Plos ONE: Photoimmunotherapy želodčnega raka peritonealno karcinomatozo v Mouse Model

Povzetek

Photoimmunotherapy (PIT) je novo zdravljenje raka, ki združuje specifičnost protiteles za ciljanje tumorjev z strupenosti photosensitizers inducirane po izpostavljenosti blizu infrardečega (NIR) svetlobo. Izvedli smo PFI v modelu, ki se razširjajo raka želodca peritonealno karcinomatozo in spremljati učinkovitost z vivo
GFP fluorescence slikanje. In vitro
in in vivo
eksperimenti so bili izvedeni s,-GFP izražanje, želodčnega raka celične linije HER2 izražanje (N87-GFP). Konjugat sestavljen iz fotosenzibilizator, IR-700, konjugirano trastuzumab (tra-IR700), čemur sledi NIR svetlobi je bila uporabljena za PIT. In vitro
PIT so ocenjevali z merjenjem citotoksičnost z mrtvo barvanjem in zmanjšanje GFP fluorescence. V vivo
PIT so ocenili v razširjajo peritonealno modela karcinomatozo in ledvenem ksenotransplantata pomočjo meritev obsega tumorja in intenzivnost GFP fluorescence. V vivo
anti-tumorske učinke PIT so potrdili znatnega zmanjšanja obsega tumorja (na dan 15, p < 0,0001 v primerjavi s kontrolo) in GFP intenzivnosti fluorescence (bok modela: na dan 3, PIT obdelan vs nadzor p < 0,01 in peritonealno razširjati model: na dan 3 PIT zdraviti vs. nadzor, p < 0,05). Citotoksična učinki in vitro
so pokazale, da so odvisni od odmerka svetlobe in povzročila celic rupture nekrotično vodi do sproščanja GFP in zmanjšanje intenzitete fluorescence in vitro.
Tako je izguba GFP fluorescence vroči kot koristen biomarker celične nekroze po PIT

Navedba. Sato K, Choyke PL, Kobayashi H (2014) Photoimmunotherapy želodčnega raka peritonealno karcinomatozo v Mouse modela. PLoS ONE 9 (11): e113276. doi: 10,1371 /journal.pone.0113276

Urednik: Irina V. Lebedeva, Columbia University, Združene države Amerike

Prejeto: 2 julij 2014; Sprejeto: 21. okt 2014; Objavljeno: 17. november 2014

To je odprtega dostopa člena se brez vseh avtorskih pravic, in se lahko prosto reproducirati, distribuirati, prenašati, spreminjati, nadgrajevati, ali kako drugače uporablja vsakdo za vse zakonite namene. Delo je na voljo pod Creative Commons CC0 javni domeni predanost

Data voljo. Avtorji potrjujejo, da so v celoti na voljo brez omejitev vse podatke, na katerih temeljijo ugotovitve. Vsi pomembni podatki so v papirju in njene dodatne informacije datotek

Financiranje:. To delo je bilo podprto s programom NIH Notranji in JSP Research Fellowship. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

želodca karcinom povzroča več kot 740,000 smrti zaradi raka na leto po vsem svetu, zlasti v Aziji [1] - [3]. Večina bolnikov z rakom želodca prisotni z lokalno napredovalim, ponovljenim ali metastaz nasprotuje kurativno operacijo, ki jo non-kurativnega zdravljenja [1] večinoma upravlja. Peritonealno karcinomatozo in jetrne metastaze so pogoste, smrtno nevarne manifestacije raka želodca napredni fazi [1], [4]. Peritonealno karcinomatozo pojavlja tudi v jajčnikov, appendiceal, debelega črevesa, trebušne slinavke in želodca raka. Prognoza je splošno slaba in lokalno zdravljenje so vedno neuspešni pri visokih stopnjah ponovitve in obolevnosti, povezanih z ascitesa in obstrukcijo črevesja. Sistemsko zdravljenje je običajno tudi neuspešno. Tako, potrebne so nove metode zdravljenja peritonealno karcinomatozo.

Photoimmunotherapy (PIT) je specifično zdravljenje raka novo ciljno celico, ki zaposluje konjugata fotosenzibilizator protitelesa (APSC), ki mu sledi blizu infrardečega (NIR) svetlobe izpostavljenosti. APSC sestoji iz monoklonskih protiteles rakom celično specifično (mAb) in fotosenzibilizator, IR700, ki je silicijev dioksid-ftalocianin derivat, kovalentno konjugiran na protitelesa. APSC veže ciljne molekule na celično membrano in nato inducira skoraj takoj celično nekrozo po izpostavljenosti NIR svetlobo pri 690 nm. vitro
študije so pokazale, PIT za zelo specifičen za celice, zato celice, ki niso izražajo neposredno mejijo na ciljnih celic ne kaže nobenih toksičnih učinkov [5]. Celice, zdravljenih s PIT podvržene hitri volumensko ekspanzijo, ki vodi do pretrganja celične membrane, iztiskanje vsebine celic v zunajcelični prostor, in ireverzibilni nekroza [6] - [8]. Naši rezultati in drugi, kažejo, da se citotoksičnost s PIT povzroča popolnoma ne zanašajo na reaktivnih kisikovih ali obstoj kisikov quenchers [9]. Poleg tega so citotoksičnost s PIT povzroča predvsem v celične membrane in ne v mitohondrije, kot se pojavlja v PDT.

Čeprav PIT posledico hitre celične nekroze, skupni obseg tumorja ne sme spremeniti za več dni. To je zato, ker je potrebno vsaj nekaj dni za makrofagov za vstop, proces in zapustiti tretirano tumor. Zato, nove metode, ki presega meritve velikosti, so potrebni za spremljanje učinkov PIT. Fluorescence beljakovine (PPT), ki se običajno uporablja za vizualizacijo celičnih procesov [10], [11]. Medtem ko je večina Rezultati apoptotske celične smrti v ohranjanje celične membrane in hrambe OP bi fluorescence neobčutljiv na celično smrt [12], [13], v PIT, nenadna pretrganje celičnih membran povzroča ekstruzijo citoplazemske OP in zato je relativno hitro odčitavanje celične smrti. Prednost okvirnih programov za in vivo
slikanje je, da ne zahtevajo eksogene injekcije zastopnikov (na primer luciferin v primeru bioluminiscenco) in ga je mogoče spremljati v realnem času [14] - [18]. Saj zahteva genski transfekciji, bi verjetno uporaben le v predkliničnih raziskavah.

V tej študiji smo preučili učinkovitost PIT v mišjem modelu, ki se razširjajo peritonealno raka želodca uporabo in vivo GFP fluorescence slikanje na spremljanje odziva.

materiali in metode

Reagenti

topna v vodi, silicij-ftalocianin derivat, IRDye 700DX NHS estra in IRDye 800 CW NHS kisline so pridobljeni iz LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, ZDA). Panitumumab, popolnoma humanizirano IgG _{2 mAb usmerjena proti EGFR, je bila kupljena od Amgen (Thousand Oaks, CA, ZDA). Trastuzumab, 95% humanizirano IgG 1 mAb usmerjena proti HER2, je bila kupljena od Genentech (South San Francisco, CA, ZDA). Vse druge kemikalije so reagenta razreda.}

Sinteza IR700-konjugiranega trastuzumabom ali panitumumaba in IR800 konjugiranih trastuzumab

konjugacijo barv s je mAbs izvedli v skladu s predhodnim poročilom [19]. Na kratko, panitumumaba ali trastuzumabom (1 mg, 6,8 nmol) inkubirali z IR700 NZS estra (60,2 mikrogramov, 30.8 nmol) ali IRDye 800 CW NZS estra (35.9 fig, 30.8 nmol) v 0,1 mol /L Na _{2HPO 4 (pH 8,6) pri sobni temperaturi 1 uro. Zmes smo očistili s Sephadex G50 koloni (PD-10; GE Healthcare, Piscataway, NJ, ZDA). Koncentracija beljakovin je bila določena z Coomassie Plus protein test komplet za (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, ZDA) z merjenjem absorpcije pri 595 nm z spektroskopijo (8453 Vrednost sistema; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ZDA). Koncentracija IR700 ali IR800 bila izmerjena oziroma z absorpcijo pri 689 nm ali 774 nm s spektroskopijo potrditi števila fluorofor molekul konjugiranih na vsako mAb. Sintezo smo kontrolirali, tako da je bilo povprečje štirih IR700 molekul in dva IR800 molekul vezan na eno protitelo. Izvedli smo SDS-PAGE kot kontrolo kakovosti za vsako konjugata, kot smo že poročali [19]. Mi Skrajšati IR700 konjugirano trastuzumab kot tra-IR700, da panitumumab kot pan-IR700 in IR800 konjugirano trastuzumab kot tra-IR800.}

bile kupljene celični kulturi

N87-GFP celice stabilno izražajo GFP iz ANTI RAKA (San Diego, CA, ZDA). Visoka izražanje GFP je bil potrjen v odsotnosti selekcijskega sredstva s 10 prehodov. Da bi ocenili posebno ubijanje celic po dohodnini, so 3T3 stabilno izražajo DsRed (3T3 /DsRed) uporabimo kot negativno kontrolo [5]. Celice gojimo v RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD, ZDA) z dodatkom 10% fetalnega govejega seruma in 1% penicilin /streptomicina (Life Technologies) pri tkivne kulture bučkah v navlaženem inkubatorju pri 37 ° C ob atmosferi 95 % zraka in 5% ogljikovega dioksida

fluorescenčno mikroskopijo

Da bi odkrili antigensko specifični lokalizacijo IR700 konjugatov in spremembe morfologije celic po dohodnini, je bila fluorescenčna mikroskopija izvedena (IX61 ali IX81.; Olympus Amerika, Melville, NY, ZDA). Deset tisoč celice smo posejali v pokrov stekla dnom posode in inkubirali 24 ur. Tra-IR700 Nato dodamo v gojišče (fenol rdeče prosto) pri 10 ug /ml in inkubiramo pri 37 ° C 6 ur. Celice smo nato sprali s PBS; Propidium jodid (PI) (1:2000) ali Cytox Blue (1:500) (Life Technologies) dodamo k medije 30 minut pred PIT odkriti odmrle celice. Celice smo nato izpostavili NIR svetlobo in Dobimo serijskih slik. En dan po dohodnini, smo celice sprali in inkubirali z novim medijem po PIT (0,5 J /cm ^{2) in PI je ponovno dodal. Da bi zagotovili, da je bil isti regiji posnel oznake, ki so bile narejene na vsaki kulturi jed, ki pove, v kateri je bilo slikanje pridobili. Filter je bil določen za odkrivanje IR700 fluorescence s vzbujanja filtrom 590-650 nm, in 665-740 nm pas mimo filtra emisij. Analiza posnetkov je bila izvedena z ImageJ programsko opremo (http://rsb.info.nih.gov/ij/).}

pretočno citometrijo

fluorescence iz celic po inkubaciji s pan-IR700 ali tra-IR700 so merili s pretočnim citometrom (FACS Calibur, BD BioSciences, San Jose, CA, ZDA) in Cellquest (BD bioznanosti). Celice (1 x 10 ^{5) inkubiramo z vsako konjugatom 6 ur pri 37 ° C. Potrditi specifične vezave konjugiranega protitelesa, je bil presežek protitelo (50 mikrogramov), uporabljen za blokiranje 0,5 ig barvah-protitelo konjugatov [8].}

vitro PIT

sto tisoč celic smo zasejali v 24 vdolbinami ter inkubiramo 24 ur. Gojišča je bil nadomeščen s svežo gojišča, ki vsebuje 10 ug /ml do tra-IR700 in celice inkubiramo 6 ur pri 37 ° C. Po spiranju s PBS, dodamo fenol rdečega proste gojišča. Nato smo celice obsevali z NIR lasersko svetlobo pri 685 do 695 nm valovne dolžine (BWF5-690-8-600-0.37; B &. W TEK INC, Newark, DE, ZDA). Dejanska gostota moči mW /cm ^{2 smo merili z optičnim merilnikom moči (PM 100, Thorlabs, Newton, NJ, ZDA).}

Citotoksičnost test

citotoksične učinke PIT s tra-IR700 so bili določeni s pretočno citometrijo PI madeži, ki zazna ogrožena celične membrane. Za pretočno citometrijo testom smo celice tripsinizirali 1 h po zdravljenju in speremo s PBS. PI dodamo v celični suspenziji (končna 2 mg /ml) in inkubirali pri sobni temperaturi 30 minut, čemur sledi pretočna citometrija.

Oceno GFP intenzitete fluorescence vitro

Ena sto tisoč celice smo posejali v pokrov stekla dnom posode in inkubirali 12 ur. Tra-IR700 Nato dodamo v gojišče (fenol rdeče prosto) pri 10 ug /ml in inkubiramo pri 37 ° C 6 ur. Celice speremo s PBS in jo nadomestiti z novo, fenol rdečega medij prost kulture in pod strani pokrivnega stekla je označeno (za določanje položaja opazovanje). Po PIT smo celice ponovno inkubiramo 1 dan. En dan po dohodnini, so znova opazili celice. Intenzivnost GFP je bil ocenjen z vseh pik z enakim pragom na istem področju [20]. Analiza posnetkov je bila izvedena z ImageJ programsko opremo (http://rsb.info.nih.gov/ij/).

fluorescence iz obdelanih celic smo merili tudi z uporabo pretočnim citometrom (FACS Calibur).
Živalski in tumor

Vse in vivo
postopki so bili opravljeni v skladu z navodili za nego in uporabi laboratorijskih živalih virov (1996), ameriškega nacionalnega raziskovalnega sveta, in odobril odbor za oskrbo in uporabo NIH živali. Šest- do osem tednov starih ženski homozigoti gole miši so bile kupljene od Charles River (NCI-Frederick). Da bi lahko ocenili samo neposredni tumorskih celic ubili učinek in vivo
PIT, so bili uporabljeni z oslabljenim imunskim sistemom golih miši. Med postopki, smo miši anestezirali z izofluranom. Deset milijonov N87-GFP celic smo injicirali subkutano v desnem dorsum miši. Da se določi volumen tumorja je bila največja vzdolžna premer (dolžina) in največji prečni premer (širina), merjeno z zunanjim čeljusti. Obseg tumor, ki temeljijo na meritvah čeljusti so bili izračunani po naslednji formuli; volumen tumorja = dolžina x širina ^{2 x 0,5. Tumorji, ki segajo približno 100 mm 3 obsega smo izbrali za študijo. Za merjenje GFP fluorescence po PIT je bilo deset milijonov N87-GFP celic podkožno injicirali v obe dorsi miši. Za širi peritonealno modelu raka miške, je bilo petdeset milijonov N87-GFP celice s PBS (skupno 300 ul) vbrizga v peritonealno votlino.}

In vivo fluorescence slikanje

V vivo
fluorescence slike so bili pridobljeni s Pearl Imager (LI-COR biološke znanosti) za odkrivanje IR700 /IR800 fluorescence, in Maestro Imager (CRI, Woburn, MA, ZDA) za GFP. Za dobre kmetijske prakse, so bili uporabljeni pasovno prepustni filter od 445 do 490 nm (vzbujanje) in dolgo prelaz modrim filtrom več kot 515 nm (emisije) a. Filter nastavljivi emisij je bil samodejno stopil v 10 korakih nm od 500 do 600 nm za zelene filtrov sklopov pri stalni izpostavljenosti (500 milisekund). Spektralne fluorescence slik sestavljena iz avtofluorescenco spektrov in spektrov z GFP (N87-GFP tumorja), ki so bile nato unmixed, ki temelji na značilno spektralno vzorcu GFP, s pomočjo Maestro programske opreme (CRI). Regije interesa (Rois) so ročno sestavljeni bodisi na bok tumorja ali več kot primeren za modela in fluorescenčno intenziteto predelu trebuha je bila izmerjena [19].

Karakterizacija razširjajo peritonealne mišjem modelu

Miške bodisi širi rakom trebušne (na 6 tednov po celic implantaciji) ali bočnih tumorji (po 7 dneh po mobilni implantaciji) intravenozno vbrizgali 100 mg za tra-IR700 in tra-IR800. En dan po injiciranju, so serijske podobe izvaja z Pearl Imager za odkrivanje IR700 /IR800 fluorescenco, in Maestro za GFP. Bela svetloba podobe miši so bili pridobljeni z iphone5 (Apple Inc., Cupertino, CA, ZDA).

In vivo PIT

Da bi lahko ocenili učinek PIT v modelu bok so N87-GFP miši s tumorjem pri čemer naključno v 4 skupine najmanj 10 živali na skupino, kot sledi: (1) niso bile zdravljene (kontrolna); (2) samo izpostavljenost NIR svetlobe pri 50 J /cm ^{2 na dan 1 in 100 J /cm 2 2. dan; (3) 100 ig tra-IR700 i.v., brez izpostavljenosti NIR svetlobe; (4) 100 ig tra-IR700 i.v. je NIR svetloba dajali v 50 J /cm 2 1. dan po injiciranju in 100 J /cm 2 na po injekciji 2. dan. so se ti pogoji vsak teden do 3 tedne. Miši dnevno spremlja, in so bili pridobljeni fluorescence slike se začne 1 dan pred dohodnini, in obseg tumor smo izmerili trikrat na teden, dokler premer tumorja dosegel 2 cm, nakar so bile miši žrtvovati z ogljikovim dioksidom. Za fluorescenčno slikanje, miši vbrizgali 100 mg za tra-IR700 ali obsevana, kot sledi: (1) NIR svetloba je bil uporabljen pri 50 J /cm 2 1. dan po injiciranju in 100 J /cm 2 na dan 2 na desni tumorja (2) ni NIR svetloba smo dajali na levi tumorja, ki je služil kot kontrolo. Kontrole vključeno (1) samo izpostavljenost NIR svetlobe pri 50 J /cm 2 na dan 1 in 100 J /cm 2 na dan, 2 na desni tumorja; (2) ni zdravila za levo tumorja}

Za oceno razširjajo raka peritonealno miši naključno razdelili v 4 skupine po 5 živali na skupino za naslednjih načinov: (1). Nobenega zdravljenja (nadzor); (2) samo izpostavljenost NIR svetlobe pri 50 J /cm ^{2 na dan 1 in 100 J /cm 2 2. dan; (3) 100 ig tra-IR700 i.v., brez izpostavljenosti NIR svetlobe; (4) 100 ig tra-IR700 iv, je NIR svetloba dajali v 50 J /cm 2 na dan 1 in 100 J /cm 2 na po injiciranju 2. dan.}

statistični analizi

Podatki so izraženi kot sredstvo ± SEM od najmanj štirih poskusov, razen če ni navedeno drugače. Statistične analize so bile izvedene s pomočjo programa za statistiko (GraphPad Prism, GraphPad Software, La Jolla, CA, ZDA). Za multiple primerjave smo uporabili enosmerno analizo variance (ANOVA), s po (preskus Kruskal-Wallis s post-testu) in Tukey testu. Kumulativna verjetnost preživetja, tu določena kot premer tumorja zaostaja za 2 cm, je bila ocenjena v vsaki skupini z uporabo analize krivulje preživetja Kaplan-Meier, in rezultati so bili v primerjavi s testom log-rank in test Wilcoxonov. Študent je t
testu smo uporabili tudi za primerjavo dveh in vitro
študije; p < 0,05 je zdelo, da kažejo na statistično pomembno razliko

Rezultati

Potrditev izražanja profila N87-GFP celic kot cilj za PIT

Pregledali smo fluorescence signale. od pan-IR700 in tra-IR700 vezan na N87-GFP celic s FACS. Po 6 h inkubaciji bodisi s pan-IR700 ali tra-IR700, N87-GFP celice dosledno pokazala višjo svetlost s tra-IR700 kot pan-IR700 (sl. 1A). Ti signali so bili skoraj popolnoma blokiran z dodatkom prebitka trastuzumab ali panitumumab, kar kaže na specifične vezave in potrditev višjo ekspresije HER2 kot EGFR [21]. Ti podatki kažejo, da je HER2 najbolj zaželena tarča PIT v N87-GFP celic zaradi višjega izražanja.

mikroskopija in vitro PIT

Serial fluorescenčno mikroskopijo N87-GFP celic je bila izvedena pred in po PIT. Po izpostavitvi NIR svetlobi (2 J /cm ^{2) celični oteklina, postavitev bleb in pretrganja lizosomska so opazili, zaradi česar ekstrudiranjem citoplazmi ekstracelularno (sl. 1B). PI obarvanje pokazala akutne poškodbe citotoksična membrane s PIT povzročil. Večina teh celičnih sprememb je bilo v 30 minutah svetlobe izpostavljenosti (dodatne informacije video S1 in S2) opazili. Bistvenih sprememb ni bilo v EGFR-negativni zazna 3T3 obsevanih z NIR svetlobe, kar kaže PIT povzročil nobene škode na neciljne celic (sl. S1).}

Vrednotenje in vitro PIT učinek

da bi kvantitativno učinek vitro
PIT, smo izvedli citotoksičnost test, ki temelji na vključitvi PI, ki je pokazala, da je celična smrt povečala z večjim odmerkom svetlobe (sl. 1C). Ni pomembno citotoksičnost je bila odkrita z NIR svetlobnega ali tra-IR700 sam.

Vrednotenje z GFP fluorescence in vitro po PIT

En dan po izpostavitvi NIR svetlobi 0,5 J /cm ^{2, približno 50% celic pokazala akutne citotoksičnost (sl. 1C), intenzivnost GFP fluorescence je bila močno zmanjšana v mrtvih celic (obarvanih pozitiven PI), medtem ko je GFP fluorescence ohranjena v preživelih celic (Fig. 1D). Te študije kažejo, da je GFP iztisne iz celice po membrane rupture. Da bi raziskali spremembe v GFP fluorescence smo primerjali skupno GFP pik na istem področju, pred in en dan po tem, ko PIT (sl. S2). Razmerje GFP fluorescence neposredno zmanjšal z odmerkom svetlobe, medtem ko je bilo nobenega padca zazna z izpostavljenostjo NIR svetlobo ali tra-IR700 sam (sl. 1E). Ti rezultati so potrdili FACS analizo (sl. 1F in sl. S3) in kažejo, da PIT vodi do zmanjšanja GFP fluorescence naslednjega nekrotičnemu celične smrti 1. dan po PIT na način, odvisno od svetlobnega odmerka.}

In vivo PIT zmanjša volumen tumorja v ledvenem modelu ksenotransplantskih

Nato smo preučili vpliv PIT in vivo
na ledvenem predelu tumorja, ki nosi miši (sl. 2A). PIT povzročil znatno zmanjšanje volumna tumorja (n = 10 v vsaki skupini, * p = 0,0456 < 0,05, Tukey test). Štiri miši od desetih v PIT skupini so bile popolnoma odpravljena z zdravljenjem (sl. 2B). Preživetje je bistveno podaljša v skupini PIT v primerjavi s kontrolno skupino (n = 10 v vsaki skupini, ** p < 0,0001, test dolge čin in preskus Wilcoxonov) (slika 2C).. Ti podatki kažejo, da PIT povzročila znatno zmanjšanje tumorja in podaljšano preživetje in vivo
.

GFP fluorescence slikanje po in vivo PIT v ledvenem modelu ksenotransplantskih

Za spremljanje vivo
PIT, v realnem času GFP slikanje je bila opravljena na miših z N87-GFP dvostranski bočnih tumorjev (sl. 3A). GFP fluorescence je pokazala tumorjev in odziv na PIT. GFP fluorescence je bila povezana z IR700 fluorescence, ki je hitro zmanjšal po PIT (sl. 3C). Skupaj fluorescence slikanje (TFI) GFP pri nezdravljenih tumorjev (kontrola) in v tumorjih, ki so prejemali luč povečal samo zaradi rasti tumorja. Pri tumorjih, zdravljenih z PIT, TFI GFP postopno zmanjšal v obdelanem tumorja, nasprotno tumor v istem miško (iv samo, brez svetlobe), medtem ko je pokazala povečano GFP fluorescence (sl. 3B).

Količinska skupaj GFP intenziteta fluorescence je pokazala, da je prišlo do pomembnega zmanjšanja po PIT (n = 5 miši v vsaki skupini, * p = 0.0118 < 0,05, ** p = 0,0010 < 0,01, *** p = 0,0049 < 0,01, Tukey je preizkus z ANOVA) (sl. 3C). Zaradi tumorja ponovne rasti, je razmerje GFP po PIT spet povečal iz 4. dan, čeprav je bila nižja kot v drugih kontrolnih skupinah. realnem času GFP fluorescence slikanje in njena količinska omogočeno realnem času primerjavo skupin in pokazala močno povezavo med visokošolskim GFP fluorescence in napredovanja tumorja v vsaki skupini.

Za potrditev tega učinka, ex vivo
analiza je bila opravljena (sl. 4A). Učinek PIT je bila potrjena z zmanjšanjem IR700 fluorescence (sl. 4B). Pod tem pogojem, intenzivnost GFP z ex vivo
tumorjev zmanjšalo po PIT (sl. 4B). Ti podatki kažejo, da je v realnem času GFP v živo slikanje v skladu s ex vivo
slikanje.

Ko se je PIT ponovili tedensko, GFP fluorescence dejavnost sčasoma izginila (sl. 4C in D), kar kaže na popolno ubijanje tumorja.

Karakterizacija širi peritonealne model z fluorescence slikanje

da bi določili naravno zgodovino širi peritonealno modela, je bila serijska fluorescence slikanje opravili. Vsajene tumorji je pokazala visoko fluorescentni signal, s IR700, IR800, in GFP, ki so vsi sočasno lokalizirano seboj (IR800 je bila uporabljena za preprečevanje črevesne avtofluorescenco) (sl. 5). Ti podatki kažejo, da je ta model, ki se razširjajo raka peritonealne mogoče spremljati v živo miših z uporabo GFP fluorescence.

GFP fluorescence slikanje po in vivo PIT v razširjajo peritonealno modelu

Real-time GFP fluorescence slikanje je izvedemo v širi peritonealno modela pred in po PIT (sl. 6A). IR700 fluorescence zmanjša po PIT (Sl. S4). GFP TFI v skupinah, ki niso popisa fizičnega inventarja postopoma povečuje zaradi rasti tumorja. V PIT skupini, zdravljeni, GFP TFI zmanjšal od 1 dan do 3. dan po PIT (sl. 6B). Količinsko celotne intenzitete GFP fluorescence pokazale znatno zmanjšanje po PIT (n = 5 miši v vsaki skupini, * p = 0,0295 < 0,05, ** p = 0,0355 < 0,05, Kruskal-Združeni preskus s post-testu) (sl. 6C). Zaradi tumorja ponovne rasti, je razmerje GFP po PIT spet povečal s 4 dan, čeprav je ohranila nižja kot druge skupine, podobno kot pri modelu bok tumorja. Tako PIT povzročila znatno ciljno tumor ubijanje v obeh bokih in razširjajo peritonealno tumorske modele in to bi bilo mogoče spremljati z GFP TFI.

Pogovor

Ta študija kaže, da je lahko učinek PIT spremljati z GFP fluorescence slikanje. Za razliko od apoptoze [12], [13], v katerem GFP in s tem povezane fluorescenčne beljakovine postanejo svetlejše zaradi zmanjšanega citoplazemski obsega, med nekrotične celične smrti s PIT, poškodbe membrane vodi do sproščanja citoplazme vsebin, vključno z dobro kmetijsko prakso. Ta edinstvena značilnost GFP in s tem povezanih fluorescenčnih proteinov jih naredi uporabne biomarkerjev za PIT.

V vivo
GFP fluorescence slikanje omogoča celoten proces tumorigeneze, zdravljenje, regresija, metastaz, ali ponovila, da odkriti v istem živali brez invazivnih postopkov [10], [11]. Z uporabo celice, ki izražajo citoplazemske GFP so lahko učinki antitumorskih jih PIT inducirani se zlahka spremljati zaradi iztiskanja GFP iz obdelanih celic.

Koncept uporabe usmerjeno svetlobno terapijo je stara več kot tri desetletja [22]. Zaradi hidrofobnosti tradicionalnih fotodinamična terapija (PDT) preobčutljivosti, je farmakokinetika protitelesa konjugirana PDT agentov zelo omejeno sposobnost, da poda konjugatov do cilja. Zato je PDT občutljivi usmerjene s protitelesi bila uspešna le pri modelih, kjer je konjugirana vbrizgamo neposredno v tumor ali potrebušnice [23]. Da bi dosegli konjugata protitelesa fotosenzibilizator (APSC) sistematično povečali, je treba fotosenzibilizator biti prednostno hidrofilne. Hidrofilni temelji na ftalocianin fotosenzibilizatorja, IR700DX ko konjugirana s protitelesom postane APC, ki jih lahko dajemo intravenozno. Ta oblika terapije, imenovana PIT razlikuje od tradicionalnega PDT ne samo v hidrofilnost od fotosenzibilizator, temveč tudi v svoji odvisnosti od NIR svetlobi bi aktivirali fotosenzibilizatorja. NIR svetloba ima boljše prodiranje tkivih kot nižje valovne dolžine svetlobe, ki se uporablja v PDT. Ta nova generacija APC kaže podobne intravenskih farmakokinetiko odprtemu protiteles, zaradi česar je zelo ciljno kopičenja tumorja z minimalno non cilj zavezujoč in se lahko uporablja za širok spekter protiteles, ki omogoča veliko potencialnih aplikacij po vsem telesu.

Kljub citotoksična kemoterapija, izid za napredovalega raka oder želodca še vedno slaba. Ker je večina bolnikov s peritonealno metastazami prisotne zahrbtnih simptomi, kot so slaba teka, hujšanje, napenjanje občutek, bolečina ali anemija diagnozo pogosto zamudo in lokalne terapije niso več mogoče [24]. PIT je obetaven postopek za zdravljenje raka razširjajo peritonealno. Da bi izvedli učinkovito PIT je treba APSC dostavi sistemsko in luč mora biti selektivno nanesen na peritonej. Pod temi pogoji je dovolj dostava APSCs za posledico zmanjšanja razširjenih tumorjev po PIT. Ta proces lahko spremljamo v realnem času in vivo
GFP fluorescence slikanje.

Obstaja nekaj omejitev v tej študiji. Treba je opozoriti, da so vsi želodčni rak ne izražajo HER2 in zato tra-IR700 ne sme biti enakomerno učinkovita pri razširjajo rak želodca. Dejansko je morda potrebno uporabiti za koktajlom APSCs učinkovito pokriva večino profilov ekspresijskih v danem tumorja [25]. Drugo opozorilo v tej raziskavi, je, da se lahko svetloba dajemo transkutano v majhnih miših, vendar to ni mogoče pri ljudeh. Za učinkovito zdravljenje ljudi z PIT, bo treba uporabiti svetlobo laparoskopsko za preprečevanje absorpcije skozi kožo. Druga omejitev je, da je naš model ocenili le z oslabljenim imunskim sistemom miših. Imunološko reakcijo PIT bo ocenjen v prihodnosti imunokompetentnih miših. Nazadnje, v bližini term GFP fluorescence slikanja bo omejena na študij na živalih, saj zahteva transfekciji tumorja z endogenega proteina. Kljub temu, da je to koristno na števcu za predkliničnih raziskavah.

Sklepi

PIT je učinkovit proti HER2 pozitivnega raka želodca peritonealno karcinomatozo v modelu miši in GFP fluorescence slikanje z omogoča spremljanje pit učinkov.

Podpora Informacije
Slika S1.
Posebni ciljno usmerjeni celična smrt necrotic opazili po PIT in vitro.
N87-GFP celice so co-gojili z 3T3 (HER niso izražanje) celic /DsRed. Ti so bili zdravljeni s tra-IR700 in upoštevati (pred in po obsevanju NIR svetlobe). Ciljno usmerjena specifično nekrotične celične smrti so opazili na vzbujanje z NIR svetlobe (po 30 min). Ni škoda je bila dokazana v 3T3 /DsRed celic. . * 3T3 /DsRed celic, Bar = 25 mikrometrov
doi: 10,1371 /journal.pone.0113276.s001
(TIFF)
Slika S2.
zmanjšuje za GFP-fluorescence na 1 dan po PIT opazili in vitro.
Zmanjševanje intenzivnosti GFP-fluorescence na 1 dan po tem, ko je bil PIT opazili, da se na način, ki je odvisen od odmerkom svetlobe. Bar = 100 um. Črna črta na robu je marker za določanje položaja opazovanja
doi:. 10,1371 /journal.pone.0113276.s002
(TIFF)
Slika S3.
Zmanjšanje GFP-fluorescence na 1 dan po PIT ovrednotili s pretočno citometrijo. Zmanjšuje intenzivnost GFP-fluorescence na 1 dan po tem, ko je bil PIT na način, odvisno od odmerkom svetlobe z analizo pretočno citometrijo
doi:. 10,1371 /journal.pone.0113276.s003
(TIFF)
Slika S4.
V vivo
fluorescence slikanje v odgovor na ponavljajoče PIT v peritonealno razširjajo miši modelu. V vivo
fluorescence slikanje v odgovor na ponavljajoče PIT. IR700 fluorescence se je zmanjšala v odgovor na PIT
doi:. 10,1371 /journal.pone.0113276.s004
(TIFF)
Video S1.
intervalih DIC podobe N87-GFP celic zdravi z jamo. Čas-lapse sekvenčni DIC slike (video) s N87-GFP celic kaže morfološke spremembe celic po NIR osvetlitvijo v celicah, zdravljenih s tra-IR700 (za opazovanje 25 min v vseh). Utripajoča luč je NIR svetloba za obsevanje (2 J /cm ^{2)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0113276.s005
(AVI)
Video S2.
intervalih PI fluorescence podobe N87-GFP celic tretiranih s PIT. Čas-lapse sekvenčni PI fluorescence slike (video) kaže hitro poškoduje membrano N87-GFP celic po NIR osvetlitvijo v celicah, zdravljenih s tra-IR700 (za opazovanje 25 min v vseh). Utripajoča luč je NIR svetloba za obsevanje (2 J /cm 2)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0113276.s006
(AVI)}

Priznanja

Ta raziskava je bila podprta z raziskovalnega programa Notranji od National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center za raziskave raka. Kazuhide Sato je podprta z JSP Research Fellowship za japonsko biomedicinskimi in vedenja, ki jih raziskovalci na NIH.

• Plos ONE: MED30 Uravnava širjenju in gibljivost želodčnega raka celic
• Plos ONE: Primerjalna Proteomika analiza želodca rakavih matičnih celic