PLoS ONE: Photoimmunotherapy skrandžio vėžio peritoninės karcinomatoze pelių modelis

Anotacija

Photoimmunotherapy (GPM) yra naujas vėžio gydymo, kuris sujungia antikūnų specifiškumo orientacija navikai su toksiškumo sukeltos Fotosensibilizatorių po kontakto su šalia infraraudonųjų spindulių (NIR) šviesos. Mes atlikome GPM kurį platinama skrandžio vėžio peritoninės karcinomatoze modelį ir stebėti efektyvumą su vivo pervežimas GFP fluorescencijos vaizdų. in vitro parsisiųsti ir vivo
eksperimentai buvo atliekami su HER2 ekspresija, GFP ekspresija, skrandžio vėžio ląstelių linijos (N87-GFP). Konjugatas susideda iš fotosensibilizatoriaus, IR-700, konjuguoto su trastuzumabo (TRA-IR700), o po to NIR šviesos buvo naudojamas GPM. in vitro
GPM buvo įvertintas matuojant citotoksiškumo su negyvos dažymo ir į GFP fluorescencijos sumažėjimą. , in vivo
GPM buvo įvertintas platinamos peritoninės karcinomatoze modelį ir šono ksenotransplantanto naudojant naviko apimties matavimus ir GFP fluorescencijos intensyvumą. , in vivo
antinavikinio poveikio GPM buvo patvirtinta ženkliai sumažinti naviko apimtį (bent dieną 15, p < 0,0001 vs valdymas) ir GFP fluorescencijos intensyvumas (šoninė Modelis: ne 3 dieną, GPM elgiamasi Vs. kontrolė p < 0,01 ir pilvaplėvės SKLEIDŽIAMAI modelis:-ą dieną 3 GPM gydyti, lyginant su kontrole, p < 0,05). Citotoksinis poveikis in vitro
buvo įrodyta, kad būti priklausoma nuo šviesos dozės ir sukėlė nekrotinį ląstelių plyšimas, vedantį į GFP išleidimo ir fluorescencijos intensyvumas in vitro sumažėjimas.
Taigi, nuostolis GFP fluorescencijos tarnavo kaip naudingas biologinis žymuo ląstelių nekrozė po GPM

nurodomoji dalis:. Sato K Choyke PL, Kobayashi H (2014) Photoimmunotherapy skrandžio vėžio peritoninės karcinomatoze į pelių modelis. PLoS ONE 9 (11): e113276. Doi: 10,1371 /journal.pone.0113276

redaktorius: Irina V. Lebedeva, Kolumbijos universitetas, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Lie 2, 2014 m Priėmė: Balandis 21, 2014 m Paskelbta: Lapkričio 17, 2014

Tai atviros prieigos straipsnio be visų autorių, ir gali būti laisvai atgaminti, platinti, perduoti, keisti, pastatytas ant, ar jos kitaip nenaudojamos niekam bet kuriam teisėtam tikslui. Darbas prieinamas pagal Creative Commons CC0 viešo atsidavimą

Duomenų Prieinamumas:. Autoriai patvirtina, kad visi duomenys, kuriais grindžiamos išvados visiškai prieinama be apribojimų. Visi atitinkami duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

Finansavimas:. Šis darbas buvo remiamas NIH vidines programos ir JSP tyrimų stipendija. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys sukelia daugiau nei 740,000 vėžio susijusių mirčių per metus visame pasaulyje, ypač Azijoje [1] - [3]. Skrandžio vėžiu sergančių pacientų dauguma dalyvaujančių Lokaliai progresavusiam, pasikartojantį ar metastazavusio neleidžiantys chirurginio gydymo, kad dažniausiai valdo ne gydomoji terapija [1]. Pilvaplėvės karcinomatoze ir kepenų metastazių yra bendri, gyvybei grėsmingos apraiškos pažengęs skrandžio vėžio [1], [4]. Pilvaplėvės karcinomatoze taip pat pasitaiko kiaušidžių, apendikulinį, storosios žarnos, kasos ir skrandžio vėžio. Prognozė yra visuotinai prasta ir vietos gydymas yra visada nesėkmingas su dideliu pasikartojimo normos ir sergamumo, susijusių su ascitu ir žarnyno obstrukcija. Sisteminis gydymas yra taip pat paprastai nesėkmingas. Taigi, reikia naujų metodų gydant peritoninė karcinomatoze.

Photoimmunotherapy (GPM) yra naujas taikinys ląstelių specifinis vėžio gydymo, kuris dirba antikūno fotosensibilizatoriaus junginys (APSC), po to netoli infraraudonųjų spindulių (NIR) šviesos poveikio. APSC susideda iš vėžio ląstelėms būdingas monokloninis antikūnas (mAb) ir fotosensibilizatoriaus, IR700, kuri yra silicio dioksidas-ftalocianino darinys, kovalentiškai konjuguotas su antikūnais. APSC jungiasi tikslines molekules ant ląstelės membranos ir tada sukelia beveik nedelsiant ląstelių nekrozė po kontakto su NIR šviesą 690 nm. in vitro
tyrimai parodė, GPM būtų labai ląstelėms būdingas, todėl neturintys išreikšti ląstelės greta tikslinių ląstelių neturi jokių toksinių efektų [5]. Ląstelės gydomiems GPM vyksta greitas tūrio išsiplėtimo, vedantį į plyšimas ląstelės membranos, ekstruzijos būdu iš ląstelių turinį į ekstraląstelinio vietą, ir negrįžtamas nekrozės [6] - [8]. Mūsų rezultatai ir kiti įrodyti, kad citotoksiškumo sukeltas GPM nėra visiškai pasikliauti reaktyvių deguonies formų arba singletinio deguonies egzistavimą slopinamųjų medžiagų [9]. Be to, citotoksiškumo sukeltas GPM yra visų pirma per ląstelės membranos, o per mitochondrijų, kaip tai atsitinka fotodinaminės terapijos.

Nors GPM rezultatai greitai ląstelių nekrozės, bendras tūris naviko negali pakeisti keletą dienų. Tai yra, nes jis trunka mažiausiai kelias dienas makrofagai įvesti, apdoroti ir palikti apdorotą auglį. Todėl, nauji metodai, ne tik išmatuoti dydį, reikia stebėti GPM poveikį. Fluorescencijos baltymai (BP) yra dažniausiai naudojamas vizualizavimo ląstelių procesus [10], [11]. Nors dauguma aprotoninis ląstelių mirtis rezultatai išsaugoti ląstelių membranos ir saugojimo BP priėmimo fluorescencija nejautrus mobiliuosius mirtį [12], [13], į duobę, bet staiga plyšimas ląstelių membranų rezultatai ekstruzijos iš citoplazmos bendrųjų ir todėl jo gana greitai Skaitliuko ląstelių mirtį. Kurio bendrųjų privalumas in vivo, pervežimas vaizdavimo yra tai, kad jie nereikalauja išorinius injekcijų agentų (pvz luciferin atsižvelgiant į švytėjimą atveju) ir gali būti stebimi realiu laiku [14] - [18]. Kadangi jie reikalauja genų transfekcijq, jie greičiausiai būtų tik naudinga ikiklinikinių tyrimų.

Šiame tyrime mes išnagrinėjo GPM veiksmingumą pelės modelio platinamos peritoninės skrandžio vėžio naudojant in vivo GFP fluorescencijos vaizdus į stebėti atsaką.

medžiagos ir metodai

Reagentai

Vandenyje tirpus, silicio ftalocianino darinys, IRDye 700DX NHS esteris ir IRDye 800 CW "NHS esteris buvo gauti iš Li-COR biologijos mokslų (Lincoln, NE, JAV). Panitumumabas, pilnai žmogiškas IgG _{2 mAb nukreiptas prieš EGFR, buvo įsigytas iš Amgen (Thousand Oaks, CA, JAV). Trastuzumabu, 95% žmogiškas IgG 1 mAb nukreiptas prieš HER2, buvo įsigytas iš Genentech (Pietų San Francisko, CA, JAV). Visi kiti chemikalai buvo reagento lygio.}

sintezė IR700 konjuguoto trastuzumabu ar panitumumabo ir IR800 konjuguoto trastuzumabu

konjugacija dažiklių su mAb buvo atlikta pagal ankstesnį ataskaitą [19]. Trumpai tariant, panitumumabu ar trastuzumabu (1 mg 6,8 nmol) buvo inkubuojama su IR700 NHS esteris (60,2 mikrogramų, 30,8 nmol) arba IRDye 800 CW NHS esteris (35,9 mikrogramų, 30,8 nmol) 0,1 mol /l Na _{2HPO 4 (pH 8,6) kambario temperatūroje 1 val. Mišinys išvalytas su Sefadex G50 kolonėlę (PD-10; "GE Healthcare", Piscataway, NJ, JAV). Baltymų koncentracija buvo nustatoma su Coomassie Plius baltymų tyrimas Kit (Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford, IL, JAV), matuojant absorbciją 595 nm spektroskopija (8453 vertybių sistema; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, JAV). Iš IR700 ar IR800 koncentracija buvo matuojamas atitinkamai absorbavimo 689 nm ar 774 nm spektroskopijos patvirtinti Fluoroforas molekulių konjuguoto su kiekvienu mAb skaičių. Sintezė buvo valdomos taip, kad iš keturių IR700 molekulių ir dviejų IR800 molekulių Vidutinis buvo surištas su vienu antikūno. Mes atlikome SDS-PAGE kaip kokybės kontrolės kiekviename konjugato kaip buvo pranešta anksčiau [19]. Mes sutrumpinti IR700, konjuguoto su trastuzumabu kaip TRA-IR700, panitumumabui kaip visos IR700 ir IR800, konjuguoto su trastuzumabu kaip TRA-IR800.}

Mobilaus ryšio Kultūra

N87-GFP ląstelės stabiliai išreiškiantys GFP pirko nuo ANTI vėžys (San Diegas, CA, JAV). Aukštos GFP išraiška buvo patvirtintas atsižvelgiant į atrankos agentas su 10 ištraukas nebuvimas. Įvertinti konkrečią mobilųjį žmogžudystė GPM, 3T3 ląstelės stabiliai išreiškiantys DsRed (3T3 /DsRed) buvo naudojami kaip neigiamos kontrolės [5]. Ląstelės buvo auginamos RPMI 1640 (Life "technologijas, Gaithersburg, MD, JAV), papildytoje 10% vaisiaus galvijų serumo ir 1% penicilino /streptomicino (Life" technologijas) audinių kultūroje kolbos drėgmėje, inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje, tarp kurių yra 95 atmosferoje % oro ir 5% anglies dioksido

Fluorescencinis mikroskopas

Jei aptikti antigenui specifines lokalizacijos IR700 junginius ir ląstelių morfologijos pokytis po GPM, fluorescencija mikroskopija buvo atlikta (IX61 arba IX81.; "Olympus" Amerika, Melvilis, Niujorkas, JAV). Dešimt tūkstančių ląstelės buvo pasėtos ant dangtelio stiklo dugnu patiekalų ir inkubuojami 24 val. tada tra-IR700 buvo įtraukta į auginimo terpę (fenolio raudona laisvas) 10 mikrogramai /ml ir inkubuojami 37 ° C temperatūroje 6 val. Po to ląstelės buvo plaunamas PBS; Propidiumo jodidas (PI), (1:2000) arba Cytox Mėlyna (1:500) (Life Technologies ") buvo įtraukta į žiniasklaidos 30 min prieš GPM aptikti negyvas ląsteles. Po to ląstelės buvo veikiamos NIR šviesos ir buvo gauti serijos vaizdai. Vieną dieną po GPM, ląstelės buvo plaunami ir inkubuojama su nauja terpėje po GPM (0,5 J /cm, ^{2) ir VšĮ vėl buvo pridėta. Siekiant užtikrinti, kad tas pats regionas nufotografuotas ženklai buvo pagaminti ant kiekvienos kultūros patiekalas nurodyti, kur vaizdo įsigijo. Filtras buvo nustatytas aptikti IR700 fluorescencija su 590-650 nm sužadinimo filtru, ir 665-740 nm, juostinis emisijos filtrą. Analizė vaizdų buvo atliktas su ImageJ programinė įranga (http://rsb.info.nih.gov/ij/).}

tėkmės citometrijos

Fluorescencinis iš ląstelių po inkubacijos su visos-IR700 arba TRA-IR700 buvo matuojamas naudojant tėkmės citometre (FACS Calibur, BD BioSciences, San Chosė, CA, JAV) ir CellQuest programinę įrangą (BD biomokslų). Ląstelės (1 × 10 ^{5) buvo inkubuojamos su kiekvienu Konjugatas, skirtas 6 val 37 ° C temperatūroje. Norėdami patvirtinti specifiškai jungiasi konjuguoto antikūnų, perteklius antikūnas (50 mikrogramų) buvo naudojamas blokuoti 0,5 mikrogramų dažų-antikūno junginius [8].}

In vitro GPM

Šimtas tūkstančių ląstelių buvo pasėjamos į 24 duobučių lėkštelėse ir inkubuojami 24 val. Terpės buvo pakeistas su šviežia terpė, kurių sudėtyje yra 10 g /ml PPS-IR700 ir ląstelės buvo inkubuojami 6 val 37 ° C temperatūroje. Po plovimo su PBS, buvo įtraukta fenolio raudonasis neturinti kultūros terpė. Tada ląstelės buvo apšvitinti su NIR lazerio šviesą 685 iki 695 nm bangos ilgiui (BWF5-690-8-600-0.37; B & W. TEK INC, Newark, DE, JAV). Tikroji galia tankis mW /cm, ^{2 buvo matuojamas optinis elektros skaitiklis (PM 100, Thorlabs, Newton, NJ, JAV).}

Citotoksiškumas tyrimas

citotoksinis poveikis GPM su tRA-IR700 lėmė srauto citometrijos PI dažymą, kuri aptinka sutrikusi ląstelių membranas. Už srauto citometrijos metodu, ląstelės buvo tripsinizuojamos 1 val po gydymo ir plaunamas PBS. PI buvo pridėta į ląstelių suspensijos (galutinis 2 mikrogramai /ml) ir inkubuojama kambario temperatūroje 30 min, po to tėkmės citometrijos metodą.

įvertinimas GFP fluorescencijos intensyvumas in vitro

Vienas šimtai tūkstančių ląstelės buvo pasėtos ant dangtelio stiklo dugnu patiekalų ir inkubuojami 12 val. tada tra-IR700 buvo įtraukta į auginimo terpę (fenolio raudona laisvas) 10 mikrogramai /ml ir inkubuojami 37 ° C temperatūroje 6 val. Ląstelės buvo išplauti su PBS ir pakeistas nauju, fenolio raudonasis kultūros terpėje be ir pagal pusėje padengti stiklo buvo pažymėta (nustatyti stebėjimo poziciją). Po to, kai GPM, ląstelės buvo vėl inkubuojami 1 dieną. Vieną dieną po to, kai GPM, ląstelės vėl susidarė. GFP intensyvumas buvo įvertintas su visų pikselių su tokiu pat ribos toje pačioje srityje [20]. Analizė vaizdų buvo atliktas su ImageJ programinė įranga (http://rsb.info.nih.gov/ij/).

Fluorescencinis iš gydytų ląstelių, taip pat buvo matuojamas naudojant tėkmės citometre (FACS Calibur).

Gyvulininkystė ir navikų modelių

Visi vivo
procedūros buvo atliktos laikantis vadovas už rūpestį ir naudojimo laboratorinių gyvūnų išteklių (1996), JAV nacionalinės mokslinių tyrimų tarybos ir pagal NIH gyvūnų priežiūrai ir naudojimui komiteto patvirtintas. Šešių iki aštuonių savaičių amžiaus Patelė homozigotos athymic nuogas pelių buvo įsigytas iš Charles River (NVI-Frederick). Siekiant įvertinti tik tiesioginis naviko ląstelių žuvo poveikį buvo naudojamas in vivo
GPM imuniteto nude pelių. Per procedūras, pelėms buvo anestezuoti izofluranas. Dešimt milijonų N87-GFP ląstelės buvo švirkščiamas į poodį teisinga nugarinio paviršiaus iš pelių. Tam, kad nustatyti naviko tūris, didžiausias išilginis skersmuo (ilgis) ir didžiausias skersinis skersmuo (plotis) buvo matuojamas su išoriniu slankmačiu. Naviko apimtį remiantis apkaba matavimų buvo apskaičiuotas pagal formulę; naviko tūris = ilgis x plotis ^{2 x 0,5. Navikai siekiančių maždaug 100 mm 3 apimtį buvo pasirinktas tyrimo. Norint išmatuoti GFP fluorescencija po GPM, dešimt milijonų N87-GFP ląstelės buvo po oda švirkščiamas į abi peles nugaros. Dėl platinamos pilvaplėvės vėžys pelės modelį, penkiasdešimt milijonų N87-GFP ląstelės su PBS (iš viso 300 pl) buvo švirkščiamas į pilvaplėvės ertmę.}

in vivo fluorescencija vaizdo

, in vivo
fluorescencijos vaizdai buvo gauti su Pearl Imager (Li-COR biologijos mokslų) aptikti IR700 /IR800 fluorescenciją, ir Maestro Imager (CRI, Woburn, MA, JAV) GFP. Dėl GFP, buvo naudojamas juostiniai filtras nuo 445 iki 490 nm (sužadinimo) ir ilgą perdavimą mėlynos filtro per 515 nm (emisijos). Derinamų emisijos filtras buvo automatiškai sustiprino 10 nm žingsniu nuo 500 iki 600 Nm, žalios spalvos filtras rinkinių pastoviu ekspozicijos (500 ms). Spektro fluorescencijos vaizdai susideda iš autofluorescenciją spektrų ir spektrų nuo GFP (N87-GFP naviko), kuris buvo tada nesumaišyti, remiantis būdingo spektro modelis GFP, naudojant Maestro programinę įrangą (CRI). Regionai objektai (Rois) buvo rankiniu būdu sudarytas arba ant šono naviko arba per pilvo srityje, atitinkamai nuo modelio ir fluorescencijos intensyvumas buvo matuojamas [19].

apibūdinimas platinamos peritoninės pelės modelio

Pelės su arba platinamos pilvaplėvės vėžys (bent 6 savaitėms po ląstelių implantavimo) arba šoninių navikų (bent 7 dienas po ląstelių implantavimo) buvo švirkščiamas į veną kartu su 100 mikrogramų tRA-IR700 ir tRA-IR800. Vieną dieną po injekcijos, serijos vaizdai buvo atliekamas su Pearl Imager aptikti IR700 /IR800 fluorescencija, o už GFP Maestro. Balta šviesa atvaizdai pelių buvo gauti su iphone5 (Apple Inc., Cupertino, Kalifornija, JAV).

in vivo GPM

Norint įvertinti GPM poveikį krašte modelį , N87-GFP naviko-guolis pelių buvo atsitiktiniu būdu į 4 grupes sudaro ne mažiau kaip 10 gyvūnų kiekvienoje grupėje taip: (1) jokio gydymo (kontrolės); (2) Tik NIR šviesos poveikio 50 J /cm, ^{2 1 ir 100 dienos J /cm, 2 ant 2 dieną; (3) 100 mikrogramų TRA-IR700 I. V., ne NIR šviesos poveikio; (4) 100 mikrogramų TRA-IR700 I. V., Nir šviesa buvo vartojama 50 J /cm 2 on 1 dieną po injekcijos ir 100 J /cm, 2 ant 2 dieną po injekcijos. Šios sąlygos buvo taikomas kas savaitę iki 3 savaičių. Pelių buvo stebima kasdien, ir buvo gauti fluorescencijos vaizdai pradedant 1 dieną prieš GPM, ir naviko apimtys buvo matuojamas tris kartus per savaitę, kol navikas skersmuo pasiekė 2 cm, po ko pelių buvo numarinti su anglies dioksido. Dėl fluorescencijos vaizdavimo, pelėms buvo sušvirkšta 100 mikrogramų TRA-IR700 arba apšvitintas taip: (1) NIR šviesa buvo vartojama 50 J /cm 2 on 1 dieną po injekcijos ir 100 J /cm, 2 dėl 2 dieną į dešinę naviko (2) ne NIR šviesos buvo skiriamas į kairę navikas, kuris tarnavo kaip kontrolės. Kontrolė įtrauktas (1) Tik NIR šviesos poveikiui 50 J /cm 2 on 1 dieną ir 100 J /cm, 2 ant 2 dieną į dešinę naviko; (2) ne gydymo kairėje naviko}

Jei įvertinti paskleistą pilvaplėvės vėžiu, pelėms buvo randomizuoti į 4 grupes po 5 gyvūnų skaičius grupėje šių būdų: (1). Gydymu (kontrolė); (2) Tik NIR šviesos poveikio 50 J /cm, ^{2 1 ir 100 dienos J /cm, 2 ant 2 dieną; (3) 100 mikrogramų TRA-IR700 I. V., ne NIR šviesos poveikio; (4) 100 mikrogramų TRA-IR700 IV, Nir šviesa buvo vartojama 50 J /cm 2 on 1 dieną ir 100 J /cm 2 d 2 diena po injekcijos.}

Statistinė analizė

duomenų išreiškiamos reiškia ± SEM iš keturių eksperimentų minimumo, nebent nurodyta kitaip. Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant statistikos programą (GraphPad Prizmė; GraphPad Programinė įranga, La Jolla, Kalifornija, JAV). Daugeliui lyginimų, buvo naudojamas vienpusis dispersinė analizė (ANOVA) su po bandomojo (Kruskal-Wallis testas su post-testas) ir Tukey testo. Kaupiamasis tikimybė išgyventi, nustatomas čia kaip naviko skersmuo nesugeba pasiekti 2 cm, buvo apskaičiuota, kiekvienoje grupėje su Kaplan-Meier išgyvenamumo kreivės analizę naudoti, o rezultatai buvo palyginti su log-rank testą ir Wilcoxon testą. Studento , T
bandymas taip pat buvo naudojamas palyginti du in vitro
tyrimą; p < 0,05 buvo laikomas rodo statistiškai reikšmingą skirtumą

Rezultatai

Patvirtinimas ekspresijos profilio N87-GFP ląstelių kaip už GPM

taikinį Mes išnagrinėjome fluorescencijos signalų. Pan-IR700 ir tRA-IR700 įpareigotas N87-GFP ląstelių FACS. Po 6 val inkubacijos su kuriuo visos-IR700 ar TRA-IR700, N87-GFP ląstelės nuolat rodė didesnį ryškumą su TRA-IR700 nei visos-IR700 (pav. 1A). Šie signalai buvo beveik visiškai blokavo pertekliaus trastuzumabu ar panitumumabo to, tai rodo, konkretus privalomas, ir patvirtindamos, didesnę raišką HER2 nei EGFR [21]. Šie duomenys rodo, kad HER2 buvo priimtinesnis taikiniu duobę N87-GFP ląstelių dėl savo aukštojo išraiška.

buvo atliekama mikroskopija in vitro GPM pervežimas

Serial fluorescencijos mikroskopija N87-GFP ląstelių prieš ir po duobę. Po sąlyčio su NIR šviesos (2 J /cm ^{2) korinio patinimas, pūslė formavimo ir plyšimo lizosomose nepastebėta, todėl į citoplazmą ekstruzijos extracellularly (pav. 1B). VšĮ dažymo parodė ūmų citotoksinis membranos žalą GPM. Dauguma šių korinio pokyčių nepastebėta per 30 min šviesos poveikio (pagalbinė informacija vaizdo S1 ir S2). Jokių reikšmingų pokyčių buvo aptikta EGFR ekspresija nepasireiškė 3T3 ląstelės švitintame NIR šviesos, o tai rodo GPM sukeltas jokios netikslinių ląstelių pažeidimas (pav. S1).}

įvertinimas in vitro GPM efektas

siekiant quantitate į in vitro pervežimas GPM poveikį, mes atliekame citotoksinio tyrimą remiantis steigimo PI, kuris parodė, kad ląstelių mirtis didėjo šviesos dozės (pav. 1c). Reikšmingo citotoksiškumo buvo aptiktas su NIR šviesos poveikis arba TRA-IR700 vieni.

Įvertinimas su GFP fluorescencijos in vitro po GPM

Vieną dieną po kontakto su NIR šviesos 0,5 J /cm, ^{2, maždaug 50% ląstelių parodė ūmų toksiškumą (1c pav.), o GFP fluorescencijos intensyvumas buvo labai sumažintas negyvų ląstelių (tamsintas teigiami PI), o GFP fluorescencija buvo išsaugotas gyvas ląsteles (pav. 1d). Šie tyrimai rodo, kad GFP buvo išstumiamas iš ląstelės po membranos plyšimo. Siekiant ištirti į GFP fluorescencijos pokyčius, mes palyginti bendrą GFP taškų toje pačioje srityje prieš ir vieną dieną po to, kai GPM (Pav. S2). GFP fluorescencijos santykis tiesiogiai mažėjo šviesos dozę, o ne mažėja buvo aptiktas su NIR šviesos poveikio ar TRA-IR700 vien (. 1E pav). Šie rezultatai buvo patvirtinta FACS analizė (pav. 1F ir pav. S3) ir rodo, kad PIT veda prie GFP fluorescencijos sumažėjimą po nekrozinio ląstelių mirtis Po 1 dienos po to, kai GPM tokiu būdu, priklauso nuo šviesos dozė.}

in vivo GPM mažina naviko tūrį šono ksenografiniuose modelio

Be to, mes išnagrinėjo GPM vivo, pervežimas poveikį šono naviko guolio pelėms (. 2A pav). GPM sukeltas gerokai sumažinti naviko apimtį (n = 10 kiekvienoje grupėje, * p = 0,0456 < 0,05, Tukey testas). Keturi pelės iš dešimties GPM grupės buvo visiškai išgydyti gydymo (2b pav.). Išgyvenimo buvo reikšmingai pailgino į duobę grupėje, palyginti su kontroline grupe (n = 10 kiekvienoje grupėje, ** p < 0,0001, ilgai rank testas ir Vilkoksono testas) (pav 2C.). Šie duomenys rodo, kad GPM sukėlė didelį naviko mažinimą ir ilgesnį išlikimą vivo
.

GFP Fluorescencinis vaizdavimo po in vivo duobę šono ksenografiniuose modelio

Kad būtų galima stebėti in vivo
GPM, realaus laiko GFP vaizdo buvo atliktas su pelėmis N87-GFP dvišalis šoninių navikų (pav. 3a). GFP fluorescencija parodė naviko ir reagavimas į duobę. GFP fluorescencija buvo susietas su IR700 fluorescencija, kuris greitai sumažėjo po GPM (Pav. 3C). Iš viso fluorescencija tomografijos (NPD) nuo GFP į neapdorotų navikai (kontrolės) ir navikų gaunančių šviesą padidėjo tik dėl naviko augimą. Be navikų GPM, NPD nuo GFP

kiekybinis bendras palaipsniui mažėjo apdorotame naviko, o priešais auglys toje pačioje pele (IV, tai ne šviesos) parodė padidėjusį GFP fluorescenciją (3b pav.). GFP fluorescencija intensyvumas parodė, kad ten buvo po to, kai GPM žymiai sumažėjo (n = 5 pelių kiekvienoje grupėje, * p = 0.0118 < 0,05, ** p = 0.0010 < 0,01, *** p = 0,0049 < 0,01, Tukey testas su ANOVA) (pav. 3C). Dėl auglio naujo augimo, GFP santykis vėl padidėjo nuo 4 dieną po GPM, nors jis buvo mažesnis nei kitų kontrolinių grupių. Realaus laiko GFP fluorescencijos vaizdas ir jo kiekybinis įjungtas realaus laiko palyginimą grupių ir parodė tvirtą ryšį tarp aukštojo GFP fluorescencijos ir naviko progresavimas kiekvienoje grupėje.

Norėdami patvirtinti šį poveikį ex vivo
analizė buvo atlikta (4a pav.). GPM poveikis buvo patvirtintas su į IR700 fluorescencijos (4B pav.) Sumažėjimu. Pagal šią sąlygą, GFP intensyvumas ex vivo
navikų sumažėjo po GPM (Pav. 4B). Šie duomenys rodo, kad realaus laiko GFP gyva vaizdo suderinamas su ex vivo
vaizdo.

GPM buvo pakartotas per savaitę, GFP fluorescencija veikla ilgainiui išnyko (4C pav ir D.), Nurodant pilnas žmogžudystė naviko.

apibūdinimas platinama peritoninės modelį su fluorescencijos vaizdinimo

siekiant nustatyti gamtos istoriją platinamos peritoninės modelis, Serijos fluorescencija vaizdo buvo atliktas. Implantuotam navikai parodė aukštą fluorescencijos signalą su IR700, IR800, ir GFP, kurie visi bendrai lokalizuota viena su kita (IR800 buvo naudojamas, kad būtų išvengta žarnyno autofluorescencija) (5 pav.). Šie duomenys rodo, kad ši platinamos pilvaplėvės vėžiu modelis gali būti stebimas gyvų pelių naudojant GFP fluorescenciją.

GFP Fluorescenciniai vaizdus po in vivo duobę platinamos peritoninės modelio

Realaus laiko GFP fluorescencija vaizdo buvo atliekama platinamos peritoninės modelį prieš ir po GPM (. 6A pav). IR700 fluorescencija sumažėjo po GPM (Pav. S4). GFP NPD palaipsniui išaugo ne karjeras grupių dėl naviko augimą. Į duobę gydytų pacientų grupėje, GFP NPD sumažėjo nuo 1 dienos iki 3 dieną po GPM (Pav. 6B). Kiekybinis viso GFP fluorescencijos intensyvumas atskleidė žymiai sumažėjo po to, kai GPM (n = 5 pelių kiekvienoje grupėje, * p = 0,0295 < 0,05, ** p = 0,0355 < 0,05, Kruskal-Wallis testas su po bandymo) (pav. 6C). Dėl to, kad auglio naujo augimo, GFP santykis vėl padidėjo nuo 4-tą dieną po to, kai GPM, nors ir palaikoma mažesnė nei kitų grupių, kai jis buvo stebimas krašte naviko modelį. Taigi, GPM sukėlė didelę tikslinę auglį žudyti poveikį tiek krašto ir skleidžiama pilvaplėvės navikų modelių ir tai gali būti stebimas su GFP TFI.

Diskusijos

Šis tyrimas rodo, kad GPM poveikis gali būti stebima GFP fluorescencijos vaizdų. Skirtingai nuo apoptozės [12], [13], kurioje GFP ir susiję fluorescencinės baltymai pašviesės dėl mažėjančio citoplazmos tūris, per nekrotinio ląstelių žūtį su GPM, membrana žala veda išleisti iš citoplazmos turinį, įskaitant GFP. Ši unikali savybė GFP ir susijusių fluorescencinės baltymų daro juos naudingų biologinių žymeklių už GPM.

, in vivo
GFP fluorescencija vaizdo leidžia visą procesą Tumorigenesis, gydymo, regresija, metastazių, arba pasikartos, kad galima aptikti tam pačiam gyvūnui be invazinių procedūrų [10], [11]. Pasitelkus ląsteles, reikšti citoplazmos GFP, priešvėžiniai poveikis sukeltų GPM galima lengvai stebėti dėl ekstruzijos būdu GFP iš apdorotų ląstelių.

naudojant kryptingą šviesos terapija samprata yra daugiau nei trijų dešimtmečių senumo [22]. Dėl tradicinių fotodinaminė terapija (PDT) jautrumą hidrofobiškumo antikūnų konjuguoto PDT agentų farmakokinetika yra labai ribota jos gebėjimo sukurti konjugatų į tikslą. Todėl, PDT sensibilizatorių, nukreipiami pagal antikūnų tik sėkmingai modelių, kurių konjugatas buvo suleista tiesiai į naviko ląstelės arba pilvaplėvės [23]. Norint pasiekti antikūno-fotosensibilizatoriaus konjugatą (APSC) buvo sistemingai, fotosensibilizatorius turėtų būti teikiama pirmenybė hidrofilinis. Hidrofilinė ftalocianino pagrindu fotosensibilizatorius, IR700DX, kai, konjuguoto su antikūno tampa APC, kad gali būti skiriamas į veną. Šis gydymo forma, vadinama GPM, skiriasi nuo tradicinio fotodinaminės terapijos ne tik atsižvelgiant į fotosensibilizatoriaus hidrofiliškumą, bet taip pat ir jo priklausomybė nuo NIR šviesos aktyvuotų fotosensibilizatoriaus. NIR šviesa turi geriau audinių prasiskverbimą negu žemesnio bangų šviesos naudojamas PDT. Tai naujos kartos APCs rodo panašius į veną farmakokinetikai nuogų antikūnų, todėl labai tikslingai naviko kaupimo su minimaliomis netikslinių privalomas ir gali būti taikomas plataus spektro antikūnų, todėl daug potencialių paraiškų visame organizme.

Nors citotoksinis chemoterapinis, už pažengęs skrandžio vėžio rezultatas išlieka prasta. Nes, pacientų peritoninės metastazių dabartinių su klastingas simptomų, tokių kaip prasta apetito praradimas, svorio netekimas, pilvo pūtimas pojūtis, skausmas ar anemija diagnozė dažnai vėluoja ir vietos gydymo dalis yra nebeįmanoma [24]. GPM yra perspektyvus metodas gydant paskleistą pilvaplėvės vėžiu. Kad būtų galima atlikti veiksmingą GPM, APSC turėtų būti įvedamas sisteminiai ir šviesa turi būti selektyviai taikoma pilvaplėvės. Tokiomis sąlygomis yra pakankamai pristatymas APSCs sukelti mažinimo platinami navikų po duobę. Šis procesas gali būti kontroliuojamas su realiu laiku, in vivo
GFP fluorescencija vaizdo.

Yra keletas apribojimų šiame tyrime. Reikia pažymėti, kad ne visi skrandžio vėžio išreikšti HER2 ir todėl, TRA-IR700 gali būti ne vienodai veiksmingas skleidžiamos skrandžio vėžio. Iš tiesų, gali būti būtina naudoti iš APSCs kokteilio veiksmingai apima daugumą ekspresijos profilius tam tikroje naviko [25]. Kitą šiame tyrime apribojimas yra tai, kad šviesos gali būti skiriamas transcutaneously mažais pelių bet tai nėra įmanoma žmonėms. Tam, kad veiksmingai gydyti žmones su GPM, ji bus būtina taikyti šviesą laparoskopiškai, kad būtų išvengta absorbciją per odą. Kitas apribojimas yra tai, kad mūsų modelis buvo įvertintas tik imuninės sistemos pelių. Imunologinis reakcija GPM bus įvertintas ir ateityje imuniteto pelių. Pagaliau, artimiausioje terminas GFP fluorescencijos vaizdavimo bus ribojamas gyvūnų tyrimų, nes ji reikalauja transfekciją naviko su endogeninio baltymo. Nepaisant to, tai naudinga Skaitliuko parodymai dėl ikiklinikinių tyrimų.

Išvados

GPM yra veiksmingas prieš HER2 teigiamas skrandžio vėžio peritoninės karcinomatoze modelyje su pele ir GFP fluorescencijos vaizdavimo leidžia stebėti GPM poveikio.

Pagalbinė informacija
S1 paveiksle.
Speciali tikslinė nekrozės ląstelių mirtis buvo pastebėtas po GPM , in vitro.
N87-GFP ląstelės buvo bendrai kultūringas su 3T3 /DsRed (ne JOS išreiškiančius) ląsteles. Jie buvo gydomi TRA-IR700 ir stebimas (prieš ir po to, kai švitinimo NIR šviesos). Tikslinės specifinis nekrozės ląstelių mirtis buvo stebimas nuo sužadinimo su NIR šviesos (po 30 min). Nėra žala buvo įrodytas 3T3 /DsRed ląsteles. . * 3T3 /DsRed ląstelės, Baras = 25 mkm
Doi: 10,1371 /journal.pone.0113276.s001
(TIFF)
S2 pav. buvo pastebėta
menkinimas GFP-fluorescencijos ne 1 diena po GPM , in vitro.
Mažėjantis GFP-fluorescencijos intensyvumą 1 dieną po GPM buvo pastebėta, kad tokiu būdu priklauso nuo šviesos dozę. Baras = 100 mkm. Juoda linija ties briauna buvo žymeklis nustatyti stebėjimo poziciją
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0113276.s002
(TIFF)
S3 pav.
sumažėjimas GFP-fluorescencijos po 1 dienos po GPM įvertino tėkmės citometrijos metodą. Mažėja GFP-fluorescencijos intensyvumą 1 dieną po GPM buvo taip, priklauso nuo šviesos dozę tėkmės citometrijos analizės
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0113276.s003
(TIFF)
S4 pav.
, in vivo
fluorescencija vaizdo reaguodama į pakartotinius duobę pilvaplėvės platinama pelėmis modelį. , in vivo
fluorescencija vaizdo reaguodama į pakartotinius GPM. IR700 fluorescencija buvo sumažėjęs atsakas į GPM
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0113276.s004
(TIFF)
Vaizdo S1.
Laiko tarpas DIC vaizdai yra N87-GFP ląstelių gydomi duobę. Laiko tarpas eilės DIC vaizdai (video), kurių N87-GFP ląstelės rodo morfologinius pokyčius ląstelėje po NIR šviesos apšvitinimo ląstelių gydomiems TRA-IR700 (25 min stebėjimo iš viso). Mirksinti šviesa NIR šviesa švitinti (2 J /cm, ^{2)
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0113276.s005
(AVI)
Vaizdo S2.
Laiko tarpas VšĮ fluorescencijos vaizdai yra N87-GFP ląstelių gydomi GPM. Laiko tarpas eilės VšĮ fluorescencijos vaizdai (Video) rodo spartų membranos žalą tam N87-GFP ląstelės po NIR šviesos spinduliavimo ląstelėse gydomiems TRA-IR700 (25 min stebėjimo iš viso). Mirksinti šviesa NIR šviesa švitinti (2 J /cm, 2)
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0113276.s006
(AVI)}

Padėka

Šis tyrimas parėmė vidines tyrimų programa National Institutes of Health, nacionalinio vėžio instituto, centro vėžio tyrimų. Kazuhide Sato palaiko su JSP tyrimų stipendija už Japonijos biomedicininių ir elgesio mokslininkai NIH.

• PLoS ONE: MED30 Reguliuoja platinimu ir judrumas skrandžio vėžio Cells
• PLoS One: Lyginamoji Proteomika analizė Skrandžio vėžio kamieninių Cells