Plos ONE: Inhibicija JAK2 /stat3 Pathway Zmanjšuje Rak želodca rast in vitro in in vivo

Povzetek

Signal pretvornik in aktivator transkripcije-3 (stat3) je konstitutivno aktivirana v mnogih vrst raka, kadar to spodbuja rast, vnetje, angiogenezo in zavira apoptozo. Pokazali smo, da se stat3 konstitutivno aktivirano v človeškega raka želodca, in da je kronična IL-11-pogon stat3 transkripcijske aktivnosti povzroči želodčne tumourigenesis v gp130 ^{757FF modelu miši razvoja raka želodca. Tukaj bomo pokazali, da zdravljenje ljudi AGS želodčnih rakavih celic z Janus kinaze (JAK) inhibitor WP1066 zvečata in časa, v odvisnosti od zavira stat3 fosforilacijo v povezavi z zmanjšano JAK2 fosforilacije, zmanjšano proliferacijo in povečano apoptozo. Poleg tega uporaba intraperitonealno WP1066 2 tedna, pri gp130 757FF miš naključnega z zmanjšanim JAK2 in stat3 aktivacija v primerjavi z, littermate vehiklom obdelanih kontrolnih živali zmanjša želodčne volumen tumorja za 50%. Želodčnih tumorjev pri WP1066- obdelanih miših se je zmanjšal polimorfonuklearnih vnetje, sovpada z inhibicijo številnih vnetnih citokinov, vključno z IL-11, IL-6 in IL-1β, kot tudi rast faktorjev Reg1 in amphiregulina. Ti rezultati kažejo, da lahko WP1066 blokirati proliferacijo, zmanjšanje vnetja in inducira apoptozo v želodcu tumorskih celicah z zaviranjem stat3 fosforilacije in da so številni citokini in rastni dejavniki, ki pospešujejo rast tumorja želodca ureja mehanizmi stat3 odvisni. WP1066 lahko osnova za prihodnje terapij proti raku želodca}

Navedba. Judd LM, Menheniott TR, Ling H, Jackson CB, Howlett M, Kalantzis A, et al. (2014) Zaviranje JAK2 /stat3 Pathway zmanjšuje želodca Rak Rast In Vitro
in V Vivo
. PLoS ONE 9 (5): e95993. doi: 10,1371 /journal.pone.0095993

Urednik: Rupesh Chaturvedi, Vanderbilt University School of Medicine, Združene države Amerike

Prejeto: 21. januar 2014; Sprejeto: 1. april 2014; Objavljeno: 7. maj 2014

Copyright: © 2014 Judd et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta projekt je bila podprta s sredstvi; NHMRC projekt Avstralija (www.nhmrc.gov.au) donacijaǽ165 NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer.gov) melanom Spore P50 CA093459-06, NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer. gov) možgani Spore 2 P50 CA127001-06. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi. Waldemar Priebe imajo patente in ima finančni interes v razvoju spojine WP1066, kot sledi; W.Priebe, N.Donato, M.Talpaz, S Szymanski I. Fokt, A. Levitzki spojine za zdravljenje proliferativnih bolezni celic. Združuje države patentni prijavi WO /2005/058829 12/01/2004. Upoštevajte tudi, da so avtorji pod spremenjeno izjavo o nasprotujočimi si interesi glede patenta za WP1066, ki jih imajo W. Priebe. Avtorji tudi izjavi, da "to ne spremeni naše spoštovanje PLoS ONE politike o izmenjavi podatkov in materialov".

Uvod

Od sedmih signalov Transducer in aktivator transkripcije (STAT) družinskih članov , stat3 je najbolj konsistentno vpleten v območju skupnih raka pri ljudeh, vključno; pljuč, dojke, jajčnikov, prostate in debelega črevesa [1], [2] [3] [4]. To velja tudi človeškega raka želodca [5] [6] [7], v katerem stat3 aktivacija s kroničnim fosforilacijo v tirozin (Y) bivajo 705 je povezana s povečanim rasti, angiogeneze, invazije in metastaziranja primarnega raka [ ,,,0],6] [7], [8]. Tako lahko zaviranje stat3 transkripcijske aktivnosti v človeškega raka želodca zagotavljajo možne načine za zmanjšanje visoke obolevnosti in podaljša življenjsko dobo med bolniki želodca z rakom po celem svetu.

V odsotnosti funkcionalnih mutacij v genu stat3, zmotno stat3 dejavnost induciramo trdovratna aktivnost od nabavnih tirozin kinaz in /ali unscheduled- ali prekomerno ekspresijo spodbujevalnih ligandov [9], [10], [11]. To je jasno ponazarja v gp130 ^{757F /F modelu miši razvoja raka želodca, pri katerem Phe za Tyr substitucijo na 757 položaj na znotrajcelično kraku IL-6 družine signalizacija gp130 receptor hkrati preprečuje SHP2 in SOCS3 vezavo , kar zavre ras /MAP kinaze signalov, in hiperaktivnih stat3 ga konstitutivni fosforilacije [23] [24] [26]. V zadnjem času so se mi in drugi pokazali, da v želodčnih tumorjev, značilno povečanje transkripcije sovpada s povečanim izražanjem gp130 ligand IL-11 v človeških želodčnega raka in mišjih modelov te bolezni [5], [12], [13]. V slednji IL-6, ni potrebno, vendar IL-11 je nujno potrebna za tumourigenesis [12], [13]. Poleg tega, IL-11 /stat3 Dokazano je, da je pomembno gonilo atrofični gastritis, prvi predrakave lezije na želodcu po kronične okužbe z bakterijo Helicobacter pylori
[14].}

do danes so poročali številni kinaz za indukcijo stat3 dejavnost po vezave liganda /receptorja, vendar le JAK1 in JAK2 račun za stat3 fosforilacijo na docking z IL-11 /gp130 receptor kompleksne [15], in od teh IL-11 /gp130 prednostno veže JAK2 [16]. Te ugotovitve kažejo, da JAK2 and stat3 predstavljajo obetavne tarče za oblikovanje terapevtskih antagonistov zatreti IL-11 /stat3 signalizacije človeškega raka želodca.

Nedavno kavne kisline derivat WP1066, strukturalno nizko potenco tirozin kinaze zaviralec AG490 v , se je izkazalo, da je zelo močan zaviralec JAK2 /stat3 poti v transformirani možganih glioma [17] in ledvičnega raka [18] celičnih linij, ki vodijo do zaviranja rasti in indukcijo klasičnih pro-apoptotskih poti. Poleg tega, WP1066 je učinkovita in vivo
proti visoko malignih melanomov in levkemij, ki so pozitivni za JAK2-V617F + mutacije, ki spodbuja aktivacijo konstitutivni JAK2 kinaze [19] [20] [21] [22 ]. Neobjavljene študije kažejo, da je WP1066 ni inhibitor ATP-konkurenčna in lahko blokira izraz fosforiliranega JAK2 in stat3; Poleg tega lahko p-stat3-Y705 je treba preprečiti neodvisno od stanja JAK2. Tako, WP1066 predstavlja edinstveno priložnost, da zavre tako p-jak in p-stat3, in nato močno blokira JAK2 /stat3 signalno pot in stat3 transkripcijske aktivnosti.

Če želite preizkusiti idejo dvojne blokade JAK2 in aktiviranje stat3 v želodcu in kasnejši želodca razvoj raka, smo uporabili oba in vitro
in in vivo
pristopi k oceni, ali lahko WP1066 upočasni ali blokira želodca rast tumorja z zaviranjem JAK2 /stat3 dejavnosti, in druge tesno povezane onkogenih signalne poti. Tukaj bomo pokazali, da WP1066 učinkovito zavira stat3 fosforilacijo in inducira apoptozo v želodčni rak celične linije, in da lahko zavirajo želodčne rast tumorja in vivo
z blokiranjem indukcijo ključnih-stat3 reguliranih genov.

Materiali in metode

Priprava in shranjevanje inhibitorji kinaz

Inhibitor WP1066 je bila razvita in sintetizirali Waldemar Priebe in sodelavci na Univerzi v Teksasu MD Anderson Cancer Center, in trenutne zaloge je bila dobavljena vljudnost od Houston Pharmaceuticals Inc, Houston, Texas, ZDA. Zaloge smo resuspendirali v Hybri-Max DMSO in shranimo pri -20 ° C. Zaloge so samo za enkratno uporabo, in ne ponovno zamrzniti po odtajanju.

In vitro kultura

AGS celice (ATCC, Manassas VA, ZDA) celice so vzdrževani v popolnih medijih, ki vsebujejo RPMI + Glutamax ( Gibco Life Sciences, Invitrogen OR, ZDA) medijev dopolnjena z 10% fetalnega govejega seruma, 50 ie penicilin pri 37 ° C v 5% CO _{2-95% zraka.}

Western blot

Beljakovinski ekstrakte smo pripravili bodisi TRIzola reagentom (Life Technologies, Vic, Avstralija), v skladu z navodili proizvajalca in beljakovin peletov smo resuspendirali v 1% natrijevega dodecil sulfata, ki vsebuje 2 mmol /l na- _{3VO 4 ali Ripa pufer. Alikvote (30 mikrogramov) izpostavimo natrijev dodecil sulfat /poliakrilamidno gelsko elektroforezo. Membrane so blokirani in inkubirali pri 4 ° C preko noči v posnetega mleka z naslednjimi protiteles; Stat3, Py (705) stat3, ERK1 /2, pT (202), Y (204) ERK1 /2, AKT, pS (473) AKT, JAK2, Py (1007), Y (1008) JAK2 (Cell signalizacijo,Α2,Α4S,Α1,Ύ2Ƶ7,Ο2,ƕ8,ŷ2,ŷ1,ł9,Ź1), GAPDH (Abcamδ5). Membrane smo inkubirali z peroksida konjugirano sekundarnih protiteles (Dako, poliklonalna prašičev proti kunec, HRP konjugirano, # P0399) in vizualiziramo z okrepljenim kemiluminescence (Amersham, Buckinghamshire, UK). Za analizo so bili trakovi količinsko, z uporabo sistema Količina One (BIORAD) in fosforiliranih beljakovin, izražena kot delež GAPDH iz dvojnika membrano. Vsaj n = bilo 8 vzorcev ocenili bodisi zdravljenja.}

Cell štetje s Haemocytometry

celice zasejemo na 5 x 10 ^{4 celic /ml v 24-tudi obliko v popolni medijih in pustimo, da raste pri miru 24 ur. Celice so zdravili z ustrezno koncentracijo WP1066 ali DMSO kot upravljalnik za 0-360 min. Potem ko so bile obdelavo celice odstrani z obdelavo z tripsina-EDTA 0,25% (Sigma), obarvane z trypan modro 0,4% (Sigma) pri razredčitvi 1:1 5 minut pri 4 ° C, in prešteti na haemocytometer.}

karboksifluorescein dIACETAT sukcinimidil ester (CFSE) obarvanje

Za označevanje AGS celice CFSE, celice odstrani z obdelavo z tripsin-EDTA 0,25% (Sigma) in ponovno suspendirali v segreta PBS /0,1% BSA v gostoti od 1 × 10 ^{6 celic /ml. 10 mM CFSE barvilo (Invitrogen) smo pripravili po protokolu proizvajalca, potem 5 ml /ml, dodamo in temeljito zmešamo z inverzijo zagotoviti enotno označevanje celic. Vzorce inkubiramo pri 37 ° C za 10 minut, pogasimo z dodatkom 5 volumni ledeno mrzlega medija in inkubirali 5 minut na ledu. Vzorci so bili nato izperemo 5-krat v medijih in prekrita z 2 x 10 5 celic /jamico (6-tudi jedi). Sprejeta je bila vzorec celic po prevleka in označene z 100 mg /ml propidijevim jodidom (PI) in analizirali s pretočnim citometrom za enotnost in intenzivnosti označevanja. Celice smo nato gojili v popolnem mediju 48 ur, nakar so bili zdravljeni z ali brez ustreznega WP1066 (5 um) pri 37 ° C s 5% CO _{2 95% zraka 18 ur. Celice smo nato trypsinised kot zgoraj in ponovno suspendirali v popolnem mediju, označeni z 100 mg /ml PI in analiziramo s pretočno citometrijo na 488 ηM. So bili shranjeni podatki z BD FACS divo (BD Biosiences) programski paket in analizira Modfit LT programski paket (VSH).}}

aneksina barvanjem

AGS celice gojimo v popolni medijev na 2 × 10 ^{5 celic /dobro 6 vdolbinami z DMSO (kontrolni nosilec) ali WP1066 (5 uM), ali etopozid (200 uM; pozitivni kontroli) pri 37 ° C s 5% CO _{2 95% zrak posega 24 ur. Celice smo nato obdelali, kot sledi; izperemo v ledeno mrzlo PBS, trypsinised kot zgoraj, in gostoto celic določi haemocytometry pred resuspendiranjem v aneksinom vezave pufru do 1 x 10 6 celic /ml. je delo 100 ul te priprave, ter inkubirali s 5 ul iz komponente A (aneksin Fluor 488 aneksina V komponenti, 25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, 0,1% govejega seruma albumina) in 1 ug /ml PI 15 minut pri sobni temperaturi v temi. Vzorce smo nato zmešamo s 400 ul z aneksinom vezave pufra in analiziramo s citometrije toka. Ustrezne kontrole +/- reakcijske komponente bili pripravljeni prilagoditi za pristranskost v osvetlitve. So bili shranjeni podatki z BD FACS divo (BD Biosiences) programski paket.}}

Etika Izjava

Vsi poskusi na živalih so bile izvedene v skladu z avstralskim kodeksom za oskrbo in uporabo živali v znanstvene namene (7 ^{th izdaja), in po odobritvi odbora Murdoch Otroško raziskovalnega inštituta živali etiko (uporaba # A583). Vsa so bila prizadevanja za zmanjšanje nelagodje v teh minimalno invazivnimi posegi.}

V vivo
Poskusi

gp130 ^{757F /F miši so bile že opisane [23]. Na kratko, diskretne antralnih tumorji razvijejo do 4. tedna starosti in hitro rastejo do približno 12 tednov. Ti povzamemo razvojne značilnosti intestinalnega tipa adenokarcinomom želodca, vključno Submukozno invazije, vendar ne metastasise [24]. Živali so bile nastanjene v objektu SPF po izbiri Murdoch Otroški Research Institute in potrdili, da so brez Helicobacter pylori
. Tri skupine miši so bili ocenjeni za razvoj tumorjev: 1) 8 tednov stare gp130 757F /F miši, ki so prejele nobenega zdravljenja (n = 10); 2) gp130 757F /F miši, ki so prejele WP1066 od 8 do 10 tednov (n = 10); in 3) gp130 757F /F miši, ki so prejele DMSO vozilo od 8 do 10 tednov (n = 8). Pred eksperimentom vse živali so bile ocenjene za dobro počutje, stehta in obseg zdravljenja ustrezno izračunati. Kontrolne živali enakovredne količine DMSO vozila, WP1066-zdravljenih živali. Miši prejel 2 začetne intraperiotnealni injekcije WP1066 pri 10 mg /kg vsakih 48 ur, da jih privadi na učinke zdravljenja, nato pa prejela 5 injekcij WP1066 pri 20 mg /kg vsakih 48 ur za dokončanje režim za 2 tedna. Intraperiotnealni mesta vbrizgavanja so izmenjaje preko štirih kvadrantih trebuha miši. Ob koncu poskusa smo žrtvovati miši in želodci resekcija za fotografije in tkiv zbirko.}

Makroskopski in histološki Ocena

Želodci hitro razrežemo po manjši ukrivljenosti, zabodena ven, fotografirali in določen v 4% zastalega paraformaldehid pred obdelavo. Parafin odseki (4 um) smo obarvali s hematoksilinom in eozinom (H &E). Morfometrična Analiza je bila izvedena z uporabo odprtokodne ImageJ programska oprema (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). Za meritve površin, so podobe želodčne sluznice ročno predstavil z orodjem programske opreme za risanje in programom kvantifikacije, ki se uporablja za ustvarjanje meritve

V vivo
Imunohistokemija &.; Količinska

Imunohistokemijsko analiza je bila opravljena s protitelesi za Ki-67 (PharmingenȦ609) in aktivira kaspaze 3 (Cell Signalizacija TechnologyϤ1). Antigen Preiskovalna smo izvedli z vreliščem odsekov 30 minut v 10 mM citronske kisline (pH 6,0). Obarvanje je bila zaključena z ustreznimi vrste specifičnih biotiniliranih sekundarnih protiteles (Dako, Danska), avidina in biotiniliranega hrenovo peroksidazo makromolekularnega kompleks (Vector Laboratories, Burlingame, CA), 3,3'-diaminobenzidine (Sigma, St. Louis, MI) in jih nasprotno z hematoksilin. Za Ki-67 kvantifikacijo, prikritega opazovanja prešteti število obarvanih celic na žleze v več oddelkov na žival s pomočjo ImageJ kot prej. Podatki bila izražena kot število Ki-67 pozitivnih celic na žleze. Za aktivnega kaspaze 3 količinsko, prikritega opazovalec prešteti število obarvanih celic na površino sluznice v 4 naključnih področjih dobro usmerjene antruma na žival uporabo ImageJ kot prej. Podatki so izraženi kot število aktivirajo kaspaze 3 pozitivne celice na območju sluznice

Semi-kvantitativno Morfometrična Analiza vnetja

Vnetje je bila ocenjena s pomočjo mikroskopije v slepi način za H &. E-obarvajo sekcije. Antralnih tumor tkiva smo analizirali in najmanj 3 trakov na žival (n = 7), so imele semikvantitativno rezultat glede na stopnjo vnetnih celic od najmanjšega = 0 do maksimalne = 3. Lymphoplasmocytic in polimorfonuklearnih infiltrata bila ocenjena neodvisno. Povprečne vrednosti so bile nato primerjali za statistično analizo.

Real-Time (Q) -PCR Analiza

RNA je bila vzeta s TRIzola reagentom (Life Technologies, Vic, Avstralija) v skladu z navodili proizvajalca. Total RNA (3 mikrogramov) je bila reverzno prepisana na cDNA uporabo Moloney virus mišje levkemije reverzne transkriptaze (Promega, Madison, WI) napolniti z 0,3 mikrogramov oligo (dT). Q-PCR so namenjeni uporabi PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems) (tabela 1). SYBR zelena kemija (Applied Biosystems), je bila uporabljena z L32 kot Normalizer. Pogoji PCR so bili 95 ° C za 10 minut, nato 40 ciklov 95 ° C za 15 sekund in 60 ° C za 15 sekund; Reakcije smo izvedli na Applied Biosystems AB7500 RT PCR stroj. Rezultati so bili analizirani s pomočjo zaporedje detektor programsko opremo, in relativne krat razlike smo določili po metodi ΔΔCt po podatkih proizvajalca opisan.

Statistična analiza

Podatki so izražene kot povprečje ± standardna napaka srednje vrednosti . Vrednosti, dobljene kvantitativne analize izražanja genov ali število obarvanih celic smo primerjali med vzorci, ki jih ANOVA, in kjer je bila ugotovljena statistično pomembna razlika so posamezne skupine dodatno analizirali z ustrezno parametra ali ne-parametrične statistike s pomočjo statističnega paketa Sigmastat. Statistična značilnost je bila opredeljena kot p≤0.05.

Rezultati

WP1066 hitro Zavira fosforilirata Y (705) stat3 in povzroča Fosforilacija ERK1 /2 v letnem pregledu rasti celic

JAK- STAT pot in pot ERK1 /2 sta dve glavni poti prenos signala v smeri toka od gp130. Ti dve poti imajo vzajemne in inverznih regulatorne učinke na drug drugega, najbolje kaže v negativni ureditvi pSTAT3 po ERK1 2 aktivaciji /[47].

WP1066 poskusi odmerkom in odzivom so bile izvedene z obdelavo AGS celice z 0 , 1, 2 ali 5 uM WP1066 60 minut in merjenjem fosforilacije JAK2, stat3, ERK1 /2 in SHP-2. Kot je bilo pričakovati, je pJAK2 močno zavira WP1066 na vseh testiranih koncentracijah in s > 80% na 5 um. 5 uM WP1066 je tudi maksimalno zaviranje pSTAT3 in vzajemno aktiviranje pERK1 /2 (sl. 1A) z zmanjšanjem celotne stat3 na 5 um, ali višjih koncentracijah (podatki niso prikazani). Sovpada s povečanjem Perk, aktivacija pSHP2 je v odvisnosti od odmerka okrepljeno po WP1066 uprave (sl. 1A).

Za študij časovno seveda, AGS celice so zdravili 0-360 min s 5 iM WP1066 in fosforilacijo za JAK2, stat3, ERK1 /2 in SHP-2 smo analizirali z Western blot analiza (sl. 1B). Zdravljenje WP1066 privedlo do hitrega zaviranja pJAK2, s 75% padec za 30 minut in največ 90% padec za 60 min. Nato celice opomogel in se vrnil na bazalno JAK2 fosforilacije za 360 min. Vzorec zmanjšala aktiviranje stat3 zrcalil na JAK2 fosforilacije. V nasprotju s tem je ERK1 /2 fosforilacija odziv na zdravljenje WP1066 izrazito povečala, s 250% povečanje za 15 min in maksimalno 460% povečanje za 60 minut, preden se vrnejo v bazalnih ravni za 360 min. Aktivacija SHP2 pozorno spremljati spremembe v ERK izražanja z maksimalno indukcijo pri 60 min.

WP1066 zavira AGS Rast z zatiranju širjenju in indukcijo apoptoze

Aktivira stat3 je uveljavljen gonilo človeške želodčne celice raka rast in širjenje [5], ter dolgotrajno aktiviranje ERK1 /2 inducira apoptozo epitelijskih celic želodca [25]. Ker je dokazano, da WP1066 ureja stat3 in ERK1 /2 signalizacije na vzajemen način, smo preizkusili, ali lahko motijo ​​tudi rast celic in inducira apoptozo AGS celic.

Zdravljenje AGS celic s 5 iM WP1066 (sl. 2A ) je povzročilo znatno zmanjšanje števila celic glede na DMSO kontrole (DMSO 100% ± 3.14 vs. WP1066; 36.02% ± 3,18, p < 0,05). Da ugotovi, ali je bilo to zmanjšanje števila celic zaradi proliferacijo spremenjeno celično ali apoptozo, ali s kombinacijo obeh, je CFSE in aneksin V. obarvanje izvaja na obdelanih celicah. AGS celice, ki se zdravijo z WP1066 so bolj intenzivno označeni z CFSE kot pri bolnikih, zdravljenih z DMSO, dokazi o zmanjšanem številu mobilnih oddelkov in s tem širjenje (sl. 2B). Poleg tega so večji del AGS celic, ki so se zdravili z WP1066 označena z aneksinom V (slika 2C) v primerjavi s celicami, zdravljenih z DMSO, kar dokazuje, da je WP1066 tudi inducirano apoptozo v AGS celic (WP1066, 1,3-kratno povečanje; p = 0,049).

WP1066 Bloki želodca tumorja rast gp130 ^{757FF miši s zatiranju tumorsko celično proliferacijo in Okrepitev apoptoze}

gp130 ^{757FF miši razvijejo distalni želodca značilni povišani želodčni IL-11 usmerjenih aktiviranje stat3 [12], [13]. Ker so pJAK2 in p-stat3 blokira WP1066 in vitro
, smo preizkusili, ali bi WP1066 tudi blokirajo razvoj tumorja želodca in vivo
. Zdravljenje gp130 757FF miši, 3-krat na teden za 2 tedna z 10-20 mg /kg WP1066 bistveno zmanjšano želodca tumorske rasti za 47%, od 42.11 ± 3.21 mm 2 do 22.36 ± 3.64 mm 2 ( p. < 0,05) (slika 3A-D). DMSO zdravijo tumorji niso razlikovale, da tumorjev opazili pri starih miših 8 teden, starost, pri kateri zdravljenje WP1066 začela, potrjuje, da je v želodcu rast tumorja relativno stabilna od 8-10 tednov [27], in da zdravljenje WP1066 dejansko povzroči regresijo tumorja ne Stand (sl. 3A-D).}

Da bi ugotovili, ali je bil širjenje spremenjen v želodčnih tumorjev, Ki-67 pozitivne celice /žleze je bilo izmerjenih v obdelanem kohorti. Zdravljenje WP1066 bistveno zmanjša želodčne proliferacijo epitelijskih (DMSO 62 ± 7,7 vs. WP1066 41,6 ± 6,5 Ki-67 obarvane celice /žlez, p < 0,05;. Slika 3E-G), ki dokazujejo, da WP1066 lahko zavirajo rast tumorjev z inhibicijo celične proliferacije. Za oceno učinkov WP1066 na tumorskih celic apoptoze, so sekcije iz WP1066 ali DMSO zdravijo kohorte obarvali s protitelesom proti cepljen kaspaze 3, ki je označevalec apoptotske celične smrti (sl. 3 H, I). Bilo je precej bolj apoptotske profili tumorjev-WP1066 obravnavajo kot nadzora, kar kaže na jasno pro-apoptotske učinek WP1066 (WP1066 25.25 ± 5.32 vs DMSO 2,65 ± 0,76 obarvanih celic /mm ^{2 sluznica, p < 0,05;. Slika 3J ).}

WP1066 posebej tarče JAK2 in stat3 fosforilacije za zatiranje želodčnih Tumourigenesis v gp130 ^{757FF Miške}

Ker gp130 ^{757FF miši razvoj tumorjev v odgovor na konstitutivni aktivacijo gp130 [20] smo preizkusili, ali WP1066 zatreti nižji stopnji signalne poti in vivo.
zdravljenje WP1066 2 tedna povzročilo zmanjšanje za 25% v relativni višini celotne stat3 v antralnih sluznici v primerjavi z DMSO zdravljenih skupinah (sl. 4a) . Znesek celotne JAK2, AKT in ERK1 /2 ni bila spremenjena z obdelavo WP1066. To pomeni, da kronično zdravljenje gp130 757FF miši z WP1066 zavira izražanje stat3.}

analiza Imunoblot signalnih aktivacijo pokazala znatno zmanjšanje pJAK2 (80,12% ± 5,70 nadzora DMSO), pY705 stat3 (26.84 % ± 7,2 nadzora DMSO;. slika 4B) in pERK1 /2 (72,66% nadzor ± 5.23.of DMSO;. slika 4B). AKT fosforilacija ni bila spremenjena z obdelavo WP1066. Zmanjšana aktivacija JAK2 in stat3 je v skladu s in vitro
podatkov in znane dejanja WP1066.

WP1066 zatrl vnetnega odziva v antralnih sluznici gp130 757FF Miške

Ker je kronični vnetni odziv želodca ključnega pomena za tumorja razvoj [27], smo preizkusili, ali je del načina delovanja WP1066 zatreti-stat3 posredovane vnetni odziv, ki običajno pripomore k napredovanja tumorja. Histološka analiza je pokazala, da je bila polimorfonuklearnih infiltracija v antruma za WP1066 obdelanih miših bistveno manj kot pri kontrolni skupini miši (slika 5A;. DMSO 2,45 ± 0,24 vs WP1066 1,46 ± 0,22, p 0.05), medtem ko lymphoplasmocytic infiltrat ne razlikuje med dvema skupine (. slika 5B; DMSO 1,73 ± 0,16 vs WP1066 1,32 ± 0,20, p > 0,05).

Ker je vnetje želodca običajno poteka z majhnim številom ključnih pro-vnetnih citokinov in encimov smo merili izražanje izbrane skupine le-teh s strani Q-PCR v DMSO in-WP1066 obdelani želodci. Izraz vseh vnetnih mediatorjev, z izjemo IFNy, TNFa in iNOS so znatno inhibiran z obdelavo WP1066, kot sledi; IL-6 (. Slika 5C, 6,0 ± 2,6-krat), IL-11 (Slika 5D,. 8,7 ± 3,4-krat), IL-1α (Slika 5E;. 10,9 ± 4,3) krat), IL-1β (sl 5F.; 3 ± 0,9-krat) in COX2 (slika 5G;. 2,94 ± 1,05). Zato je WP1066 zaviranje stat3 dejavnosti in napredovanja tumorja deloma zaradi zmanjšane polymophonuclear infiltracijo in zmanjša stat3 odvisna od prepis pro-vnetne IL-6, IL-11, IL-1 a, IL-1β in COX2 geni.

WP1066 zaviral Podajanje amphiregulina v antralnih sluznici gp130 ^{757FF Miške}

učinek zdravljenja WP1066 na izražanje rastnega dejavnika ligandov je znano, da igrajo pomembno vlogo pri rasti in diferenciacije v želodcu in pri razvoju gp130 ^{je bila ocenjena tudi 757FF tumorji. WP1066 inhibira ekspresijo amphiregulina (1,85 ± 0,60 krat, p 0.05), vendar ne HB-EGF (slika 6). V antralnih sluznici obdelanih miših. Poleg tega želodec proliferativna ligand in gen-stat3 regulirano Reg1 pokazali močno inhibitorsko trend po zdravljenju WP1066 primerjavi s kontrolno DMSO antruma je (sl 6;. P = 0,069).}

Diskusija

v tej študiji smo dokazati, da WP1066 v odvisnosti od odmerka zavira signalno pot JAK2 /stat3 v želodčni rak (AGS) celicami, kar posledično pomeni zmanjšanje za 60% celično proliferacijo in manjše povečanje apoptoze. Mehanizem za to je verjetno posledica dvojne inhibicijo fosforiliranih oblik JAK2 in stat3 tem zmanjšuje stat3 transkripcijsko aktivnostjo, kot je bilo prikazano več linij rakavih celic, vključno z gliomom [17], [28], [29], mieloično levkemijo [ ,,,0],30] in melanom [20]. Po drugi strani pa WP1066 aplikacija povzročilo vzajemno povečanje ERK1 /2 aktivacijskim sovpada s povečanim pSHP2, fosfataze, odgovorne za aktiviranje ras /MAP kinaze signalnih poti v. Podobno opazovanje v zvezi z aktivacijo ERK je bil dosežen pri drugih rakavih celic linije iz ledvičnega raka [18], in glioma [28]. Zato, cross-regulacija stat3 in ERK posredovano signalizacija dolvodno od IL-6 družinskih citokinov zdi, da se običajno zgodi v razponu tkiv in celičnih linij [31].

WP1066 je bil učinkovit tudi pri jemanju vivo
, kjer je blokirana aktivacijo stat3 (75%) v gp130 ^{757FF miške antralnih tumorjev, pa tudi zmanjšano celotno stat3 protein, kar kaže, da lahko zmanjša ekspresijo stat3
gen v želodci obdelanih miši. To potrjuje obstoj soglasja lokacij za aktivnega stat3 zavezujoč za stat3
promotor, z aktivacijo stat3
gen, kot je prikazano s pomočjo mutant stat3
promotor-reporter konstrukti in EMSA [48] ali čip naslednje [49], in predlaga, da WP1066 lahko zavira avtokrin aktivacijo stat3 po inhibicijo JAK2 /stat3 fosforilacije.}

Kot je bilo pričakovati, raven pJAK2 so se zmanjšale tudi v prisotnosti WP1066 v želodcu. V nasprotju z učinkom WP1066 in vitro,
ERK1 /2 aktivacijo v želodcih iz WP1066 obdelanega miših se je nekoliko zmanjšala. Razlog za te razlike lahko dva krat; prvič, in vivo
izpostavljenost WP1066 je kronična primerjavi z akutno izpostavljenost in vitro
; drugič, izpostavljenost in vivo
je bolj zapletena s številnimi potencialnimi signalnih poti, ki uporabljajo skupno signalov molekule. Kljub temu zmanjšana aktivacija JAK2 in stat3 je v skladu z uveljavljeno vlogo teh citokinov /rastnega faktorja signalne komponente v napredovanje želodčnega raka [5], [27] in dokazuje, da je in vivo,
in ko izolirana od učinki H. pylori
okužba, je predvsem spremenjen aktivacija stat3, in ne ERK1 /2, ki je ključnega pomena za razvoj tumorjev.

sovpada z inhibicijo stat3 aktivnosti, uporaba WP1066 samo za 2 tedna vivo
povzročila 50% zmanjšanje površine tumorja, ki ga spremlja podobno zmanjšanju proliferacije, merjena s ki-67 barvanjem in sočasnim povečanjem tumorskih celic apoptoze kot se meri z aktiviranim kaspaze 3 imunskim barvanjem. To zaviranje rasti tumorja je vzporedno z > 40% zmanjšanje polimorfonuklearnih celic številke in regulaciji navzgor povezanih pro-vnetnih citokinov, vključno z IL-1 a, IL-1β kot tudi COX2, od katerih so vsi spodbujanje želodca tumourigenesis. Po drugi strani pa je imelo WP1066 nobenega vpliva na IFNy, TNFa in iNOS izražanja, ki je sorazmeren s pomanjkanjem zmanjšanja limfocitov in makrofagov (lymphoplasmocytic infiltracije) nad zdravljenja časovnem poteku. Zaviranje IL-1β po inhibicije pSTAT3 ga WP1066 je še posebej pomembna, saj IL-1β je pomemben regulator izločanja želodčne kisline, močan pospeševalec rasti tumorja v transgenih mišjem modelu raka želodca [33], in sestavni del od inflammasome NLRP3 [32]. IL-11 je znano, da je endogeni stimulator za antralnih IL-1β izražanja prek stat3 [13], in smo tukaj pokazali, da je IL-11 zavira WP1066. Ker se zdi, da je višje od IL-1β v želodcu IL-11, potem je to verjetno, pot za inhibicijo slednjega po blokadi aktiviranja stat3.

zaviralni učinki WP1066 v gp130 ^{757FF mouse model raka želodca, ponavljati in razširiti rezultate stat3 haploinsufficiency nastajajo genetsko v isti model miške [26], kot tudi z uporabo sistemskih protismiselnih oligonukleotidov proti stat3 [12], kar poudarja pomembnost aktivnega stat3 signalizacije pri pospeševanju želodca tumourigenesis. Glede na pomen IL-11 pri spodbujanju pričetka tumorja in razvoj [12], [13], in IL-6 pri spodbujanju lokalnega polimorfonuklearnih infiltracijo [34] v gp130 757FF miško, je pomembno, da WP1066 učinkovito zmanjša ekspresijski nivoji obeh citokinov ujema s polov rasti tumorja. To podpira stališče, da stat3 uravnava transkripcijo tako IL-11 in IL-6, po možnosti poganja avtokrinskega povratne zanke, saj obe citokini prednostno uporabiti stat3 prepis v želodcu [23].}

Reg1 je široko razdeli član Reg družini genov in znani želodca rastni faktor, ki igra pomembno vlogo kot proliferativni in anti-apoptotske regulatorja v želodcu miših [26], [35] in ljudi [36]. Prej smo pokazali, da je Reg1 močno inducira v antralnih tumorjev gp130 ^{757FF miši sovpada z IL-6 in IL-11 izražanja, in to haploinsufficiency rezultatov stat3 v zmanjšano izražanje Reg1, kar kaže, da je to stat3 regulirano gen [26]. To je bilo potrjeno v celičnih linijah v želodcu, kjer IL-11 [37] in IL-6 [36] stimuliranih stat3 fosforilacijo kar aktivira Reg1 prepis. Naši trenutni podatki so skladni s temi rezultati, s tem, da WP1066 kaže močan trend zavre Reg1 v želodčnih tumorjev gp130 757FF miške skupaj z IL-6 in IL-11 zaviranja. H.}

• Plos ONE: CD147 Izražanje v humani Rak želodca je povezana s ponovni pojav tumorja in Prognosis
• Plos ONE: A MAP3k1 SNP napoveduje preživetje želodčnega raka v kitajski Population