemocytometry

Celler såddes vid 5 x 10 ^{4 celler /ml i 24-brunnsformat i fullständigt medium och fick växa ostört under 24 timmar. Celler behandlades med den lämpliga koncentrationen av WP1066 eller DMSO som kontroll för 0-360 min. Efter behandlings cellerna rubbas genom behandling med trypsin-EDTA 0,25% (Sigma), färgades med trypan-blått 0,4% (Sigma) vid en 1:01 spädning i 5 minuter vid 4 ° C, och räknades på en hemocytometer.}

karboxifluorescein diacetat succinimidylester (CFSE) Färgning

För att märka AGS celler med CFSE, cellerna rubbas genom behandling med trypsin-EDTA 0,25% (Sigma) och återsuspenderades i förvärmd PBS /0,1% BSA vid en densitet 1 × 10 ^{6 celler /ml. 10 mM CFSE färgämne (Invitrogen) framställdes enligt tillverkarens protokoll, då 5 ul /ml tillsattes och blandades noggrant genom att vända för att säkerställa homogen märkning av celler. Proverna inkuberades vid 37 ° C i 10 minuter, släcktes genom tillsats av 5 volymer iskall medier och inkuberades under 5 minuter på is. Prover tvättades sedan 5 gånger i media och ströks på 2 x 10 5 celler /brunn (6-brunnsplattor). Ett prov av celler togs efter plätering och märktes med 100 | j, g /ml propidiumjodid (PI) och analyserades med flödescytometri för likformighet och intensiteten i märkningen. Celler odlades sedan i fullständigt medium under 48 h varefter de som behandlats med eller utan lämplig WP1066 (5 ^ M) vid 37 ° C med 5% CO _{2 95% luft under 18 timmar. Cellerna trypsiniserades såsom ovan och återsuspenderades i fullständigt medium, märkt med 100 | j, g /ml PI, och analyserades genom flödescytometri på 488 nM. Data registrerades med hjälp av BD FACS diva (BD Biosiences) programpaket och analyserades med Modfit LT programvarupaket (VSH).}}

Annexin V Färgning

AGS celler odlades i fullständigt medium vid 2 x tio ^{5 celler /brunn i 6-brunnsplattor med DMSO (bärare kontroll), eller WP1066 (5 M), eller etoposid (200 iM, positiv kontroll) vid 37 ° C med 5% CO _{2 95% luft ostört under 24 timmar. Cellerna behandlades sedan på följande sätt; tvättas i iskall PBS, trypsiniserades enligt ovan, och celldensiteten bestämdes genom haemocytometry före resuspension i Annexin bindningsbuffert till 1 x 10 6 celler /ml. 100 pl av denna framställning togs, och odlades med 5 pl av komponent A (Annexin Fluor 488 annexin V komponent, 25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, 0,1% bovinserumalbumin) och 1 pg /ml av PI under 15 minuter vid rumstemperatur i mörker. Prover blandades sedan med 400 pl av Annexin bindningsbuffert och analyserades med flödescytometri. Lämpliga kontroller +/- reaktionskomponenterna var beredda att justera för partiskhet i grind. Data registrerades med hjälp av BD FACS diva (BD Biosiences) programpaketet.}}

Etik Statement

Alla djurförsök utfördes i enlighet med den australiensiska koden för skötsel och användning av djur för vetenskapliga ändamål (7 ^{e upplagan), och efter godkännande från Murdoch barnens Research Institute Animal etikkommitté (ansökan # A583). Alla ansträngningar gjordes för att minimera obehag i dessa minimalt invasiva procedurer.}

In vivo
Experiment

gp130 ^{757F /F möss har tidigare beskrivits [23]. I korthet, diskreta antral tumörer utvecklas genom 4 veckors ålder och växa snabbt till omkring 12 veckor. De sammanfatta utvecklings egenskaperna hos intestinal-typ magcancer, inklusive submukosala invasion men inte metastasera [24]. Djuren inhystes i en SPF anläggningen vid Murdoch Barnens Research Institute och bekräftats vara fri från Helicobacter pylori
. Tre grupper av möss bedömdes med avseende på tumörutveckling: 1) 8 veckor gamla gp130 757F /F-möss som ej erhållit någon behandling (n = 10); 2) gp130 757F /F möss som fått WP1066 från 8 till 10 veckors ålder (n = 10); och 3) gp130 757F /F möss som fick DMSO fordon från 8 till 10 veckors ålder (n = 8). Före experimente alla djur bedömdes för välbefinnande, vägdes och behandlingsvolymer beräknas därefter. Kontrolldjur erhöll ekvivalenta volymer av DMSO-vehikel till WP1066-behandlade djur. Mössen fick 2 inledande intraperitoneal injektioner av WP1066 vid 10 mg /kg var 48 timmar för att acklimatisera dem till effekterna av behandling, sedan fick 5 injektioner av WP1066 vid 20 mg /kg var 48 timmar för att slutföra två veckors regim. Intraperitoneal injektionsställen varvades genom fyra kvadranter i buken hos möss. Vid slutet av experimentet, möss avlivas, och magar opererande för fotografering och vävnadssamling.}

Makroskopisk och Histologisk bedömning

Magar dissekerades snabbt längs den mindre krökningen, nålas ut, fotograferade och fixerades i 4% buffrad paraformaldehyd före bearbetning. Paraffinsektioner (4 | j, m) färgades med hematoxylin och eosin (H & E). Morfometrisk analys utfördes med användning av öppen källkod ImageJ programvara (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). För mätningar i området, var bilder av magslemhinnan manuellt beskrivs med programvaran ritverktyget och kvantifiering program som används för att generera mätningar

In vivo
Immunohistokemi &. Kvantifiering

Immunhistokemisk analys utfördes med antikroppar för Ki-67 (PharmingenȦ609) och aktiverad kaspas 3 (Cell Signal TechnologyϤ1). Antigenåtervinning utfördes genom kokpunkts sektioner under 30 minuter i 10 mM citronsyra (pH 6,0). Färgning avslutades med lämpliga artspecifika biotinylerade sekundära antikroppar (Dako, Danmark), avidin och biotinylerat pepparrotsperoxidas makromolekylära komplex (Vector Laboratories, Burlingame, CA), 3,3'-diaminobensidin (Sigma, St Louis, MI) och motfärgades med hematoxylin. För Ki-67 kvantifiering, en förblindad observatör räknade antalet färgade celler per körtel i flera sektioner per djur med ImageJ som tidigare. Data uttrycktes som antalet Ki-67-positiva celler per körtel. För aktiverad kaspas 3 kvantifiering, räknade en förblindad observatör antalet färgade celler per område av slemhinnan i 4 slumpmässiga områden av väl orienterad antrum per djur med ImageJ som förut. Data uttrycktes som antalet aktiverade kaspas 3 positiva celler per område av slemhinnan

Semi-kvantitativ morfometrisk analys av inflammation

Inflammation bedömdes med hjälp av mikroskopi i blint på H &. E-färgade sektioner. Antral tumörvävnader analyserades och ett minimum av 3 remsor per djur (n = 7) fick en semi-kvantitativ poäng i enlighet med graden av inflammatoriska celler från minimum = 0 till max = 3. Lymphoplasmocytic och polymorfonukleära infiltratet bedömdes oberoende av varandra. Medelvärdena jämfördes sedan för statistisk analys.

Real-Time (Q) -PCR Analys

RNA extraherades med TRIzol-reagens (Life Technologies, Vic, Australien) i enlighet med tillverkarens instruktioner. Totalt RNA (3 pg) transkriberades omvänt till cDNA med användning av Moloney murint leukemivirus omvänt transkriptas (Promega, Madison, WI) primades med 0,3 ^ g oligo (dT). Q-PCR-primrar utformades med användning av PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems) (tabell 1). SYBR grön kemi (Applied Biosystems) användes med L32 som normaliserare. PCR-betingelserna var 95 ° C i 10 min, därefter 40 cykler av 95 ° C under 15 sek och 60 ° C under 15 sek; reaktionerna kördes på en Applied Biosystems AB7500 RT PCR-maskin. Resultaten analyserades med användning av sekvensdetektorn programvara, och relativa faldiga skillnader bestämdes med användning av ΔΔCt metod som beskrivits av tillverkaren.

Statistisk analys

Data uttrycktes som medelvärde ± standardfel för medelvärdet . Värden som erhållits från kvantitativ analys av genuttryck eller antalet färgade celler jämfördes mellan proverna genom ANOVA, och där en statistiskt signifikant skillnad hittades enskilda grupper analyserades ytterligare med den lämpliga parametriska eller icke-parametrisk statistik med användning av Sigmastat statistisk paket. Statistisk signifikans definierades som p≤0.05.

Resultat

WP1066 snabbt undertrycker Fosforylerad Y (705) STAT3 och inducerar fosforylering av ERK1 /2 i AGS Cells

JAK- STAT vägen och ERK1 /2 vägen är de två stora signaltransduktionsvägar nedströms gp130. Dessa två vägar har ömsesidiga och inversa reglerande effekter på varandra, demonstreras bäst av den negativa regleringen av pSTAT3 efter ERK1 /2-aktivering [47].

WP1066 dos-responsexperiment genomfördes genom behandling av AGS-celler med 0 , 1, 2 eller 5 pM WP1066 under 60 min och mätning av fosforylering av JAK2, STAT3, ERK1 /2 och SHP-2. Som väntat pJAK2 starkt hämmas av WP1066 vid alla testade koncentrationer och av > 80% vid 5 | iM. 5 | iM WP1066 gav också maximal hämning av pSTAT3 och ömsesidig aktivering av pERK1 /2 (Fig. 1 A) med en minskning av den totala STAT3 på 5 ^ M, eller högre koncentrationer (data ej visade). Sammanfaller med ökningen av Perk, pSHP2 aktivering dosberoende förhöjas efter WP1066 administrering (Fig. 1A).

För tidsförloppsstudier, AGS-celler behandlades under 0-360 min med 5 | iM WP1066 och fosforylering av JAK2, STAT3, ERK1 /2 och SHP-2 analyserades med Western blotting (Fig. 1B). WP1066 behandling resulterade i en snabb hämning av pJAK2, med en minskning 75% av 30 min och en maximal 90% minskning med 60 min. Därefter återhämtade cellerna och återvände till basal JAK2 fosforylering av 360 min. Mönstret av minskad STAT3-aktivering speglas det av JAK2 fosforylering. Däremot var ERK1 /2 fosforylering markant som svar på WP1066 behandling, med en ökning 250% av 15 minuter, och en maximal ökning 460% med 60 minuter, innan han återvände till basala nivåer av 360 min. SHP2 aktivering följde noga förändringar i ERK uttryck med maximal induktion vid 60 min.

WP1066 inhiberar AGS Tillväxt genom bekämpande av spridning och induktion av apoptos

Aktiverad STAT3 är en etablerad förare av human gastrisk cancercell tillväxt och spridning [5], och långvarig aktivering av ERK1 /2 inducerar apoptos av gastric epitelceller [25]. Efter att ha visat att WP1066 reglerar STAT3 och ERK1 /2 signalering i ett ömsesidigt sätt undersökte vi om det också kan störa cellväxt och inducerar apoptos hos AGS-celler.

Behandling av AGS-celler med 5 ^ M WP1066 (Fig. 2A ) resulterade i en avsevärd minskning av antalet celler i förhållande till DMSO kontroller (DMSO; 100% ± 3,14 vs. WP1066, 36,02% ± 3,18, p < 0,05). För att bestämma om denna minskning av antalet celler berodde på förändrad celltillväxt eller apoptos, eller en kombination av båda, var CFSE och Annexin V färgning utfördes på behandlade celler. AGS-celler som behandlats med WP1066 var mer intensivt märkta med CFSE än de som behandlades med DMSO, tecken på minskat antal celldelningar och därför proliferation (Fig. 2B). Dessutom genomfördes en större andel av AGS-celler behandlade med WP1066 märkt med Annexin V (figur 2C) jämfört med celler behandlade med DMSO, vilket visar att den WP1066 också inducerad apoptos i AGS-celler (WP1066; 1,3-faldig ökning, p = 0,049).

WP1066 Blocks gastric tumör~~POS=TRUNC gp130 ^{757FF möss genom undertryckande av tumörcelltillväxt och förbättring av apoptos}

gp130 ^{757FF möss utvecklar distala magen tumörer som kännetecknas av förhöjda gastrisk IL-11 driven STAT3-aktivering [12], [13]. Eftersom pJAK2 och p-STAT3 blockeras av WP1066 In vitro
, testade vi huruvida WP1066 också skulle blockera gastric tumörutveckling In vivo
. Behandling av gp130 757FF möss 3 gånger i veckan under 2 veckor med 10-20 mg /kg WP1066 signifikant reducerad gastrisk tumörtillväxt med 47% från 42.11 ± 3,21 mm 2 till 22.36 ± 3,64 mm 2 ( p. < 0,05) (figur 3A-D). DMSO behandlade tumörerna var inte skiljer sig från tumörer observerades hos 8 veckor gamla möss, den ålder då WP1066 behandling påbörjats, vilket bekräftar att gastric tumörtillväxt är relativt stabil från 8-10 veckor [27], och att WP1066 behandling faktiskt orsakar tumörregression snarare än stasis (Fig. 3A-D).}

för att bestämma om spridning har ändrats i gastriska tumörer, Ki-67 positiva celler /körtel kvantifierades i den behandlade kohorten. WP1066 behandling signifikant reducerad gastrisk epitelcellsproliferation (DMSO 62 ± 7,7 vs. WP1066 41,6 ± 6,5 Ki-67 färgade celler /körtel, p < 0,05; Fig. 3E-G) visar att WP1066 kan hämma tumörtillväxt genom hämning av celltillväxt. För att bedöma effekterna av WP1066 på tumörcellapoptos, ades sektioner från den WP1066 eller DMSO-behandlade kohorter färgades med en antikropp mot kluvna kaspas 3, en markör för apoptotisk celldöd (fig. 3H, I). Det var betydligt mer apoptotiska profiler i WP1066 behandlade tumörer än kontroller, visar en tydlig pro-apoptotiska effekten av WP1066 (WP1066 25,25 ± 5,32 vs DMSO 2,65 ± 0,76 färgade celler /mm ^{2 slemhinna, p < 0,05; Fig. 3J ).}

WP1066 Mål Specifikt JAK2 och STAT3 Fosforylering till bekämpande Gastric tumörbildning i gp130 ^{757FF möss}

Eftersom gp130 ^{757FF möss utvecklar tumörer som svar på konstitutiv gp130 aktivering [20] undersökte vi om WP1066 tryckt nedströms signalvägar in vivo.
WP1066 behandling för 2 veckor resulterade i en 25% minskning av den relativa mängden av total STAT3 i antral slemhinnan jämfört med DMSO behandlade grupperna (Fig. 4A) . Mängden totala JAK2, AKT och ERK1 /2 ändrades inte av WP1066 behandling. Detta tyder på att kronisk behandling av gp130 757FF möss med WP1066 undertrycker expression av STAT3.}

Immunoblotanalys för signaleringsaktivering visade en signifikant minskning av pJAK2 (80,12% ± 5,70 av DMSO kontroll), pY705 STAT3 (26,84 % ± 7,2 DMSO kontroll, Fig. 4B) och pERK1 /2 (72,66% ± 5.23.of DMSO kontroll, Fig. 4B). AKT fosforylering ändrades inte av WP1066 behandling. Minskad aktivering av JAK2 och STAT3 är förenlig med In vitro
data och kända effekterna av WP1066.

WP1066 Undertryckta det inflammatoriska svaret i Antral slemhinna gp130 757FF Möss

Eftersom en kronisk inflammatorisk respons i magen är avgörande för tumörutveckling [27] undersökte vi om en del av verkningssättet för WP1066 är att undertrycka STAT3-förmedlade inflammatoriska svaret, som normalt bidrar till tumörprogression. Histologisk analys visade att polymorfonukleär infiltration i antrum av WP1066 behandlade möss var signifikant lägre än i kontrollmössen (figur 5A;. DMSO 2,45 ± 0,24 vs WP1066 1,46 ± 0,22, p < 0,05), medan lymphoplasmocytic infiltrat var inte annorlunda mellan de två grupper (Fig. 5B, DMSO 1,73 ± 0,16 vs WP1066 1,32 ± 0,20, p > 0,05).

Eftersom gastric inflammation typiskt förmedlas av ett litet antal nyckel proinflammatoriska cytokiner och enzymer, mätte vi uttrycket av en utvald grupp av dessa genom Q-PCR i DMSO och WP1066-behandlade magar. Expression av alla pro-inflammatoriska mediatorer med undantag av IFNy, TNFa och iNOS signifikant hämmas av WP1066 behandling enligt följande; IL-6 (Fig. 5C; 6,0 ± 2,6-faldig), IL-11 (figur 5D,. 8,7 ± 3,4-faldig), IL-1α (fig 5E,. 10,9 ± 4,3) faldigt), IL-1β (fig 5F.; 3 ± 0,9-faldig) och COX-2 (figur 5G,. 2,94 ± 1,05). Därför WP1066 hämning av STAT3 aktivitet och tumörprogression berodde delvis på minskad polymophonuclear infiltration och minskad STAT3-beroende transkription av pro-inflammatoriska IL-6, IL-11, IL-1a, IL-1p och COX-2-gener.

WP1066 inhiberade expression av Amphiregulin i Antral Mucosa av gp130 ^{757FF Möss}

effekten av WP1066 behandling på expressionen av tillväxtfaktorligander kända för att spela en roll i tillväxten och differentieringen av magen och i utvecklingen av gp130 ^{757FF tumörer bedömdes också. WP1066 inhiberade expressionen av amfiregulin (1,85 ± 0,60-faldigt, s < 0,05), men inte HB-EGF (Fig. 6) i antral mucosa hos behandlade möss. Dessutom magen proliferativa ligand och STAT3-reglerad gen REG1 visade en kraftig hämmande trend efter WP1066 behandling jämfört med DMSO-kontroll antrum (fig 6;. P = 0,069).}

Diskussion

i denna studie visar vi att WP1066 hämmar dosberoende den JAK2 /STAT3 signalväg i humana magcancer (AGS) celler, med åtföljande 60% reduktion av celltillväxt, och en mindre ökning av apoptos. Mekanismen för detta är sannolikt på grund av den dubbla inhiberingen av fosforylerade former av JAK2 och STAT3 därigenom minska STAT3 transkriptionsaktivitet, vilket har visats i flera cancercellinjer inklusive gliom [17], [28], [29], myeloid leukemi [ ,,,0],30], och melanom [20]. Å andra sidan, WP1066 ansökan resulterade i en reciprok ökning av ERK1 /2 aktivering sammanfaller med ökad pSHP2, fosfataset ansvarar för aktivering av ras-/MAP-kinassignalvägen. En liknande observation med avseende på ERK aktivering har gjorts för andra cancercellinjer härledda från njurkarcinom [18], och gliom [28]. Därför kors reglering av STAT3 och ERK-medierad signalering nedströms av IL-6 familjen cytokiner verkar vanligt förekommande i ett intervall av vävnader och cellinjer [31].

WP1066 var effektiv även när det ges in vivo
, där det blockerade STAT3-aktivering (75%) i gp130 ^{757FF mus antral tumörer, och även minskad total STAT3 protein, vilket tyder på att det kan minska uttryck av STAT3
genen i magar av behandlade möss. Detta stöds av förekomsten av konsensusställen för aktiverat STAT3 bindande för STAT3
promotor, med aktivering av STAT3
genen som demonstreras med användning av mutant STAT3
promotor-reporter konstruktioner och EMSA [48] eller Chip-artiklar [49], och föreslår att WP1066 kan hämma autokrin aktivering av STAT3 efter hämning av JAK2 /STAT3 fosforylering.}

som väntat pJAK2 nivåer också reduceras i närvaro av WP1066 i magen. I motsats till effekten av WP1066 in vitro,
ERK1 /2 aktivering i magar WP1066 behandlade möss minskade något. Anledningen till denna skillnad kan vara två-faldigt; För det första, In vivo
exponering för WP1066 var kronisk jämfört med akut exponering In vitro
; För det andra, In vivo
är exponeringen mer komplex med flera potentiella signalvägar som utnyttjar gemensamma signalöverföringsmolekyler. Ändå minskade aktiveringen av JAK2 och STAT3 är i linje med den etablerade roll dessa cytokin /tillväxtfaktor signalering komponenter i magcancer progression [5], [27] och visar att In vivo, Mössor och när den isoleras från effekterna av H. pylori
infektion, är det främst förändrad aktivering av STAT3 och inte ERK1 /2 som är avgörande för tumörutveckling.

i samband med hämning av STAT3 aktivitet, tillämpning av WP1066 för endast 2 veckor in vivo
resulterade i en 50% minskning av tumörområdet tillsammans med en liknande minskning i proliferation mätt med Ki-67 färgning, och en samtidig ökning av tumörcell apoptos mätt genom aktivt kaspas 3 immunfärgning. Denna hämning av tumörtillväxt var parallellt med a > 40% minskning av polymorfonukleära cellantal, och uppreglering av associerade pro-inflammatoriska cytokiner inklusive IL-1α, IL-1 samt COX2, som alla främjar gastriskt tumörbildning. Å andra sidan hade WP1066 ingen effekt på IFNy, TNFa, och iNOS expression i proportion till bristen på minskningen av lymfocyter och makrofager (lymphoplasmocytic infiltration) under behandlingstiden-kurs. Hämningen av IL-1β efter pSTAT3 hämning genom WP1066 är särskilt betydelsefullt, eftersom IL-1β är en viktig reglerare av magsyrasekretion, en potent promotor av tumörtillväxt i en transgen musmodell av magcancer [33], och en integrerad del av NLRP3 inflammasome [32]. IL-11 är känd för att vara en endogen stimulator av antral IL-1β expression via STAT3 [13], och vi har visat här att IL-11 inhiberas av WP1066. Eftersom IL-11 verkar vara uppströms IL-1β i magen, då detta är en rimlig väg för den senares inhibition efter blockad av STAT3-aktivering.

De hämmande effekterna av WP1066 i gp130 ^{757FF musmodell för magcancer, sammanfatta och utvidga resultaten av STAT3 haploinsufficiency genererade genetiskt i samma musmodell [26], liksom användningen av system antisensoligonukleotider mot STAT3 [12], vilket understryker vikten av aktiverade STAT3-signalering för att underlätta gastrisk tumörbildning. Med tanke på vikten av IL-11 för att främja tumör initiering och utveckling [12], [13], och IL-6 för att underlätta lokal polymorfonukleära infiltration [34] i gp130 757FF mus, är det betydelsefullt att WP1066 minskade effektivt uttrycksnivåer av båda cytokiner i samband med återföring av tumörtillväxt. Detta stöder uppfattningen att STAT3 reglerar transkriptionen av både IL-11 och IL-6, möjligen drivs av autokrin återkopplingar, eftersom båda cytokiner företrädesvis utnyttja STAT3 transkription i magen [23].}

REG1 är en allmänt distribuerad medlem av Reg-genfamiljen och en känd gastrisk tillväxtfaktor, som spelar en framträdande roll som en proliferativ och anti-apoptotiska regulator i magen av både möss [26], [35] och människor [36]. Vi har tidigare visat att REG1 är starkt induceras i antral tumörer av gp 130 ^{757FF möss sammanfallande med IL-6 och IL-11 expression, och att haploinsufficiency av STAT3 resulterar i reducerad expression av REG1, vilket tyder på att det är ett STAT3-reglerade genen [26]. Detta har bekräftats i mag cellinjer där IL-11 [37] och IL-6 [36] stimulerade STAT3 fosforylering vilket i sin tur aktiverade REG1 transkription.}

• PLOS ONE: CD147 uttryck i humana Gastric Cancer är associerad med tumörrecidiv och prognos
• PLOS ONE: En MAP3k1 SNP förutsäger överlevnad för magcancer i en kinesiska befolkningen