PLO ONE Inhibicija JAK2 /STAT3 Put smanjuje rak želuca rast in vitro i in Vivo

Sažetak pregled

signala sonde i aktivatora transkripcije-3 (STAT3) konstitutivno aktiviran kod mnogih tipova tumora gdje potiče rast , upala, angiogeneze i inhibira apoptozu. Mi smo pokazali da STAT3 konstitutivno aktiviran ljudskog raka želuca, te kronična IL-11 pokreće STAT3 transkripcijska aktivnost inducira želučani tumourigenesis u gp130 ^{757FF mišjem modelu razvoja raka želuca. Ovdje pokazujemo da tretman humanih stanica AGS rak želuca s Janus kinaze (JAK) inhibitor WP1066 dozi, i vremenski ovisno inhibira fosforilaciju STAT3, u kombinaciji sa smanjenom fosforilacije JAK2, redukcijom proliferacije i povećana apoptoze. Osim toga, primjena intraperitonealnim WP1066 kroz 2 tjedna, smanjeni volumen želuca tumora za 50% u gp130 757FF miš poklapa sa smanjenim aktiviranjem JAK2 i Stat3 odnosu tretirane nosačem, braću iz legla, kontrola. Želučanih tumora tretiranih miševa WP1066- smanjile polimorfonuklearnih upala, podudara s inhibicijom brojnih proupalnih citokina, uključujući IL-11, IL-6 i IL-1, kao što su čimbenike rasta Reg1 i amfiregulin. Ovi rezultati pokazuju da WP1066 može blokirati proliferaciju, smanjuju upalu i potiču apoptozu u želučanom tumorskih stanica inhibirajući STAT3 fosforilacije, a da su mnogi citokini i faktori rasta koji potiču rast tumora želuca reguliran STAT3 ovisne mehanizme. WP1066 može poslužiti kao osnova za buduće lijekova protiv raka želuca pregled}

Izvor:. Judd LM, Menheniott TR, Ling H, Jackson CB, Howlett M, Kalantzis A, et al. (2014) Inhibicija JAK2 /STAT3 Put smanjuje rak želuca Rast In vitro pregled i In vivo pregled. PLoS ONE 9 (5): e95993. doi: 10,1371 /journal.pone.0095993 pregled

Urednik: Rupesh Chaturvedi, Vanderbilt University School of Medicine, United States of America pregled

Primljeno: 21 siječnja 2014; Prihvaćeno: 1. travnja 2014; Objavljeno: 7. svibnja 2014 pregled

Copyright: © 2014 Judd et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovaj projekt je potpomognut sredstvima iz; NHMRC Australija (www.nhmrc.gov.au) projekt grantǽ165 NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer.gov) melanom sporama, P50 CA093459-06, NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer. gov) mozak sa sporama 2 P50 CA127001-06. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

suprotstavljenih interesa. Waldemar Priebe drže patente i ima financijski interes u razvoju spoja WP1066 kako slijedi; W.Priebe, N.Donato, M.Talpaz, S, Szymanski, I. Fokt, A. Levitzki Spojevi u liječenju staničnih proliferacijskih bolesti. Sjedinjene Države patent WO /2005/058829 12/01/2004. Imajte na umu da su autori dali izmijenjeni iskaz suprotstavljenih interesa u vezi patent na WP1066 održati W. Priebeom. Autori također objavljuje da "to ne mijenja našu pridržavanje PLoS ONE politike na razmjenu podataka i materijala". Pregled

Uvod pregled

Od sedam signala sonde i aktivatora transkripcije (STAT) članova obitelji , STAT3 je najkonzistentnije uključen u rasponu od uobičajenih vrsta karcinoma u ljudi, uključujući; pluća, dojke, jajnika, prostate i debelog crijeva [1], [2], [3], [4]. Ovo je također istinito u ljudskom raka želuca [5], [6], [7] u kojoj STAT3 aktivacija kronične fosforilacije na tirozin (Y) žive 705 je povezan s povećanim rasta, angiogeneze, invazije i metastaziranja primarnog karcinoma [ ,,,0],6], [7], [8]. Prema tome, inhibicija STAT3 transkripcije aktivnosti u ljudskom raka želuca može pružiti mogućih načina smanjenja visokog morbiditeta i produžiti život među oboljelima od raka želuca u svijetu. Pregled

U nedostatku funkcionalnih mutacija u genu STAT3, nenormalna aktivnost STAT3 izazvana je uporna aktivnost od uzvodno tirozin kinaze i /ili unscheduled- ili prekomjerna ekspresija stimulacije liganda [9], [10], [11]. Ovo je jasno prikazano na gp130 ^{757F /F mišji model razvoja raka želuca, u kojoj Phe za Tyr supstitucije na 757 položaj na unutarstanične kraku IL-6 obitelji signalizacije gp130 receptora istovremeno sprečava SHP2 i SOCS3 vezanje što rezultira u inhibiciji ras /MAP transdukcije signala kinaza i hipcraktivnosti STAT3 do konstitutivne fosforilacije [23], [24], [26]. Nedavno smo i drugi su pokazali da u želučanim tumora značajno povećanje transkripcije podudaraju s povećanom ekspresijom gp130 liganda IL-11 u ljudskim rak želuca i mišjim modelima ove bolesti [5], [12], [13]. U potonjem IL-6 je nepotrebno, a IL-11 je neophodno za tumourigenesis [12], [13]. Dodatno, IL-11 /STAT3 je pokazala da je važna pokretač atrofičnog gastritisa, prvi prekancerozno oštećenje želuca nakon kronične infekcije bakterijom Helicobacter pylori pregled [14]. Pregled}

do danas, brojni kinaze su izvijestili da inducira STAT3 aktivnosti nakon vezanja liganda /receptora, ali samo JAK1 a JAK2 čine STAT3 fosforilaciju na sidrištu s IL-11 /gp130 receptor kompleksa [15] i pokazuju IL-11 /gp130 prednosno veže JAK2 [16]. Ova opažanja upućuju na to da JAK2 and STAT3 sadašnji obećavajuće mete za izradu terapeutskih antagonista potisnuti IL-11 /STAT3 signalizacije ljudskog raka želuca. Pregled

Nedavno kafeinska kiselina derivat WP1066, strukturno povezani s inhibitorom niske jakosti tirozin kinaze AG490 , pokazano je da je vrlo moćan inhibitor JAK2 /STAT3 puta u transformiran mozga gliom [17] i karcinoma bubrega [18] staničnih linija, što dovodi do inhibicije rasta i indukciju klasičnih pro-apoptoze. Osim toga, WP1066 je učinkovit In vivo pregled protiv visoko malignih melanoma i leukemije koja su pozitivna za JAK2-V617F + mutacije, koja potiče aktivaciju konstitutivni JAK2 kinaze [19], [20], [21], [22 ]. Neobjavljena studije pokazuju da WP1066 nije ATP-kompetitivni inhibitor, a može blokirati izražavanje fosforiliranog JAK2 i STAT3; osim toga, p-STAT3-Y705 može inhibirati neovisno stanja JAK2. Dakle, WP1066 predstavlja jedinstvenu priliku da inhibira i p-JAK i p-STAT3, a nakon toga snažno blokiraju JAK2 /STAT3 signalne putove i STAT3 transkripcijsku aktivnost. Pregled

Kako testirati ideju dvojnog blokade JAK2 i aktivacije STAT3 u želucu i kasnijim razvojem raka želuca, koristili smo oboje in vitro
i in vivo pregled pristupa ocijeniti je li WP1066 mogu usporiti ili blokirati rast želučane tumora putem inhibicije JAK2 /STAT3 aktivnosti, i druge usko povezane onkogeni signalizacije. Ovdje ćemo pokazati da WP1066 učinkovito inhibira fosforilaciju STAT3, te potiče apoptozu kod raka želuca stanične linije, a da se može spriječiti rast tumora želuca In vivo pregled blokira indukciju ključnih gena STAT3 regulirano. Pregled

materijali i postupci

Priprema i skladištenje Inhibitori kinaze

Inhibitor WP1066 je razvijen i sintetizirani Waldemar Priebeom i suradnici na Sveučilištu Texas MD Anderson Cancer Center, i trenutno stock je isporučen ljubaznošću Houston Pharmaceuticals Inc, Houston, Texas, USA. Dionice su ponovno suspendirane u Hybri-Max DMSO i pohranjena pri -20 ° C. Dionice su samo za jednu osobu, a ne ponovno zamrznuta nakon odmrzavanja. Pregled

In vitro kultura pregled

AGS stanice (ATCC, Manassas VA, USA) stanice su većinom u kompletnom mediju koji sadrži RPMI + Glutamax ( Gibco Life Sciences, Invitrogen OR, USA) medij, uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma, 50 IU penicilina na 37 ° C u 5% CO _{2-95% zraka. pregled}

Western blotting pregled

Proteinski ekstrakt se pripraviti bilo TRIZOL reagensom (Life Technologies, Vic, Australija) u skladu s uputama proizvođača i proteinske pelete su resuspendirane u 1% natrijevog dodecil sulfata koja sadrži 2 mmol /l na, _{3VO 4 ili RIPA pufer. Alikvoti (30 ug) podvrgnuti su natrijev dodecil-sulfat /poliakrilamid gel elektroforeze. Membrane su bile zaustavljene i inkubirano na 4 ° C preko noći u obrano mlijeko sa sljedećim antitijelima; STAT3, antipY (705) STAT3, ERK1 /2, PT (202), Y (204) ERK1 /2, AKT, PS (473) AKT, JAK2, antipY (1007), Y (1008) JAK2 (stanične signalizacije,Α2,Α4S,Α1,Ύ2Ƶ7,Ο2,ƕ8,ŷ2,ŷ1,ł9,Ź1), GAPDH (Abcamδ5). Membrane su inkubirane s peroksida konjugiranih sekundarnih antitijela (Dako, poliklonalni anti svinje zečja HRP konjugirana, # P0399) i vizualiziran pomoću pojačane kemiluminiscencije (Amersham, Buckinghamshire, UK). Za analizu bendovi su utvrđene pomoću sustava Količina jedan softver (BioRad) i fosforilirane proteine ​​izražena kao udio GAPDH od duple membrane. Najmanje n = 8 uzoraka su ispitana oba tretmana. Pregled}

brojanja po Haemocytometry pregled

Stanice su posađene na 5 x 10 ^{4 stanica /ml u 24-jažica formatu, u kompletnom mediju i ostavljene da rastu nesmetano 24 sata. Stanice su tretirane s odgovarajućim koncentracije WP1066 ili DMSO kao kontrola za 0-360 minuta. Nakon stanice tretirane pomaknu obradom s tripsin-EDTA 0,25% (Sigma), obojeni trypan blue-0,4% (Sigma) pri 1:1 razrjeđenja 5 minuta pri 4 ° C, i broji na hemocitometra. Pregled}

karboksifluorescein diacetat sukcinimidilni ester (CFSE) Bojanje pregled

Označavanje AGS stanica s CFSE, stanice se pomaknu obradom s tripsin-EDTA 0,25% (Sigma) i ponovno suspendirane u ugrijane PBS /0.1% BSA u gustoći od 1 × 10 ^{6 stanica /ml. 10 mM CFSE boja (Invitrogen) je pripravljen po protokolu proizvođača, a zatim 5 ul /ml je dodan i dobro je pomiješano inverzijom kako bi se osigurala homogena označavanje stanica. Uzorci se inkubiraju na 37 ° C tijekom 10 minuta, reakcija je ugašena dodatkom 5 volumena ledeno hladnog medija i inkubira 5 minuta na ledu. Uzorci su zatim isprane 5 puta u mediju, te nasadi na 2 × 10 5 stanica /jažica (6 jažica). Uzorak stanica je nakon nanošenja na ploču i označen sa 100 ug /ml propidij jodida (PI) i analizirana su protočnom citometrijom za uniformnost i intenziteta označavanja. Stanice su zatim uzgajane u kompletnom mediju tijekom 48 sati nakon čega se tretira sa ili bez odgovarajućeg WP1066 (5 uM), pri 37 ° C s 5% CO _{2 95% zrak tijekom 18 sati. Stanice su zatim tripsinizirane kao gore i ponovno suspendirane u kompletnom mediju koji je označen sa 100 ug /ml PI i analizirane protočnom citometrijom na 488 ηM. Podaci su snimljeni pomoću BD FACS divu (BD) Biosiences softverskog paketa i analizirani pomoću ModFit LT softverskog paketa (VSH). Pregled}}

aneksina V bojanjem pregled

AGS stanice su rasle u kompletnom mediju na 2 x 10 ^{5 stanica /jažici u ploče sa 6 jažica s DMSO (kontrola nosač) ili WP1066 (5 uM), ili etoposida u (200 mm; pozitivna kontrola) pri 37 ° C s 5% CO _{2 95% zrak nesmetano kroz 24 sata. Stanice su zatim tretirane na sljedeći način; isprani u ledeno hladnom PBS-u, kao što je gore tripsinizirane i gustoće stanica određena haemocytometry prije ponovne suspenzije u puferu za vezanje aneksina 1 × 10 6 stanica /ml. 100 ul ovih preparata je uzet i inkubiran s 5 ul komponenta A (Annexin Fluor 488 aneksin V komponente, 25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, 0,1% albumin iz goveđeg seruma) i 1 ug /ml PI 15 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Uzorci su zatim pomiješani sa 400 ul Aneksina vezivnog pufera i analiziraju pomoću protočne citometrije. Odgovarajuće kontrole +/- reakcijske komponente su bili spremni prilagoditi za pristranost u vratarenje. Podaci su evidentirana korištenjem BD FACS divu (BD Biosiences) programskog paketa. Pregled}}

Etika Izjava pregled

Svi su pokusi na životinjama su provedena u skladu s australskom Kodeksa za njegu životinja i njihovo korištenje u znanstvene svrhe (7 ^{th izdanje), a nakon odobrenja Murdoch Dječje istraživačkog instituta životinja etičkog povjerenstva (primjena # A583). učinjeni su napori kako bi se smanjili nelagodu u tim minimalno invazivnih postupaka. pregled}

In vivo
Eksperimenti

gp130 ^{757F /F miševi su prethodno opisano [23]. Ukratko, diskretne antralne tumori razvijaju sa 4 tjedna starosti i brzo raste do oko 12 tjedana. Oni rekapitulirati razvojne karakteristike crijevna tipa želučanog adenokarcinoma, uključujući submukozne invazije, ali ne metastaziraju [24]. Životinje su smještene u SPF pogonu Na Murdoch Dječje Research Institute i potvrdio da bude slobodna od Helicobacter pylori pregled. Tri skupine miševa Ispitivani su za razvoj tumora: 1) 8 tjedana starosti gp130 757F /F miševi koji su dobili nikakav tretman (n = 10); 2) gp130 757F /F miševa koji su primili WP1066 od 8 do 10 tjedana starosti (n = 10); i 3) gp130 757F /F miševi koji su dobili DMSO vozilo od 8 do 10 tjedana starosti (n = 8). Prije pokusa sve životinje su ocijenjeni za dobrobit, važu i količine liječenja izračunata u skladu s tim. Kontrolne životinje dobivaju ekvivalentne količine DMSO vozila tretiranih WP1066-životinja. Miševi su primili 2 početne intraperitoncalne injekcije WP1066 pri 10 mg /kg svakih 48 sati da im se prilagodi na djelovanje liječenja, zatim primili 5 injekcija WP1066 na 20 mg /kg svakih 48 sati za dovršenje 2 tjedna režim. Intra-peritonealne ubrizgavanja su se izmjenjivali kroz četiri kvadranta trbuha miševa. Na kraju pokusa, miševi su eutanazirani, a želuci resected za fotografiranje i tkiva kolekciju. Pregled}

makroskopski i Histološka procjena pregled

želuci su brzo secirao po manjoj zakrivljenosti, zabodena van, fotografirali, fiksirani u 4% ublaživač formaldehidom prije obrade. Parafinski rezovi (4 um) su obojene s hematoksilinom i eozinom (H &E). Morfometrička analiza provedena je pomoću otvorenog koda ImageJ software (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). Za mjerenja površine, slike želučane sluznice ručno su navedene uz softver alat za crtanje i određivanjem programa koji se koristi za generiranje mjerenja pregled

In vivo pregled Imunohistokem &. Kvantifikacija pregled

Imunohistokemijska analiza je provedena pomoću protutijela za Ki-67 (PharmingenȦ609) i aktivirane kaspaze 3 (Cell signalno TehnologijaϤ1). Antigen dohvat se vrše ključanjem dijelovima tijekom 30 minuta u 10 mM limunskom kiselinom (pH 6,0). Bojenje je završena s odgovarajućim vrsta specifičnim biotiniliranim sekundarnim protutijelima (Dako, Denmark), avidin i biotinilirani peroksidazom hrena makromolekulski kompleks (Vector Laboratories, Burlingame, CA), 3,3'-diaminobenzidinu (Sigma, St. Louis, MI) i negativno hematoksilin. Za Ki-67 kvantifikaciju, slijepi promatrač broje broj obojenih stanica po žlijezde u više sekcija po životinji korištenjem ImageJ kao i prije. Podaci su izraženi kao broj Ki-67 pozitivnih stanica po žlijezde. Za aktivirane kaspaze 3 kvantifikaciju, slijepi promatrač broje broj obojenih stanica po području sluznice u 4 slučajnim područja i usmjerena antruma po životinji korištenjem ImageJ kao i prije. Podaci su izraženi kao broj aktivirane kaspaze 3 pozitivnih stanica po površini sluznice pregled

Polu kvantitativna analiza Morfometrijska upale

Upala je procijenjena pomoću mikroskopije na slijepi način na H &, e-obojeni sekcije. Sekundarnom tumorskih tkiva su analizirani i minimalno 3 trake po životinji (n = 7) dobivali su polu-kvantitativni rezultat s obzirom na stupanj upalnih stanica od minimalno 0 do maksimalnog = 3. Lymphoplasmocytic i polimorfonuklearnih infiltrata su ocijenjeni samostalno. Srednje vrijednosti su tada u odnosu na statističku analizu. Pregled

Real-Time (Q) -PCR Analiza pregled

RNA je ekstrahirana Trizol reagensom (Life Technologies, Vic, Australija) u skladu s uputama proizvođača. Ukupna RNA (3 ug) reverzno prepisana u cDNA pomoću Moloney mišji virus leukemije reverzne transkriptaze (Promega, Madison, WI) prekriven 0,3 J..lg oligo (DT). Q-PCR primeri su oblikovani korištenjem Primer Express (Applied Biosystems) (Tablica 1). SYBR green kemija (Applied Biosystems) bio je upotrijebljen kao L32 normalizator. PCR uvjeti su bili 95 ° C tijekom 10 minuta, a zatim 40 ciklusa od 95 ° C za 15 s i 60 ° C tijekom 15 sec; Reakcije su provedene u Applied Biosystems AB7500 RT PCR stroja. Rezultati su analizirani pomoću detektora slijed softvera i relativni peterostrukih razlike su određene uporabom ΔΔCt postupka kao što je opisano od proizvođača. Pregled

Statistička analiza pregled

Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna pogreška srednje vrijednosti , Vrijednosti dobivene iz kvantitativnu analizu ekspresije gena ili broja obojenih stanica je uspoređen između uzoraka ANOVA i gdje je pronađena je statistički značajna razlika pojedine skupine su analizirani s odgovarajućim parametarsku ili ne-parametarskog statističkog pomoću SigmaStat statističke paket. Statistička značajnost je definiran kao p≤0.05. Pregled

Rezultati pregled

WP1066 Brzo Potiskuje fosforiliran Y (705) STAT3 i uzrokuje fosforilaciju ERK1 /2 u AGS stanica

JAK- STAT putanje i ERK1 /2 put su dva glavna prijenos signala nizvodno od gp130. Ove dvije staze imaju recipročne i inverzni regulatorne učinke na drugoga, najbolje pokazuje negativne regulacije pSTAT3 nakon ERK1 /2 aktivacije [47].

eksperimenti doza-odgovor WP1066 su provesti tretiranjem AGS stanica sa 0 1, 2 ili 5 uM WP1066 60 min i mjerenje fosforilacija JAK2, STAT3, ERK1 /2 i SHP-2. Kao što se očekivalo, pJAK2 snažno inhibiran WP1066 pri svim ispitanim koncentracijama i po > 80% na 5 uM. 5 uM WP1066 dao maksimalne inhibicije pSTAT3 i uzajamne aktivaciju pERK1 /2 (Sl. 1A), sa smanjenjem ukupnog STAT3 na 5 uM ili višim koncentracijama (podaci nisu prikazani). Zajedno s porastom pERK, pSHP2 aktivacija je ovisno o dozi pojačan nakon WP1066 upravi (Sl. 1). Pregled

Za studije vremena, naravno, AGS stanice su tretirane za 0-360 min sa 5 uM WP1066 i fosforilacije of JAK2, STAT3, ERK1 /2 i SHP-2 je analiziran pomoću Western blota (Sl. 1B). WP1066 tretman rezultira brzim inhibiciju pJAK2 uz pad od 75% do 30 minuta, te do 90%, pada do 60 min. Nakon toga stanice se oporavio i vratio na bazalni fosforilacije JAK2 od 360 min. Uzorak smanjena aktivacija STAT3 zrcali onaj JAK2 fosforilacije. Nasuprot tome, ERK1 /2 fosforilacije značajno povećan u odgovoru na WP1066 liječenja, s povećanjem od 250% za 15 minuta, a maksimalne 460% povećanja za 60 minuta, prije povratka u odnosu na bazalnu vrijednost od 360 min. Aktivacija SHP2 slijede promjene u ERK izražavanja s maksimalnim indukcije na 60 min. pregled

WP1066 Sprječava AGS rast kroz suzbijanje proliferacije i indukciju apoptoze pregled

Aktivni STAT3 je osnovana pokretač ljudske stanice raka želuca rast i širenje [5], i dugotrajno aktiviranje ERK1 /2 inducira apoptozu želučanog epitela [25]. Nakon što je pokazao da WP1066 regulira STAT3 i ERK1 /2 signalizaciju u recipročnom način, testirali smo je li to također može poremetiti rast stanica i inducira apoptozu AGS stanica. Pregled

Tretman AGS stanica sa 5 uM WP1066 (Sl. 2A ) rezultiralo značajnim smanjenjem broja stanica u odnosu na DMSO kontrole (DMSO-100% ± 3,14 vs. WP1066; 36.02% ± 3,18, p 0,05). Utvrditi je li to smanjenje broja stanica je zbog proliferacije promijenjenog stanice ili apoptoze, ili uz kombinaciju oba načina, i CFSE Annexin V bojanja se izvodi na tretiranih miševa. AGS stanice obrađene WP1066 su intenzivnije označena CFSE nego oni koji su primali DMSO, dokaz o smanjenju broja dioba, a time i proliferacije (sl. 2b). Osim toga, veći udio AGS stanice tretirane WP1066 označene su aneksina V (Slika 2C) u usporedbi sa stanicama koje su tretirane s DMSO, što pokazuje da WP1066 također inducira apoptozu u AGS stanicama (WP1066, 1.3 puta više; p = 0.049).

WP1066 Blokovi želudac rast tumora u gp130 ^{757FF miševa suzbijanje tumora staničnu proliferaciju i pojašnjenje apoptoze pregled}

gp130 ^{757FF miševi razvijaju distalni tumora želuca karakteriziraju povišene želučane IL-11 pogon za aktivaciju STAT3 [12], [13]. Od pJAK2 i p-STAT3 blokirane WP1066 In vitro pregled, testirali smo da li bi WP1066 također blokirati razvoj tumora želuca in vivo pregled. Liječenje gp130 757FF miševi 3 puta tjedno za 2 tjedna s 10-20 mg /kg WP1066 značajno smanjenim rastom želučane tumora za 47% od 42.11 ± 3.21 mm 2 do 22,36 ± 3,64 mm 2 ( p. < 0,05) (Slika 3A-D). DMSO tretirani tumori su se ne razlikuje od tumora promatrane u 8 tjedana starih miševa, dob u kojoj WP1066 liječenje započeto, što potvrđuje da je rast želuca tumor je relativno stabilna od 8-10 tjedana [27], te da WP1066 tretman zapravo uzrokuje regresiju tumora, a ne zastoj (Sl. 3A-D). pregled}

Kako bi se utvrdilo da li proliferacija promijenjen u želučanim tumora, Ki-67 pozitivnih stanica /žlijezda su kvantificirani u tretiranoj skupini. WP1066 tretman značajno smanjuje želučanog epitela proliferaciju stanica (DMSO 62 ± 7,7 vs. WP1066 41.6 ± 6.5 Ki-67 obojene stanice /žlijezdi, p < 0.05, Sl. 3E-G), što pokazuje da WP1066 može inhibirati rast tumora inhibicijom stanične proliferacije. Za procjenu učinaka WP1066 na tumorske stanice, apoptoza, sekcije iz WP1066 ili skupinama DMSO tretirane su obojene s protutijelom cijepanog kaspaze 3 biljeg apoptičkoj smrti stanice (Sl. 3H, J). Bilo je značajno više apoptotične profili tumora WP1066 tretiranih od kontrole, pokazujući jasno pro-apoptotski učinak WP1066 (WP1066 25.25 ± 5,32 vs DMSO 2,65 ± 0,76 obojene stanice /mm ^{2 sluznica, p 0.05; Sl. 3J ). pregled}

WP1066 ciljano JAK2 i STAT3 fosforilacija za suzbijanje želučane Tumourigenesis u gp130 ^{757FF Miševi}

Zbog gp130 ^{757FF miševi razvijaju tumore, kao odgovor na konstitutivne aktivacije gp130 [20] smo testirali je li WP1066 potiskuje nizvodno signalni putevi in vivo.
WP1066 tretman za 2 tjedna rezultiralo smanjenjem od 25% u relativnom iznosu od ukupnog STAT3 u antralnog sluznice u odnosu na DMSO tretiranim skupinama (Sl. 4 a) , Iznos ukupnih JAK2, AKT i ERK1 /2 nije promijenila WP1066 liječenja. To pokazuje da kronično liječenje gp130 757FF miševi WP1066 suprimira ekspresiju STAT3, pregled}

Imunoblot analiza signalizacija aktiviranje pokazala značajno smanjenje u pJAK2 (80,12% ± 5,70 kontrole DMSO), pY705 Stat3 (26.84 % ± 7,2 DMSO kontrole; Sl. 4B) i pERK1 /2 (72,66% kontrola ± 5.23.of DMSO; Sl. 4B). AKT fosforilaciju nije promijenila WP1066 liječenja. Smanjena aktiviranje JAK2 i STAT3 je u skladu s In vitro pregled podataka i poznate akcije WP1066. Pregled

WP1066 Potisnut upalni odgovor u sekundarnom sluznici gp130 ^{757FF Miševi pregled}

Budući kronični upalni odgovor u želucu je presudno za tumor razvoj [27], ispitali smo može li dio načinu djelovanja WP1066 je suzbiti STAT3 posredovanog upalnog odgovora, koji se obično doprinosi progresije tumora. Histološka analiza pokazala da polimorfonuklearnih infiltracija u antrumu obrađenih miševa WP1066 značajno manji nego kod kontrolnih miševa (Slika 5A,. DMSO 2,45 ± 0,24 vs WP1066 1.46 ± 0.22, p 0.05), a lymphoplasmocytic infiltrat ne razlikuje između dva skupine (Sl. 5B DMSO 1.73 ± 0.16 vs WP1066 1.32 ± 0.20, p 0.05). pregled

od želuca upala obično je posredovano malog broja ključnih proupalnih citokina i enzima, mjereno je ekspresija odaberite grupu od tih od Q-PCR u DMSO i želudaca WP1066-liječiti. Ekspresija svih proupalnih medijatora s izuzetkom IFNy, TNFa i iNOS značajno inhibirana WP1066 obradom kako slijedi; IL-6 (sl. 5 C, 6.0 ± 2.6 puta), IL-11 (slika 5D,. 8.7 ± 3.4 puta), IL-1α (Slika 5E,. 10,9 ± 4,3) puta), IL-1β (Slika 5F. 3 ± 0,9 puta) i CoX2 (Slika 5 G,. 2,94 ± 1,05). Stoga WP1066 inhibicija STAT3 aktivnosti i kod napredovanja tumora je bio djelomično zbog smanjenog polymophonuclear infiltracije i smanjene STAT3 ovisne transkripciju proupalnog IL-6, IL-11, IL-1 a, IL-1 i COX2 gena. Pregled

WP1066 inhibira ekspresiju amfiregulin u sekundarnom sluznici gp130 ^{757FF Miševi}

učinak WP1066 tretmana na ekspresiju faktora rasta liganada je poznato da imaju ulogu u rastu i diferencijaciju želuca i u razvoju gp130 ^{757FF tumori također je ocijenjena. WP1066 inhibira ekspresiju amfiregulin (1,85 ± 0,60 tor, p 0.05), ali ne i HB-EGF (Sl. 6) u antralnog sluznici tretiranih miševa. Osim toga, želudac proliferativna ligand i STAT3 regulirana genska Reg1 pokazali snažnu inhibicijsku trend nakon WP1066 tretmana u usporedbi s kontrolnom DMSO antruma (Slika 6, p. = 0,069). Pregled}

Rasprava pregled

u ovom istraživanju pokazali smo da WP1066 ovisno o dozi inhibira JAK2 /STAT3 signalnog puta kod humanih karcinoma želuca (AGS) stanica, s posljedicom smanjenja od 60% u staničnoj proliferaciji i manji porast u apoptozi. Mehanizam za to je vjerojatno zbog dvojnom inhibicijom od fosforiliranog oblika JAK2 i STAT3 smanjujući tako STAT3 transkripcijsku aktivnost, kao što je pokazano za nekoliko staničnih linija raka uključujući gliom [17], [28], [29], mijeloidne leukemije [ ,,,0],30], te melanoma [20]. S druge strane, primjena WP1066 rezultirala recipročnom povećanje ERK1 /2 aktivacije podudara se s povećanom pSHP2, fosfatazu odgovoran za aktiviranje ras /signalni put MAP kinaze. Slična primjedba s obzirom na aktivaciju ERK je napravljena za drugim staničnim linijama raka dobivenih od karcinoma bubrega [18], i gliom [28]. Dakle, cross-regulacija STAT3 i ERK posredovan signalizaciju nizvodno od IL-6 obitelji citokina Čini se da se redovito pojavljuju u jedan rasponima tkiva i stanične linije [31]. Pregled

WP1066 bila je na snazi ​​kada je dao in vivo pregled, gdje se blokira aktivaciju STAT3 (75%) u gp130 ^{antralne tumori 757FF mišem, a također smanjuje ukupnu STAT3 proteina, što ukazuje da se može smanjiti ekspresiju STAT3 pregled gena u želuci od tretiranih miševa. Tome u prilog postojanju konsenzusa mjesta za aktivnim STAT3 obvezuje STAT3 pregled, promotora, s aktivacijom STAT3 pregled gena kao što je prikazano pomoću mutanta STAT3 pregled promotor-reporter konstrukti i EMSA [48] ili čip-seq [49], i sugerira da se WP1066 inhibirati aktivaciju autokrini STAT3 nakon inhibicije JAK2 /STAT3 fosforilaciju. pregled}

Kao što se očekivalo, razina pJAK2 su također smanjene u prisutnosti WP1066 u želucu. Za razliku od učinka WP1066 in vitro
ERK1 /2 aktiviranje u želucima WP1066 obrađenih miševa je malo smanjena. Razlog za to je disparitet može biti dva puta; prvo, in vivo pregled izloženost WP1066 je kronična odnosu na akutnu izloženost In vitro pregled; drugo, izloženost In vivo pregled je složeniji s više potencijalnih signalnih putova koje koriste prijenosne molekule zajednički signal. Ipak smanjena aktivacija JAK2 i STAT3 je u skladu s utvrđenom ulogu ovih faktora citokina /rasta signalne komponente u progresiji karcinoma želuca [5], [27] i pokazuje da in vivo, Netlogu a kad izoliran od učinci H. pylori pregled, infekcije, to je uglavnom izmijenjen aktivacija STAT3, a ne ERK1 /2 koji je od ključne važnosti za razvoj tumora. pregled

Zajedno s inhibicijom STAT3 aktivnosti, primjena WP1066 samo 2 tjedna in vivo pregled rezultirala smanjenjem od 50% u području tumora praćen sličnim smanjenjem proliferacije kao što je mjereno pomoću Ki-67 bojenje i istodobnim povećanjem apoptoze tumorskih stanica kao što je mjereno pomoću aktivirane kaspaze 3 imunološko. Inhibicija rasta tumora Istodobno je > 40% smanjenja polimorfonuklearnih broja stanica, a doreguliranjem povezanih proupalnih citokina, uključujući IL-1 a, IL-1, kao i COX-2, od kojih su svi promovirati želučano tumourigenesis. S druge strane, WP1066 nije imao učinka na IFNy, TNFa i iNOS ekspresiju, razmjerno s nedostatkom smanjenja limfocita i makrofaga (lymphoplasmocytic infiltracijom) preko liječenje vremenski naravno. Inhibicija IL-1, nakon pSTAT3 inhibicije WP1066 je posebno značajna, jer je IL-1β je važan regulator izlučivanja želučane kiseline, potentni promotor rasta tumora u transgenskom mišjem modelu rakom želuca [33], te je sastavni dio od NLRP3 inflammasome [32]. IL-11 je poznato da je endogeni stimulator antralnog IL-1 ekspresije putem STAT3 [13] i pokazali smo da se ovdje IL-11 je inhibiran WP1066. Budući da je IL-11 čini se da je uzvodno od IL-1 u želucu, onda je to uvjerljivo put za inhibiciju naknadnoj nakon blokade aktiviranja STAT3. Pregled

Efekti inhibicije WP1066 u gp130 ^{757FF miš model raka želuca, ponovimo i proširiti rezultate STAT3 haploinsufficiency generirana genetski u istom mišjem modelu [26], kao i korištenje sistemskih komplementarnih oligonukleotida protiv STAT3 [12], čime se naglašava važnost aktivnom STAT3 signalizaciju u olakšavanju želuca tumourigenesis. S obzirom na važnost IL-11 u promicanju pokretanje i razvoj [12] tumora, [13], i IL-6 u olakšavanju lokalne polimorfonuklearnih infiltraciju [34] u gp130 757FF miš, značajno je da WP1066 učinkovito smanjuje razina ekspresije obaju citokina podudarni s obrata rast tumora. To podržava stav da STAT3 regulira transkripciju oba IL-11 i IL-6, vjerojatno potaknut autokrinim petlje povratne veze, budući da su oba citokina prvenstveno koriste STAT3 transkripcije u želucu [23]. Pregled}

Reg1 je široko distribuira član obitelji gena Reg i poznatog želučane faktor rasta, koji igra važnu ulogu kao proliferativne i anti-apoptotičkog regulatora u želucu miševa [26], [35] i ljudi [36]. Prethodno smo pokazali da Reg1 jako inducira antralnim tumorima gp130 ^{757FF miševi podudara s IL-6 i IL-11 ekspresiju, te da haploinsufficiency STAT3 rezultira smanjenom ekspresijom Reg1, sugerirajući da je STAT3 reguliran gen [26]. Ovo je potvrđeno u želučanim staničnih linija, gdje IL-11 [37] i IL-6 [36], stimulira fosforilaciju STAT3 koji zauzvrat aktivira Reg1 transkripciju.}