Ausência de Helicobacter pylori alta tetraciclina resistentes genótipo 16S rDNA AGA926-928TTC em amostras de biópsia gástrica de pacientes com dispepsia de uma cidade no interior de São Paulo, Brasil

Ausência de Helicobacter pylori
alta tetraciclina resistentes genótipo 16S rDNA AGA926-928TTC em amostras de biópsia gástrica de pacientes com dispepsia de uma cidade no interior de São Paulo, Brasil
Abstract Background
eficácia Tratamento de Helicobacter pylori
varia regionalmente e está a diminuir em todo o mundo, principalmente como resultado da bactéria resistente aos antibióticos. Tetraciclina é geralmente incluído na segunda linha H. pylori
regimes de erradicação. No Brasil, um alto nível de resistência à tetraciclina (TetR) está associada principalmente com AGA926-928TTC 16 substituições de nucleotídeos S rDNA. Como H. pylori
cultura é exigente, foi investigada a ocorrência primária de H. pylori
16 S rDNA alto nível genótipo TetR usando uma abordagem molecular diretamente sobre biópsias gástricas de pacientes com dispepsia que frequentam consecutivamente no Hospital das Clínicas de Marília, São Paulo, Brasil.
Métodos
amostras de biópsia gástrica de 68 úlcera péptica (DPU) e 327 pacientes com gastrite crônica (GC) com diagnóstico histológico positivo de H. pylori
foram investigadas para TetR 16 S rDNA genótipo através de um ensaio molecular baseados na amplificação de um fragmento de rDNA 16 S 545 pb por reacção em cadeia da polimerase e Hinfl
polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (PCR /RFLP). Através deste ensaio, AGA926-928TTC 16 S rDNA TetR genótipo resultou em um padrão de restrição fragmento de DNA de três (281, 227 e 37 pb) e sua ausência originou dois fragmentos de ADN (264 e 281 pb) devido a um 16 S rDNA conservada Hinf I
sítio de restrição.
resultados
O 545 bp fragmento 16 S rDNA PCR foi amplificado a partir de 90% das biópsias gástricas de pacientes histológicos H. pylori
positivos. Hinfl
RFLP revelou ausência de H. pylori
genótipo e PCR produtos AGA926-928TTC de dois pacientes mostraram ausência do conservada 16 S rDNA Hinfl
sítio de restrição. análise da sequência BLASTN de quatro amplicons (dois conservada e dois com um padrão de restrição Hinfl
imprevisíveis) revelou uma homologia de 99% para H. pylori
16 S rDNA de Africano, Norte e isolados bacterianos da América do Sul. Uma substituição de nucleótidos conservada aboliram a Hinfl
sítio de restrição nos dois fragmentos de PCR com Hinfl imprevisíveis
RFLP, resultando num local de restrição EcoRI
.
Conclusões
H. pylori
AGA926- 928TTC 16 substituições de genes S rDNA não foram encontradas em nossa população. Mais pesquisas são necessárias para investigar se H. pylori
TetR tem um fundo genético diferente em nossa região e se as substituições de nucleotídeos do uncultured H. pylori
16 sequências parciais S rRNA tem significado biológico.
Palavras-chave
Helicobacter pylori
tetraciclina resistência Helicobacter pylori
16 S rDNA ácido nucleico diagnóstico baseado Helicobacter pylori
16 S rDNA fundo polimorfismo
é amplamente aceito que a Helicobacter pylori
, uma bactéria Gram bactéria microaerophilic negativo , está associada a diversas doenças do aparelho digestivo, como gastrite crônica, péptica e úlcera duodenal, câncer de estômago e distúrbios linfoproliferativos [1]. Não há nenhum regime de tratamento padronizado para a infecção por H. pylori
[2], e uma vez que a bactéria é detectada na mucosa gástrica alterada, o tratamento indicado consiste de um regime antibiótico triplo incluindo metronidazole, claritromicina, amoxicilina, tinidazol, tetraciclina e fluoroquinolonas associado com um inibidor de bomba de próton como omeprazol, lansoprazol ou pantoprazole [3-5], de acordo com as políticas de prescrição de antibióticos para tratamento médico local.
H. pylori
taxas de erradicação com um número de agentes e regimes combinados estão perto de 80% [6, 7], variando de país para país e regionalmente dentro dos países [8]. Vários factores contribuem para esta baixa taxa de H. pylori
cura, incluindo a ineficiência do antibiótico penetração na mucosa gástrica, a inactivação do antibiótico por a secreção ácida do estômago [9], a falta de adesão dos pacientes [10] e principalmente, os casos de emergência e aumento de cepas resistentes a antibióticos H. pylori
[11]. Assim, regional H. pylori
vigilância da resistência é de grande importância para as estratégias de teste e tratamento.
No Brasil, um país de dimensões continentais, a maioria dos médicos que praticam incluem tetraciclina em um segundo regime de tratamento de linha após falha do clássica regime triplo composto de claritromicina, amoxicilina e um inibidor de bomba de protões durante sete dias para superar pylori
infecção por H. [12].
H. pylori
resistência à tetraciclina (TetR) é baixa na maioria dos países [13-15], por outro lado, na América Latina, de acordo com um pequeno número de estudos, demonstrou-se a ser elevada no Chile [16] e no Brasil [17]. Além disso, há alguns anos, a incidência de TetR tem vindo a aumentar [15, 18-21]. Assim, considerando a importância clínica da principal H. pylori
resistência aos antibióticos, deve ser considerada regionalmente antes de ser incluído em regimes de erradicação.
O método padrão-ouro para a determinação de H. pylori in vitro
susceptibilidade a antibióticos corresponde ao isolamento do microrganismo por cultura. No entanto, por causa do crescimento lento e as exigências particulares de H. pylori
cultura, esta abordagem não é confiável para uso na maioria dos laboratórios clínicos de rotina, principalmente nos países em desenvolvimento. Por isso, testes moleculares de segmentação de resistência associadas mutações do gene directamente a partir de amostras de biopsia tem o potencial para uso em estudos de grande escala [22-25].
O mecanismo molecular de TetR consiste em a sua ligação a uma região específica de rRNA 16 S, interagindo estòica com a transferase de aminoacil-ARNt ao local a do ribossoma. Este sítio de ligação tem sido definida por resolução atómica em ribossomas de Thermus thermophilus
sendo formada por dois domínios da fracção 16 S ARNr que consiste em hélice 34 e o circuito ao lado de hélice 31 [26, 27]. Em H. pylori
isolados, o elevado grau de TetR é devido principalmente a três mutações de base, a partir de AGA926-928 TTC, nos 16 S rRNA genes rRNA /B [28, 29]. As mutações em um ou dois destes posições resultar num baixo nível de TetR [30, 31].
No Brasil, os estudos realizados em pacientes de Bragança, São Paulo, mostrou que AGA926-928 tripla a mutações TTC são encontrados em todos TetR H. pylori
isolados [32]. Assim, usando uma abordagem molecular com base em uma reacção em cadeia de polimerase associado a ensaio de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (PCR-RFLP), investigou-se a incidência primário de H. pylori
alto nível TetR directamente em espécimes de biópsia gástrica de pacientes submetidos dispépticos a gastroscopia no Hospital das Clínicas de Marília, São Paulo, Brasil, de janeiro de 2003 a julho de 2006.
resultados e discussão
evolução da doença gástrica de 1102 pacientes atendidos no ambulatório de Gastroenterologia do Hospital das Clínicas de Marília foi investigada por endoscopia e histopatologia. achado endoscópico de úlcera péptica ou duodenal (PUD) estavam presentes em 119 pacientes. Diferentes graus de gastrite crónica (GC) foram observadas por exame histopatológico em 693 pacientes e outras alterações correspondentes principalmente a doença do refluxo gastroesofágico (DRGE) e mucosa gástrica normal, foram encontradas em 290 pacientes. Alguns pacientes apresentaram mais de uma alteração, com a patologia mais grave a ser considerado na análise.
Detecção de H. pylori
foi realizada directamente a partir de amostras de biópsia por histologia, o padrão H. pylori ouro
teste de diagnóstico empregada em nossa rotina clínica que, juntamente com a análise histopatológica é usado para decidir por H. pylori
terapia de erradicação. De 119 PUD, 693 CG e 290 amostras de DRGE, 76, 359 e 2, respectivamente, foram positivos para H. pylori
pela histologia.
Uma vez detectada na mucosa gástrica, um clássico a erradicação do H. pylori
triple regime é prescrito em nossas clínicas de saúde gastroenterologia. Quando a primeira terapia regime de escolha não consegue erradicar a H. pylori
, um segundo regime de linha contendo tetraciclina é o mais indicado. H. pylori
antibiótico TetR varia regionalmente, sendo muito baixo na Europa e América do Norte [2, 33, 34]. No entanto, na Ásia [15, 19, 35] e na América Latina, incluindo o Brasil [16, 32], uma alta taxa de H. pylori
TetR foi encontrado. terapia da doença Assim, a fim de melhorar a escolha de H. pylori
associado, principalmente em caso de falha de primeiro erradicação, investigou-se a alto nível regional de H. pylori
TetR usando uma abordagem molecular baseada em PCR e RFLP diretamente na mesma biópsia gástrica usado para teste rápido da urease. Somente amostras de biópsia de pacientes com positiva H. pylori
diagnóstico por histologia foram incluídos. A H. 545 bp fragmento pylori
16SrDNA PCR foi obtido a partir de 89,5% (68/76) e 91,1% (327/359) das biópsias gástricas de pacientes PUD e GC, respectivamente. Como ambos os testes foram realizados em uma biópsia gástrica único e diferente e infecção por H. pylori
apresenta uma característica focal da infecção [36], para melhorar a sensibilidade deste método, a multiplicação de amostras de biópsia é recomendada.
Sequencialmente, por ordem para detectar as principais mutações pontuais relacionadas, para AGA TTC nas posições 926, 927 e 928 de a H. pylori
16 S ADNr associadas a um elevado nível de TetR, e um genótipo original caracterizado por TetR brasileira H. pylori
isola [32], a 545 pb fragmento 16 S rDNA PCR foi restringido com Hinfl
. Neste H. pylori
16 S ADNr amplicão existe uma restrição Hinfl
local conservado, o que fornece um controlo interno de digestão enzimática, resultando num padrão de fragmentos de restrição de ADN de dois, quando a substituição de nucleótidos AGA926-928TTC é tripla ausente. De 395 amostras de PCR, 393 apresentaram o padrão de restrição fragmento de dois DNA e dois produtos de PCR obtidos a partir de um PUD (Hp16S563Mar) paciente e um paciente CG (Hp16S587bp) não foram digeridos por Hinfl
. A alta tetraciclina resistentes AGA926-928TTC dependente de H. pylori genótipo
16 S rDNA não estava presente na nossa população. Estes resultados podem ser indicativos de H. pylori
alto nível ausência TetR ou que, em nossa região outros 16 substituições de nucleotídeos S rDNA ou diferentes fatores genéticos estão envolvidos na resistência à tetraciclina, como encontrado em outros estudos [21]. Mais pesquisa deve ser realizada para confirmar ou excluir essas hipóteses.
Para confirmar a especificidade do H. pylori 545 bp
16 produtos S rDNA PCR amplificados a partir de biópsias gástricas, os 545 fragmentos bp PCR obtidos a partir de dois pylori
pacientes PUD positivos H. usados ​​como controles em reações de PCR (Hp16S248Mar e Hp16S644Mar) e os 545 bp fragmentos de PCR com Hinfl imprevisíveis padrão
restrição chamado Hp16S563Mar e Hp16S587bp, foram sequenciados e analisados ​​por pesquisa básica BLASTN [ ,,,0],37]. Todas as quatro sequências apresentou 99% de homologia com o 16 S rDNA da American H.pylori Norte
isolados Oeste e Sul Africano, Sul e. As mutações encontradas na sequência de cada analisada por PCR em comparação com o H. pylori
16 sequências de referência S rDNA que apresentam mais de homologia com os amplicões obtidos encontram-se resumidos na Tabela 1. A abolição do Hinfl
local de restrição de Hp16S563 e 587Mar resultou a partir de uma substituição de nucleótido na posição 958, originária de um EcoRI
sítio de restrição. Assim, as substituições de nucleótidos nestes fragmentos de PCR de 16 545 pb S foram confirmados por análise de restrição EcoRI
(dados não mostrados). O significado biológico de substituições de nucleótidos encontradas no nosso 16 S uncultured H. pylori
fragmentos de PCR tem de ser investigada. Tabela 1 Comparação de Helicobacter pylori 545 bp 16 polimorfismos de nucleotídeo S rDNA entre referências e estirpes da bactéria incultos
H. pyloristrain +
16 posições de nucleótidos S rDNA #

926-928

947

954-959

981

988

1092

1093

1097

SouthAfrica07
AGA
A
GAATCC
A
T
T
C
G
2017WestAfrica
AGA
A
GAATCC
A
T
T
C
G
EU544200USA
AGA
A
GAATCC
A
T
T
T
G
Puno /Peru
AGA
A
GAATCC
G
C
T
C
G
Hp16S248Mar
AGA
G
GAATCC
A
T
T
C
A
Hp16S644Mar
AGA
A
GAATCC
A
T
G
C
G
Hp16S563Mar
AGA
A
GAATTC
A
T
T
T
G
Hp16S587Mar
AGA
A
GAATTC
G
C
T
C
G
# baseado em H. pylori
referência estirpe 26995; + Números de acesso do H. pylori
sequência cepas para SouthAfrica07, 2017WestAfrica, EU544200USA, Puno /Peru, Hp16S248Mar, Hp16S644mar, Hp16S563Mar e Hp16S567Mar são, respectivamente: [Genbank: CP002336.1, Genbank: CP002571.1, Genbank: EU544200.1, Genbank: CP002982.1, Genbank: JQ315410, Genbank: JQ315411, Genbank: JQ315412 e Genbank:. JQ315413]
Conclusões
O alto nível TetR H. pylori
genótipo dependentes AGA926-929TTC 16 substituições de genes S rDNA não foi encontrado em nossa população. Mais pesquisas são necessárias para investigar se H. pylori
alta taxa TetR está ausente ou se ele está associado com um fundo genético de bactérias diferentes em nossa região. Além disso, o significado biológico das substituições de nucleotídeos imprevisíveis do Marilia Uncultured H. pylori
16 S rDNA sequência parcial precisa de uma investigação mais aprofundada.
Métodos
Pacientes
1.102 pacientes adultos residentes na cidade de Marília, São Paulo Paulo, Brasil, com idades entre 19 a 91 anos, que tinha esofagogastroduodenoscopia submetidos consecutivamente (EGD) para a dor abdominal superior ou sintomas de dispepsia de janeiro de 2003 a Julho de 2006, o ambulatório de gastroenterologia ambulatório do Hospital das Clínicas de Marília Faculdade de Medicina, foram incluídos neste estudo.
Endoscopy, biópsias
A EGD foi realizada por fibroendoscope (GIF-XP20, GIF-XQ20) ou vídeo-endoscópio (GIF-100) ambos da Olympus. diagnóstico úlcera gástrica ou duodenal foi definida por endoscopia e dois fragmentos do antro foram recolhidas para se realizar o rápido da urease e testes histopatológicos. A biópsia utilizada para o teste rápido da urease foi ainda submetido a extração de DNA. O protocolo utilizado está de acordo com a Declaração de Helsinki e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Faculdade de Medicina de Marília, com a referência 388/01.
Histologia
Um espécime antrais foi fixado em solução de formol a 10% e embebidos em parafina. Os cortes foram coloração Giemsa para avaliação H. pylori Comprar e foram coradas com hematoxilina e eosina para avaliação das alterações histopatológicas [38].
Extração de DNA e polimerase reação em cadeia
PCR e análise de restrição foram criados com o mesmo biópsia utilizada para o teste rápido da urease. Este foi submetido a extracção do ADN com o emprego do kit de extracção de ADN GFX comprado de Amersham /Pharmacia Biotech, seguindo as instruções do fabricante. O ADN foi quantificado em electroforese em gel de agarose utilizando a escada Invitrogem baixa massa e 50-100ηg foram utilizados nas reacções de PCR com o conjunto de iniciadores Hp16Sr1 (sentido),): 5 'AAC ATT ACT GAC GCT GAT TG 3'; Hp16S R2 (anti-sentido): 5 'TGG TTC CTC CAC GCA GTA TT 3', que amplificam um fragmento de 545 pb conservado correspondendo ao H. pylori
16 do gene S de rRNA entre as posições de nucleótido 700 e 1245 (numeração de acordo com a gene de ARNr de H. pylori
estirpe 26695), modificado a partir de [32]. Em todas as reacções de PCR um negativo e um controlo positivo foram utilizados correspondente a, respectivamente, de água estéril e duas urease H. pylori diferente
biópsias gástricas de pacientes positivos PUD. condição de PCR foi de 94 ° C 5 'seguido por 40 ciclos de 94 ° C 1' /55 ° C 1 '/72 ° C 1' e um ciclo a 72 ° C 7 ', com um volume total de 25 ul contendo 1x PCR tampão, 200 uM de dNTP, 2,0 mM MgCl 2, 1 uM oligoHp16Sr1, 1

• alterações genômicas e subtipos moleculares de câncer gástrico em alterações Asians
• Inter e intra-acordo para a atrofia da mucosa gástrica